专利名称：检测常见食品过敏原特异性引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多重PCR快速检测的方法及其应用，尤其涉及一种可同时用于检测芹菜、鱼、大豆、杏仁四种常见食品过敏原的PCR技术及其所用PCR引物的序列。
背景技术：
食物过敏(food allergy)也称为食物变态反应(food allergy)或消化系统变态反应(allergic reaction of digestive system)、过敏性胃肠炎等,是由于某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。发病机制致敏抗原激活肠固有膜的IgE浆细胞产生大量的IgE抗体，并与肥大细胞结合，固定在这些细胞的表面。当食物中的致敏原再次进入体内与胃肠黏膜肥大细胞表面的IgE相结合，使肥大细胞激活脱颗粒释放一系列参与过敏反应的炎症介质，使血管通透性增加，引起I型变态反应部分抗原物质也可选择性地与浆细胞IgG、IgM、IgA或T细胞结合，形成免疫复合物，从而引起局部或(和)全身性的III型或IV型变态反应。食物的种类成千上万，其中只有一部分容易引起过敏。同族的食物常具有类似的致敏性，尤以植物性食品更为明显，如对花生过敏的患者对其它豆科类植物也会有不同程度的过敏。各国家、各地区的饮食习惯不同，机体对食物的适应性也就有相应的差异，因而致敏的食物也不同，比如西方人认为羊肉极少引起过敏，但在中国羊肉比猪肉的致敏性高；西方人对巧克力、草莓、无花果等过敏较多，在中国则极少见到。根据西方的资料，易引起过敏的食物为牛奶、鸡蛋、巧克力、小麦、玉米、坚果类、花生、橘子、柠檬、草莓、洋葱、猪肉，某些海产及鱼类，蛤蛘、火鸡及鸡等。在中国容易引起过敏的食物有以下几类
⑴富含蛋白质的食物如牛奶、鸡蛋；
(2)海产类如鱼、虾、蟹、海贝、海带；` (3)有特殊气味的食物如洋葱、蒜、葱、韭菜、香菜、羊肉；
⑷有刺激性的食物如辣椒、胡椒、酒、芥末、姜；
(5)某些生食的食物如生番茄、生花生、生栗子、生核桃、桃、葡萄、柿子等；
(6)某些富含细菌的食物如死的鱼、虾、蟹，不新鲜的肉类；
(7)某些含有真菌的食物如蘑菇、酒糟、米醋；
(8)富含蛋白质而不易消化的食物如蛤蛘类、鱿鱼、乌贼；
(9)种子类食物如各种豆类、花生、芝麻；
CO) 一些外来而不常吃的食物等等。当前食物过敏原检测方法主要有免疫学法和核酸扩增法，然而无论ELISA方法还是核酸检测方法，通常只能同时检测I种过敏原，而在实际食品检测中，需要对过敏原进行筛查检测，即对多种过敏原进行同时检测。
发明内容
本发明中以DNA为检测目标，选取4种食物样品，建立多重PCR方法同时检测4种常见食物过敏原的技术并建立了相应的多重PCR检测试剂盒，为快速检测与鉴定常见致病菌提供有效的手段。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容
一种用于检测食品过敏原的特异性PCR引物，其特征在于所述的特异性引物如SEQ IDNOil-SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。本发明所述的特异性引物，其中的特异性引物为(I)芹菜的MTD基因、(2)鱼的线粒体16S、(3)大豆的Lectin基因、(4)杏仁的Pru dul基因。特异性引物序列为
SEQ NO:1 TTTGATCCACCGACTTACAGCC 芹菜 MTD 基因的上游引物；
SEQ NO: 2 ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATCAC 芹菜 MTD 基因的下游引物；
SEQ NO:3 ATAACAGCGCAATCCTCTCCC 鱼线粒体 16S 的上游引物；
SEQ NO:4 GCTGCACCATTAGGATGTCCT 鱼线粒体 16S 的下游引物；
SEQ NO: 5 ACCTTGGT ACTGGTGCTAC 大豆 Lectin 基因的上游引物；
SEQ NO:6 ACCTTGGCTACTTTATTGTT 大豆 Lectin 基因的下游引物；
SEQ NO:7 TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 杏仁 Pru dul 基因的上游引物；
SEQ NO:8 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 杏仁 Pru dul 基因的下游引物。本发明进一步公开了一种特异性PCR引物的试剂盒，它是由10XPCR酶特异性反应缓冲液、MgCl2, dNTP、PCR引物、DNA聚合酶组成。其中所述的PCR引物优选为如SEQ IDNOil-SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。主要成分如下
1)IOmM dNTP50 μ I ；
2)IOX酶特异性反应缓冲液300 μ I ;
3)25mMMgCl2300 μ I ；
4)5 U/ul Taq 聚合酶5μ I ;
5)5 uM上游弓I物混合物80 μ I ;
6)5uM下游引物混合物80 μ I ;
7)ddH205ml;
所述的引物混合物指的是SEQ ID NO:1- 8所示的核苷酸序列均以等体积1:1的形式混合。所用引物的序列包含以下序列中选取的一种或多种
上述的引物序列可用于制备检测食物过敏原PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。所述过敏原食物购于天津开发区菜市场。本发明还提供一种多重PCR试剂盒，包括10XPCR酶特异性反应缓冲液、MgCl2,dNTP、PCR引物、DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸序列；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID NOil-SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。SEQ NO:1 TTTGATCCACCGACTTACAGCC 芹菜 MTD 基因的上游引物；
