高纯度质粒dna制备物及其制备方法

专利名称：高纯度质粒dna制备物及其制备方法
技术领域：
本发明通常涉及高纯度质粒组合物及其制备方法，所述组合物具有低的，或者不可检测的荚膜异多糖酸及其他污染物的水平。也描述了在该方法中的有用的多肽。在此描述的方法及组合物具有一系列的用途，包括在生物恐怖主义、环境科学、食品科学、法医学、分子生物学以及健康和医学领域内的各种应用。背景在将核酸引入生物体的任何应用中，关键的步骤是制造高度纯化的，通常是药物级别的核酸。该纯化的核酸必须满足安全性、能力及效力的药物质量标准。此外，期待有可放大的方法，其能够用于产生多克的量的DNA。因此，期待有生产高纯度核酸的方法，其不需要有毒的化学品、诱变剂、有机溶剂或其他危害所得的核酸的安全性或效力的试剂，或者使得扩大规模困难或者不可行。也期待制备不含有污染性内毒素的核酸，所述内毒素若给予患者会引起毒性反应。污染性内毒素的去除是尤其地重要的，例如，自革兰氏阴性(_)细菌来源中纯化的质粒DNA 具有高水平的内毒素及荚膜异多糖酸，后者为细胞外膜的必须组分。质粒是自我复制的遗传性元素，其在宿主细菌中存在及复制。从本质上，涉及特定DNA片段操作的所有分子遗传学方法都使用质粒DNA制造大量的特定的DNA片段(或者得自所述片段的蛋白质/RNA)。细菌宿主的选择,或质粒的来源通常反应了历史上的观点。Stanley Cohen及HerbBayer选择了大肠杆菌(E.Coli)的K-12株用于其1970年代初期的开创性的分子遗传学实验，由于其容易培养并对于代谢研究而言容易控制。这些相同的性质也使得大肠杆菌K-12成为用于细菌遗传学研究的首选的微生物。分子生物学家现在使用相同株的大肠杆菌用于成熟的步骤，这是由于其对于多种分子遗传学应用而言证明是尤其好的宿主。此外，在过去的25年中，大肠杆菌K-12已经证明是对于重组DNA分子增长反应的无害的生物宿主。毒性减弱的大肠杆菌K-12株在实验室环境外不能繁盛生长，其也不能与通常在人类肠中发现的遗传学上更加强壮的大肠杆菌血清型竞争。在其他技术中，当前可得的用于分离及纯化质粒DNA的方法应用离子交换层析(Duarte 等人，Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45)以及尺寸排阻层析(Prazeres, D.M., Biotechnology Techniques Vol.1, N0.6, Junel997, p417_420)，其结合添加剂的使用，所述添加剂如聚乙二醇(PEG)、去污剂及其他组分如六氨合钴、亚精胺及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。将DNA从污染物中分离的其他方法依靠尺寸排阻层析，其涉及基于尺寸上的小差别，将核酸从内毒素及其他污染物分离。这些方法通常是可以接受的，然而可能无法以期待的纯度水平提供有效力的，及成本上合算的核酸(如DNA，包括超螺旋的和/或带切口的(或者松弛的))分离。同时，质粒DNA制备物，其通过细菌制备物制备，并通常含有松弛的及超螺旋的质粒DNA的混合物，经常要求内毒素的去除，如FDA所要求的，由于多种细菌宿主产生的内毒素已知在接受所述质粒DNA的宿主中导致炎症反应，例如发烧或者败血病，或者在一些案例中死亡。这些内毒素通常为脂多糖，或者其片段，其为革兰氏(-)阴性细菌的外膜的组分，并存在于宿主细胞及宿主细胞膜或者大分子的DNA制备物中。因此，内毒素的去除可能是质粒DNA的纯化的关键步骤，所述质粒DNA用作治疗或者预防上的用途。从质粒DNA溶液的内毒素去除主要地利用内毒素的负电性结构。然而，质粒DNA，也是负电性的，并因此分离通常使用阴离子交换树脂达到，所述树脂结合这两种分子，并在一定的情况下，优先地洗脱质粒DNA而结合内毒素。该分离仅仅导致部分去除，这是由于显著量的内毒素与质粒DNA一起洗脱和/或达到非常少的质粒DNA回收。因此，质粒DNA从小体积或大体积的微生物发酵物中的小规模及大规模的分离和纯化需要开发改进的质粒制备方法。对于基于质粒的研究和治疗而言这也是期待的，即核酸能以可再现的方式分离纯化并保持相同的结构，以及为了避免杂质对于哺乳动物体的不良效果，要求所述核酸被分离及纯化到高纯度。