专利名称：一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法
技术领域：
本发明属于细胞培养工程技术领域，涉及一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法。
背景技术：
前体脂肪细胞是脂肪细胞的一种，由多能干细胞(mult1-potential stem cell, MSC)或胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化而来,细胞体积小,呈梭形，间质少，胞浆内不含脂滴，但具有向胞浆内聚集脂滴的能力，在体内和体外都可以分裂增殖，并在胞浆内聚集脂滴而分化为成熟的脂肪细胞。目前，培养成功的前体脂肪细胞主要来源于人、鼠和猪，近年来，国内一些实验室也陆续对山羊前体脂肪细胞展开了研究，现在所用的培养方法主要有组织块培养法和消化培养法；组织块培养法需要时间长人力多，细胞大约在1(Γ12 天达到单层融合；消化培养法较组织块培养法所需时间缩短，细胞生长融合时间也需71 天，且细胞在多次传代后出现老化，增殖减慢至死亡现象。因此，提供一种简单高效，节省时间，维持细胞活力的山羊前体脂肪细胞体外培养方法很有应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种简单高效，节省时间，维持细胞活力的山羊前体脂肪细胞体外培养方法，对现有的消化培养方法进行改良， 使细胞消化和原代细胞贴壁数目增多；通过改良培养液的组成，使细胞衰老死亡现象明显减弱。
为了实现上述目的，本发明基于传统消化培养方法，选取山羊前体肋间脂肪组织， 利用改良过的胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培养液对山羊前体脂肪细胞进行体外培养，获得山羊前体脂肪细胞；其具体工艺步骤为
(I)、胶原酶I培养基的制备将IOOmg胶原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青链霉素溶液(PS)溶解于50mlHBSS溶液中，调节其溶液的PH值为7. 2 7. 4，经过O. 22微米过滤器过滤和分装，配制成重量百分比浓度为O. 2%的胶原酶I培养基，在_20°C温度条件下保存备用；
(2)、细胞培养液的制备在DMEM低糖培养液中添加其体积15%的胎牛血清、2%的非必需氨基酸(NEAA)、1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素溶液(PS)和20ng/ml的小鼠表皮生长因子(EGF)，经O. 22微米过滤器过滤和分装后，配制成细胞培养液，在4°C温度条件下保存备用；
(3)、脂肪组织的取样与前处理将山羊从颈部放血并处死后，在无菌条件下取出山羊前体肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入含重量百分比浓度为1%青链霉素溶液(PS)的灭菌PBS缓冲液中并置入无菌室，用无菌PBS漂`洗3 5次，并用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，得到脂肪组织样品；
(4)、山羊前体脂肪细胞的分离与体外培养用无菌眼科剪将已处理过的脂肪组织样品快速地剪切成O. 5^1mm3小块，移入15ml离心管中，再加入2_3倍脂肪组织样品体积的O.2%的胶原酶I培养基混合均匀，在37°C恒温摇床中消化75-85min，其间每IOmin振荡I 次，加入等体积细胞培养液终止消化；然后分别用80目、150目和300目不锈钢细胞筛过滤去除未消化的组织块及大体积的脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管，在2000r/ min转速条件下离心6-10min ;除去离心后的上清液后加入细胞培养液清洗I次，在2000r/ min转速条件下离心5min后制成细胞悬液并在显微镜下计数，以5X 104cells/mL接种细胞至60mm培养皿，置入温度为37°C、饱和湿度、体积比为5%的CO2的培养箱中培养，每2天更换一次培养液，实现山羊前体脂肪细胞的体外培养。
本发明与现有技术相比，建立了山羊前体脂肪细胞体外培养的新模型，缩短细胞生长时间，获得的细胞形态好，细胞生长活力强，可完整的认识脂肪组织产生和增生的全过程，并可直接观察各种因素对过程的调控，是研究脂肪分化、脂肪生成、代谢以和肥胖等各种疾病发生机理的必备工具；其总体工艺简单，原理可靠，培养过程易控，培养效果好，环境友好。
图1为本发明培养的山羊前体脂肪细胞示意图，其中，图a为培养I天后的山羊前体脂肪细胞，图b为培养3天后的山羊前体脂肪细胞，图c为培养5天后的山羊前体脂肪细胞，从图中可明显看出所培养的山羊前体脂肪细胞贴壁数量大，增殖速度快。
图2为本发明培养的山羊前体脂肪细胞增殖活性曲线图。
图3为本发明培养的山羊前体脂肪细胞经红油O染色后的脂肪滴示意图片。
具体实施例方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1 :
本实施例基于传统消化培养方法，取用山羊肋间脂肪组织，利用改良过的胶原酶I 培养基处理脂肪组织，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培养液对山羊前体脂肪细胞进行体外培养，获得山羊前体脂肪细胞；其具体工艺步骤为