SEQ NO: 2 ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATCAC 芹菜 MTD 基因的下游引物；
SEQ NO:3 ATAACAGCGCAATCCTCTCCC 鱼线粒体 16s 的上游引物；
SEQ NO:4 GCTGCACCATTAGGATGTCCT 鱼线粒体 16s 的下游引物；
SEQ NO: 5 ACCTTGGTACTGGTGCTAC 大豆 Lectin 基因的上游引物；SEQ NO:6 ACCTTGGCTACTTTATTGTT 大豆 Lectin 基因的下游引物；
SEQ NO:7 TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 杏仁 Pru dul 基因的上游引物；
SEQ NO:8 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 杏仁 Pru dul 基因的下游引物；
上述多重PCR检测试剂盒可以包括如下试剂10 mM dNTP 20 μ I ；10Χ酶特异性反应缓冲液50 μ I ;5 U/μ I耐热DNA聚合酶8 μ I ；SEQ ID NO: 1-8弓丨物各10 μ I (引物浓度都一样，按等体积混合)；阴性对照品10 μ I ；ddH20 5ml。上述针对食物过敏原PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。本发明中所用的核苷酸序列还可用于芯片的研制，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸。由上述的技术方案可见，本发明建立的一种多重PCR反应体系，可同时检测4种食物过敏原，该试剂盒有如下优点
(I)方法简便，周期短、速度快、可操作性强本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低，市场应用前景广。(2)检测成本相对较低可以推广应用于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域，并为其他不同过敏原检测组合提供技术模式。(3)准确性高本发明根据芹菜MTD基因，鱼的线粒体16S、大豆的Lectin基因、杏仁的Pru dul基因设计出引物。 继而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将这四种食物过敏原检测出来。
图1为本发明的试剂盒检测结果图，其中M为DL2000 DNA marker ;N为阴性对照品；1为过敏原鱼；2为过敏原杏仁；3为过敏原芹菜；4为过敏原大豆；
图2为本发明试剂盒检测其他食品电泳结果图，其中1为小麦；2为花生；3为芝麻；4为鸡；M, DL2000 DNA marker。
具体实施例方式 为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，结合具体实例对本发明作进一步详细描述。实施例1 :基因组的提取1.植物及动物组织基因组的提取(使用宝生物公司TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver. 4. 0 )
①取2 30mg的动物组织或25 IOOmg植物组织,置于2 mltube中，用剪刀尽可能地剪成碎块，对于一些质地坚硬的组织也可以进行液氮研磨。②加入180 μ I 的 Buffer GL>20 μ I 的 Proteinase K 和 10 μ I 的 RNase A 10mg/ml)，于56°C水浴温浴至组织完全裂解(2 3小时，难裂解的材料可以适当延长裂解时间甚至过夜裂解，植物材料可能残存纤维状组织无法完全裂解，不影响DNA提取)。注)温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。③向裂解液中加入200 μ I Buffer GB，充分吸打混匀。④溶液移至Spin Column中，12，000 rpm离心2分钟，弃滤液。⑤将500 μ I 的 Buffer WA 加入至 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 I 分钟弃滤液。⑥将500 μ I 的 Buffer WB 加入至 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 I 分钟弃滤液。注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。⑦重复操作步骤4。⑧将Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12，OOOrpm 离心 2 分钟。⑨将Spin Column安置于新的1. 5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加Λ 50 200 μ I的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟。注)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65°C使用时有利于提高洗脱效率。⑩12，OOOrpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin Column膜的中央或再加入50 200 μ I的灭菌水或Elution Buffer,室温静置5分钟后，12，OOOrpm离心2分钟洗脱DNA。提取得到的基因组可以通过电泳或吸光度测定以定量。2.农作物及加工品基因组的提取