用于基因疗法的质粒DNA典型地分离自E.coli K_12。内毒素，也已知为脂多糖(LPS)，已知为革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的细胞膜的主要组分。实际上，一些报导表示E.coli外膜的脂质部分完全由内毒素分子组成。(Qiagen Plasmid PurificationHandbook, Julyl999 )。LPS含有疏水的脂类A部分，这是一系列复杂的糖残基及负电性的磷酸酯基团。LPS的脂类A部分证明内毒素活性并在哺乳动物中引发强烈的、潜在地危及生命的炎症反应。该炎症反应的特征在于发烧，降低的血压，局部的炎症以及感染性休克。脂类A通过结合于血清脂多糖结合蛋白(LBP)并通过在单核细胞、内皮细胞以及多形核白细胞上表达的CD14 受体引发信号转导(Ingalls, R.R.等人 1998.J.1mmunol.161:54135420)。内毒素当注射到小鼠中时是极为致命的，其在注射的I小时内导致死亡。内毒素也已知剧烈地减少细胞中的转染效率(Weber, M.，等人1995.Biotechniquesl9:930940)。因此，使用不含内毒素的质粒DNA用于基因疗法的应用的重要性长期以来被强调。多个科学家为了减少用于基因治疗的DNA样品的毒性，努力从DNA样品中除去LPS及其他的内毒素。然而，近期的证据指出具有可忽略不计的量的LPS的DNA样品当以显著量给予的话，仍然是有毒的。因此，必须鉴定DNA样品中额外的有毒组分并去除，以确保临床上使用的DNA制备物的安全性。内毒素分子的化学结构及性质，及其形成胶团结构的倾向在一开始导致LPS及质粒DNA的共纯化。例如，DNA经常与LPS在CsCl超离心步骤中共纯化，这是由于LPS及质粒DNA在CsCl中具有类似的密度。此外，胶团LPS在尺寸排阻树脂上与大的DNA分子一起分离。类似地，存在于LPS分子上的负电荷与阴离子交换树脂相互作用，以至于导致其与DNA在阴离子交换树脂上共纯化。
已经报道细胞壁多糖污染分离自多种来源的DNA，所述来源包括细菌、酵母、植物、蓝绿藻、原生动物、真菌、昆虫及哺乳动物(Edelman, M..1975.Anal.Biochem.65:293-297 ；Do, N.和 Adams, R.P.1991.BiotechniqueslO: 162-166 ；Chan, J.ff.和 Goodwin, P.H.1995.Biotechniquesl8:419-422)。污染植物基因组DNA的植物多糖据报道抑制限制性内切酶处理及聚合酶链式反应(Robbins, M.等人1995.Benchmarksl8:419-422)。进一步地，由多头绒泡菌黏质物纯化的多糖据报道抑制DNA聚合酶的活性(Shioda, M.和K.Murakam1-Murofush1.1987.Biochem.Biophys.Res.Commun.146:61-66)以及已知来自海胆胚胎的酸性多糖抑制RNA聚合酶的活性(Aoki, Y.和 H.Koshihara.1972.Biochim.Biophys.Acta272:33-43)。文献中描述了几种方法纯化质粒DNA，然而这些方法通常仅去除一部分多糖，如果去除的话。例如，脂类A纯化方法基于脂类A的疏水性质。因此，这些方法将脂类A及与脂类A共价连接的多糖去除。然而，由于仅有小部分的E.coli荚膜多糖共价地连接于脂类A，仅有其少数在质粒DNA的标准制备及纯化步骤中被去除(Jann，B.和K.Jann.1990.Curr.Top.Microbiol.1mmunol.150:19-42 ；fficken, A.J.1985.1n: Bacterial Adhesion, D.M.Pletcher (ed.), Plenum Press:New York, pp.45-70)。一些 E.coli 荚膜多糖具有憐脂酸作为脂类部分；然而，所述磷脂酸典型地在标准的质粒分离步骤中水解。因此，这些多糖在当前使用的基于疏水性(例如，脂类A结合的存在)减少内毒素的方法下不能从DNA中去除。已经开发了几种方法从分离自E.coli的DNA中减少内毒素-阳性LPS的水平(Neudecker, F.