(I)、胶原酶I培养基的制备将IOOmg胶原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青链霉素溶液(PS)溶解于50mlHBSS溶液中，调节PH值至7. 2 7. 4，经过O. 22微米过滤器过滤和分装，配制成重量百分比为O. 2%的胶原酶I培养基，在_20°C温度条件下保存备用；
(2)、细胞培养液的制备在DMEM低糖培养液中添加其体积15%的胎牛血清、 2%NEAA、1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素溶液(PS)和20ng/mlEGF，经O. 22微米过滤器过滤和分装后，配制成细胞培养液，在4°C温度条件下保存备用；
(3)、脂肪组织的取样与前处理将山羊颈部放血处死后，在无菌条件下取出山羊肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡数秒，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入含重量百分比浓度为1%双抗的灭菌PBS缓冲液中后带入无菌室，用新的无菌PBS漂洗3 5次， 并用眼 科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，得到脂肪组织样品；
(4)、山羊前体脂肪细胞的分离与体外培养用无菌眼科剪将已处理过的脂肪组织样品快速地剪切成O. 5^1mm3小块，移入15ml离心管中，再加入2_3倍脂肪组织样品体积的O.2%胶原酶I培养基混合均匀，在37°C恒温摇床中消化80min，其间每IOmin振荡I次，加入等体积细胞培养液终止消化；然后用80目、150目和300目不锈钢细胞筛过滤去除未消化的组织块及大体积的脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管，在2000r/min转速条件下离心Smin ;除去离心后的上清液后加入细胞培养液清洗I次，在2000r/min转速条件下离心5min后制成细胞悬液并在显微镜下计数，以5 X 104cells/mL接种细胞至60mm培养皿，置入温度为37°C、饱和湿度、体积比为5% CO2的培养箱中培养，每2天更换一次培养液，得到原代培养前体脂肪细胞，实现山羊前体脂肪细胞的体外培养。
本实施例经胶原酶消化后的原代培养前体脂肪细胞呈球形悬浮在培养液中，培养 24h后大量细胞贴壁，形状为椭圆形、细长型或梭形；培养3天贴壁细胞体积变大，大部分为长梭形或不规整三角形，呈现纤维状结构；之后细胞增殖迅速，密度明显变大，至培养五天时细胞达到单层融合。
本实施例采用CCK法检测山羊传代培养前体脂肪细胞增殖活性，分别选取Pl代、 PlO代和P20代细胞进行检测，以1000个/孔的密度将细胞接种于96孔培养板，每孔加入 200 μ I细胞培养液后置于CO2培养箱培养，设置3个重复,每隔2天换液一次,在培养后第2、4、6、8、10和12天分别取一块培养板加入20 μ ICCK溶液，在37°C条件下继续培养4h后选择酶标仪波长490nm处测各孔吸光值，利用CCK法绘制山羊前体脂肪细胞生长曲线(如图2所示)绘制的山羊前体脂肪细胞生长曲线为S型，符合体外培养细胞的正常生长增殖规律，40h后进入缓慢的潜伏生长期，4-10天后进入指数生长期；传代培养前体脂肪细胞与原代培养前体脂肪细胞形态特征基本一致，细胞成分更均一，形态更一致，生长更旺盛，抗污染能力变强，后期增殖活性高，随着传代次数增多细胞增殖活性维持不变 。
本实施例采用油红O染色法检测山羊前体脂肪细胞的分化，先在DMEM低糖培养液中添加5g/L牛血清白蛋白(BSA)UOygAiL牛胰岛素、O. 5mM/L3_异丁基-1-甲基黄嘌呤 (ΙΒΜΧ)、1 μ M地塞米松(DEX)和IM吲哚美辛混合均匀后调节PH值至7. 2-7. 4，经O. 22微米滤器过滤和分装后得到诱导分化培养液4°C条件下保存备用，山羊前体脂肪细胞生长至汇合状态后在诱导分化培养液中进行诱导分化培养；诱导分化第2天细胞胞质内开始有小脂滴出现，第6天时，细胞胞质内小脂滴明显增多，有少数开始融合成大脂滴；诱导分化后的脂肪细胞培养12天后采用油红O染色法鉴定脂肪细胞，除去培养液，用PBS洗细胞2次后用重量百分比浓度为10%的多聚甲醛固定15min，再用PBS洗2次，油红O染色20min后再用PBS洗2次，晾干后用甘油明胶封固观察拍照，如图3所示，得到的脂肪滴多。
本实施例涉及的DMEM低糖培养液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青链霉素溶液 (PS)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰氨、HBSS购自HyClone公司；牛血清白蛋白(BSA)、 I型胶原酶、胰岛素(INS)，地塞米松(DEX)，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛 (IDM)、小鼠表皮生长因子(EGF)、油红O购自sigma公司；cck_8试剂盒购自碧云天公司。
实施例2