(宝生物工程公司 DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver. 2. O )
①首先将2XWash Solution用等体积的100%乙醇稀释成IXWash Solution。
②把0. 5g左右磨碎的作物样品放入适当的(15ml) Tube中，加入Pretreatment Buffer1. 75 ml 和 5 M Guanidinium Hydrochloride Solution 200 μ I,振荡混勻后，再加入Proteinase K 50 μ I。上下倒转混勻后58°C保温I小时，中途每隔10分钟左右请倒转混合数次。
③室温下8,000rpm离心5分钟，吸取上清500 μ I放入1.5 ml的Microtube中。注意不要吸取液面上部的不溶物。
④将装有500μ I上清的1.5ml Microtube室温下14，OOOrpm离心10分钟,取上清 300 μ I 放入 2ml Microtube 中。
⑤加入100μ I的Solution I，震荡混匀后，再加入200 μ I的0.2% SDS以及I ml的Silica Gel Solution,倒转轻轻混合5 6分钟。注意Silica Gel Solution使用前要充分混匀。
⑥室温下12,000rpm离心30秒，除去溶液。
⑦加入300μ I的IXWash Solution，充分混匀后，室温下12,000 rpm离心30
秒，
除去溶液。
此操作再重复两次，但最后一次离心时间应为3分钟。
⑧向沉淀中加入100μ I的70°C TE Buffer，用移液器混匀，室温静置5分钟。
⑨室温下14,000rpm离心3分钟,取溶液。
实施例2 :引物的设计
根据从NCBI上下载的序列以及参考文献，针对食品过敏原特异基因设计引物，引物序列如下表I所示
权利要求
1.用于检测食品过敏原的特异性PCR引物，其特征在于所述的特异性引物如SEQIDNOil-SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的特异性引物，其中的特异性引物为(I)芹菜的MTD基因、(2)鱼的线粒体16S、(3)大豆的Lectin基因、(4)杏仁的Pru dul基因。
3.权利要求1或2所述的特异性PCR引物，其中的特异性引物为 SEQ NO:1 TTTGATCCACCGACTTACAGCC 芹菜 MTD 基因的上游引物； SEQ NO: 2 ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATCAC 芹菜 MTD 基因的下游引物； SEQ NO:3 ATAACAGCGCAATCCTCTCCC 鱼线粒体 16S 的上游引物； SEQ NO:4 GCTGCACCATTAGGATGTCCT 鱼线粒体 16S 的下游引物； SEQ NO: 5 ACCTTGGTACTGGTGCTAC 大豆 Lectin 基因的上游引物； SEQ NO:6 ACCTTGGCTACTTTATTGTT 大豆 Lectin 基因的下游引物； SEQ NO:7 TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 杏仁 Pru dul 基因的上游引物； SEQ NO:8 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 杏仁 Pru dul 基因的下游引物。
4.一种含有权利要求1所述特异性PCR引物的试剂盒，其特征在于它是由10XPCR酶特异性反应缓冲液、MgCl2' dNTP、PCR引物、DNA聚合酶组成；所述PCR引物如SEQ IDNOil-SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。
5.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于它是由下述试剂组成 1)IOmM dNTP50 μ I ； 2)IOX酶特异性反应缓冲液300 μ I ; 3)25mMMgCl2300 μ I ； 4)5 U/ul Taq 聚合酶5μ I ; 5)5 uM上游弓I物混合物80 μ I ; 6)5uM下游引物混合物80 μ I ; 7)ddH205ml; 所述的引物混合物指的是SEQ ID NO:1- 8所示的核苷酸序列均以等体积1:1的形式混合。
全文摘要
本发明涉及一种检测常见食品过敏原特异性引物及试剂盒,用于检测食品过敏原的特异性PCR引物及采用多重PCR试剂盒快速检测的方法及应用。其中的试剂盒包括10×PCR反应液、MgCl2、dNTP、引物、DNA聚合酶，所用的引物包含以下特异核苷酸序列(1)芹菜的MTD基因、(2)鱼的线粒体16S、(3)大豆的Lectin基因、(4)杏仁的Prudul基因。本发明对常见食品过敏原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快、准确性高，可操作性强，降低检测成本，易于产业化生产。
文档编号C12Q1/68GK103060461SQ20131001873
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者王磊, 曹勃阳, 刘向前, 陈敏, 冯露 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司