和 S.Grimm.2000.Biotechniques28:107-110),其包括几种商业上可得的试剂盒(Qiagen, Inc.，Valencia, CA ;Sigma Chemical C0.，Inc.，St.Louis, MO)。使用Qiagen试剂盒纯化的DNA通常认为是洁净的质粒DNA的“黄金标准”。Qiagen试剂盒不仅设计用于去除LPS，其还包括RNA酶以消化质粒DNA制备物中的RNA。实际上，多数的DNA制备方法包括RNA酶消化步骤。 然而，能够加入质粒DNA的RNA酶是受限的，这是由于高数量的RNA酶会开始消化DNA。难以使用当前的标准纯化步骤将多糖从DNA中分离。DNA及多糖均由有机溶剂沉淀，所述有机溶剂如乙醇和聚乙二醇(PEG)。由于多糖是阴离子性的，采用阴离子交换树脂会与DNA共纯化多糖。进一步，高分子量多糖和质粒DNA在CsCl中具有类似的密度。已经提出了亲和层析从DNA中去除多糖污染物。例如，早期的论文报道了从多种来源的DNA的纯化，所述来源包括植物、昆虫、真菌以及藻类，其使用亲和层析，其中脱蛋白的DNA组分通过连接于琼脂糖的伴刀豆球蛋白A的柱(Edelman, M.1975.Anal.Biochem.65:293-29)。不幸的是，E.Coli多糖通常不含有与伴刀豆球蛋白A结合的糖。类似地，据报道凝集素亲和层析在从分离自真菌及植物的DNA中去除多糖污染物中是有用的(Do, N.和 R.P.Adams.1991.BiotechniqueslO: 162-166);然而由凝集素识别的糖不存在于来自有机体的大多数多糖中，所述有机体如E.coli。革兰氏阴性细菌沉淀物的盐洗也被提出作为纯化细菌基因组DNA的方法(Cahn, J.W.和 P.H.Goodwin.1995.Biotechniquesl8:519-422)。由于存在于 DNA 中的多糖引起的限制性酶切的干扰，提出了盐洗作为改进DNA的纯化的方式。然而上述方法无一成功地去除在见于质粒DNA中的全部多糖。WO 95/20594及美国专利5，969，129描述了用于成批纯化来自玉米及其他植物的基因组DNA的方法。该纯化方法使用含有硼酸盐基团的聚合物凝胶，以从DNA/多糖混合物中分离DNA。尽管在制备用于临床应用的“干净的” DNA中，临床医生的整个重心在于LPS的去除，近期的研究指出“无LPS”的DNA在高剂量下仍然显示毒性。例如，在DNA-脂质体复合物的静脉注射后，科学家观察到导致小鼠死亡的毒性，所述DNA-脂质体复合物含有50-300mg的DNA及量减少的LPS，然而等浓度的脂质体的注射没有毒性的效果。也观察到在使用具有量减少的LPS的DNA转染之后，基因表达减少了。近期的报告还提出，在肌肉注射据认为纯的DNA后，产生了炎症和显著的免疫响应(Fields，P.A.等人2000.Molec.Therap.1:225-235)。因此，甚至据认为是纯的，临床级别以及具有低水平的LPS的DNA在动物中也产生毒性的响应。发明简述在本发明的不同方面中，提供了高纯质粒DNA组合物。也描述了用于制备该质粒组合物的方法，以及具有荚膜异多糖酸降解活性的多肽。这些多肽在制备高纯质粒DNA制备物中是有用的，并在用于降解荚膜异多糖酸的方法中也是有用的。简单来说，因此，本发明涉及革兰氏阴性细菌质粒组合物。该组合物包含革兰氏阴性细菌质粒DNA以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在一个实施方案中，例如，所述组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在另一个实施方案中，所述组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸。在这些及其他实施方案中，所述组合物可能还含有少于0.1mg每毫克革兰氏阴性质粒DNA的糖醛酸，和/或少于0.1mg每毫克革兰氏阴性质粒DNA的岩藻糖。在一个实施方案中，例如,所述组合物进一步包含少于0.05mg每毫克革兰氏阴性质粒DNA的糖醛酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含每毫克革兰氏阴性质粒DNA的少于0.05mg岩藻糖。