本实施例在待原代培养的山羊前体脂肪细胞达到80°/Γ90%汇合时，每板细胞中加入300 μ L胰蛋白酶消化液在37°C消化3min，该胰蛋白酶消化液制备方法如下将O. 25g胰蛋白酶与IOOml的PBS缓冲液相混合配成O. 25%胰蛋白酶消化液；加入与胰蛋白酶消化液相同体积的细胞培养液终止消化，2000r/min离心5min得沉淀，将此沉淀与细胞培养液按照1:3的体积比进行传代，接种培养于60mm培养皿中，在此培养过程中每2天更换一次细胞培养液；上述培养直至细胞汇合到80°/Γ90%时并铺满整个培养皿时，重复上述消化步骤； 依次向下传代直至传代接种培养至第20代。
实施例3:
本实施例用油红O染色法检测山羊前体脂肪细胞分化，在山羊前体脂肪细胞生长至100%汇合状态后更换为诱导分化培养液进行诱导分化培养；诱导分化培养液制备方法为在DMEM低糖培养液中添加其体积O. 5 %牛血清白蛋白(BSA)、10%胎牛血清(FBS)、 10μ g/mL牛胰岛素(INS)、0. 5mM3_异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、O. 5 μ M地塞米松(DEX) 和O.1mM吲哚美辛(IDM)混匀后调节PH值至7. 2-7. 4，经O. 22微米滤器过滤、分装，4°C保存备用；诱导第2d细胞胞质内开始有小脂滴出现，至第6d时，胞质内小脂滴明显增多，并且有少数开始融合成大脂滴；诱导分化后的脂肪细胞培养12d结束，按油红O染色法鉴定脂肪细胞倾去培养液，PBS洗细胞2次，10%多聚甲醛固定15min，PBS洗2次，油红O染色 20min, PBS洗2次，稍干后以甘油明胶封固观察拍照；结果显示，两种培养方法的细胞形态学观察结果基本一致，而改良消化培养法得到的 脂肪滴较多。
权利要求
1.一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法，其特征在于基于传统消化培养方法，选取山羊前体肋间脂肪组织，利用改良过的胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培养液对山羊前体脂肪细胞进行体外培养，获得山羊前体脂肪细胞；其具体工艺步骤为(1)、胶原酶I培养基的制备将IOOmg胶原酶1、3g牛血清白蛋白和Iml青链霉素溶液溶解于50mlHBSS溶液中，调节其溶液的PH值为7. 2 7. 4，经过O. 22微米过滤器过滤和分装，配制成重量百分比浓度为O. 2%的胶原酶I培养基，在_20°C温度条件下保存备用；(2)、细胞培养液的制备在DMEM低糖培养液中添加其体积15%的胎牛血清、2%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素溶液和20ng/ml的小鼠表皮生长因子，经O. 22微米过滤器过滤和分装后，配制成细胞培养液，在4°C温度条件下保存备用；(3)、脂肪组织的取样与前处理将山羊从颈部放血并处死后，在无菌条件下取出山羊前体肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入含重量百分比浓度为1%青链霉素溶液的灭菌PBS缓冲液中并置入无菌室，用无菌PBS漂洗3 5次，并用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，得到脂肪组织样品；(4)、山羊前体脂肪细胞的分离与体外培养用无菌眼科剪将已处理过的脂肪组织样品快速地剪切成O. 5 Imm3小块，移入15ml离心管中，再加入2_3倍脂肪组织样品体积的O. 2% 的胶原酶I培养基混合均匀，在37°C恒温摇床中消化75-85min，其间每IOmin振荡I次， 加入等体积细胞培养液终止消化；然后分别用80目、150目和300目不锈钢细胞筛过滤去除未消化的组织块及大体积的脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管，在2000r/min 转速条件下离心6-10min ;除去离心后的上清液后加入细胞培养液清洗I次，在2000r/min 转速条件下离心5min后制成细胞悬液并在显微镜下计数，以5X 104cells/mL接种细胞至 60mm培养皿，置入温度为37°C、饱和湿度、体积比为5%的CO2的培养箱中培养，每2天更换一次培养液，实现山羊前体脂肪细胞的体外培养。
全文摘要
本发明属于细胞培养工程技术领域，涉及一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法，先配制胶原酶I培养基和细胞培养液，将山羊处死后取出山羊前体肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入灭菌PBS缓冲液中并置入无菌室用无菌PBS漂洗，再用眼科剪去除血管和结缔组织，得到脂肪组织样品后快速地剪切成小块移入离心管中，再加入胶原酶I培养基混合均匀后消化；然后用细胞筛过滤去除未消化的组织块及脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管离心后除去上清液，加入细胞培养液清洗并离心后制成细胞悬液，最后接种细胞至培养皿，置入培养箱中培养；其总体工艺简单，原理可靠，培养过程易控，培养效果好，环境友好。
文档编号C12N5/077GK103060268SQ201310018339
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者曲贞晓, 潘庆杰, 沈伟, 闵令江, 孙小凤, 张敏, 姜颖 申请人:青岛农业大学