在另一个实施方案中，所述组合物不包含可检测的糖醛酸和/或岩藻糖。本发明的另一个方面涉及革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA，少于约0.1mg每毫克革兰`氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。本发明的另一个方面涉及革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA，少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖酸。在一个实施方案中，所述组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸、岩藻糖、糖醛酸、染色体DNA或基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物。本发明的另一个方面涉及用于纯化质粒DNA的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用多肽处理含有质粒DNA的含水组合物以消化荚膜异多糖酸，以及将质粒DNA从处理的含水组合物中分离。本发明的另一个方面涉及用于纯化质粒DNA的方法，所述方法包括:(a)通过使含水组合物与阴离子交换树脂组合来预处理含有质粒DNA的含水组合物；(b)用多肽处理经预处理的含水组合物以分解荚膜异多糖酸；(c)将质粒DNA从经处理的含水组合物中分离，该分离包括将经处理的含水组合物与亲和层析树脂组合，随后将经处理的含水组合物与疏水相互作用层析树脂组合；以及(d)过滤质粒DNA。
本发明的另一个方面涉及多肽，所述多肽与SEQ ID NO:1及其保守的氨基酸替换具有至少90%的同源性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ IDNO:1及其保守的氨基酸替换具有至少95%的同源性。在另一个实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。本发明的另一个方面涉及多肽，所述多肽与SEQ ID NO:2及其保守的氨基酸替换具有至少90%的同源性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ IDNO:2及其保守的氨基酸替换具有至少95%的同源性。在另一个实施方案中，所述多肽具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列。本发明的另一个方面涉及分离的多核苷酸，其包含核酸序列，该序列与SEQ IDNO:7或其互补序列具有至少90%的序列同一性。在一个实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:7或其互补序列具有至少95%的序列同一丨丨生。在另一个实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:7的核酸序列。本发明的另一个方面涉及分离的多核苷酸，其包括核酸序列，该序列与SEQ IDNO:8或其互补序列具有至少90%的序列同一性。在一个实施方案中，所述核酸序列与SEQID N0:8或其互补序列具有至少95%的序列同一丨丨生。在另一个实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:8的核酸序列。本发明的其他方面涉及包含多核苷酸的载体，其中，该载体选自质粒、病毒及噬菌体。在一个方面，其多核苷酸与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少90%的序列同一性。在另一个方面，其多核苷酸与SEQ ID NO:8或其互补序列具有至少90%的序列同一性。在任一方面的一个实施方案中，所述载体为质粒或者噬菌体。在任一方面的优选的实施方案中，所述载体为噬菌体。本发明的另一个方面涉及在生物材料中消化荚膜异多糖酸的方法，该方法包括使生物材料与多肽接触，所述多肽能够消化荚膜异多糖酸。在一个实施方案中，所述生物材料选自粗细菌裂解液，部 分纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸的含水溶液。在另一个实施方案中，所述生物材料为细菌粘液。在另一个实施方案中，所述生物材料为生物膜。本发明的另一个方面涉及从含水组合物中去除内毒素的方法，所述组合物含有细菌大分子，该方法包括消化该含水组合物中的荚膜异多糖酸，以及随后将该含水组合物与层析材料组合，以从细菌大分子中分离内毒素。在特定的实施方案中，所述含水组合物得自细菌裂解液。其他的方面及特征或者为显而易见的，或者在此后指出。前述内容指出了本发明相当广泛的数个方面，从而可能更好地理解随后的本发明详述。本发明的附加特征及优点于此后描述，其形成了本发明的权利要求的主题。本领域技术人员应当意识到，所公开的观念和特定的实施方案可能容易地作为修改或者重新设计组合物及方法的基础，用于实现与本发明相同的目的。本领域技术人员应当了解，该修改或重新设计的组合物及方法不悖离本发明在所附的权利要求中的精神及范围。附图简述

图1A、1B、1C及ID显示了根据一个实施方案的荚膜异多糖酸降解酶的核苷酸及氨基酸序列。图2显示了凝胶，其中几种不同的DNA质粒样品以该凝胶电泳方法检测多糖可视化及定量。图3-8显示了 SEQ ID N0S: 1-6的多肽序列。图9-10显示了 SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8的多核苷酸序列。图11显示了 SEQ ID N0:9-17的多肽序列。图12-14显示了表格，为从120只小鼠的高剂量DNA-BIV脂质体复合物静脉注射之后的结果，所述脂质体复合物根据在此描述的方法纯化。缩写及定义除非另外地定义，所有在此使用的工艺、符号及其他科学术语或者专门用语意为具有本发明所属领域的技术人员一般理解的意义。在一些情况下，为了清楚和/或便于引用，本文对具有广泛理解的意义的术语进行定义，并且该定义在此包含不应该必然地解释为描述与本领域通常理解地基本上不同。在此描述或引用的多种技术和步骤被本领域技术人员使用常规的方法学而充分理解并广泛采用，例如广泛地使用的分子克隆方法学，其描述于Sambrook等人的Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd.edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.中。视情况而定，涉及商业上可得的试剂盒及试剂的使用的步骤通常地根据生产商所规定的步骤和/或参数进行，除非另外指出。 术语“类似物”指与另一个分子在结构上相似或者具有相似的或者对应的属性(如CAE相关蛋白)的分子。例如，CAE蛋白的类似物可能被特异结合CAE的抗体或者T细胞特异地结合。术语“抗体”以最广泛的含义使用。因此“抗体”可能为天然地产生的或人造的，如单克隆抗体，其由常规的杂交瘤技术制备。抗-CAE抗体包括单克隆及多克隆的抗体，以及含有所述抗原结合结构域和/或这些抗体的一个或者多个互补性决定区域的片段。“抗体片段”定义为免疫球蛋白分子可变区域的至少一部分，所述部分结合于其靶点，即抗原结合区域。在一个实施方案中，其特别地涵盖单一的抗-CAE抗体及其克隆(包括激动剂，拮抗剂及中和抗体)及具有多表位特异性的抗-CAE抗体组合物。术语“同系物”指显示与另一个分子的同源性的分子，例如，通过在对应的位置上具有相同或者类似的序列或者化学残基。术语“杂交”、“杂交(1^131^(112；[1^)”, “杂交(hybridizes)”等等,用于核酸的环境下，意为指常规的杂交条件，优选地如在50%甲酰胺/6xSSC/0.1%SDS/100 u g/ml ssDNA中杂交，其中用于杂交的温度高于37° C以及用于在0.lxSSC/0.1%SDS中洗涤的温度高于55。Co短语“分离的”或者“生物纯的”指这样的物质，其基本上或本质上不含在物质见于天然状态下与其正常地共存的组分。因此，根据本发明的分离的肽优选地不含有在肽的原位环境下通常与其结合的物质。例如，核酸或多核苷酸被称为“分离的”是这样一种情况:核酸或多核苷酸基本上与污染物多核苷酸分离，所述污染物多核苷酸对应于或互补于靶基因之外的基因，或者编码靶基因产物或其片段之外的多肽。技术人员能够容易地使用核酸分离步骤来获得分离的多核苷酸。例如当采用物理、机械或者化学方法将目标蛋白或者多肽从正常地与所述蛋白结合的细胞组分中去除时，该蛋白被称为是“分离的”。技术人员能够容易地使用标准纯化方法获得纯化的蛋白质。可选地，分离的蛋白质可以通过化学的方式制备。术语“哺乳动物”指分类为哺乳类的任意生物体，其包括小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、马和人类。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物为小鼠。在本发明的另一个实施方案中，所述哺乳动物为人类。术语“单克隆抗体”指由相同的核酸分子编码的抗体的集合，所述核酸分子可选地由单一的杂交瘤或者其他细胞系产生，或者由转基因哺乳动物产生，从而各个单克隆抗体典型地识别抗原上的相同表位。术语“单克隆”不限于任意特定用于产生抗体的方法，该术语也不限制于在特定的物种中所产生的抗体，所述物种如小鼠、大鼠等等。术语“多克隆抗体”指抗体的异种混合物，其识别并结合于相同抗原上的不同表位。多克隆抗体可以从例如粗血清制备物获得，或者可以使用例如抗原亲和层析或者蛋白A/蛋白G亲和层析纯化。本文关于多肽序列所说明的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”，定义为在候选序列中氨基酸残基与特定的多肽序列中氨基酸残基相同的百分比，如必要，在比对序列和引入缺口之后进行以达到最大百分比的序列同一性，而并不考虑作为序列同一性的部分的任何保守替换。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可用的电脑软件如BLAST，BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或者Megalign (DNASTAR)软件。本领域普通人员能够确定测量比对的合适参数，包括任何为了在所比较的序列的全长上达到最大比对所需要的算法。例如，氨基酸序列同一性百分比可以使用序列比较程序NCB1-BLAST2 (Altschul 等人，Nucleic Acids Res.25:33893402(1997))确定。所述NCB1-BLAST2序列比较程序可以得自位于Bethesda, Md的National Instituteof Health。NCB1-BLAST2使用几个搜索参数，其中所有那些搜索参数设定为默认值，包括例如 unmask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum low complexitylength=15/5, mult1-pass e-value=0.01, constant for mult1-pass=25, dropoff forfinal gapped alignment=25 以及 scoring matrix=BL0SUM62o本文关于编码多肽的核酸序列说明的术语“核酸序列同一性百分比(％)”定义为在候选序列中与目标多肽核酸序列中的核苷酸一致的核苷酸的百分比，如必要，在比对序列和引入缺口之后进行以达到最大百分比的序列同一性。为了确定核酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可用的电脑软件如 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 或者 Megalign (DNASTAR)软件。本领域普通人员能够确定测量比对的合适参数，包括任何为了在所比较的序列的全长上达到最大比对所需要的算法。例如，核酸序列同一性百分比也可以使用序列对比程序NCB1-BLAST2 (Altschul 等人，Nucleic Acids Res.25:33893402 (1997))来确定。所述NCB1-BLAST2序列比较程序可能得自位于Bethesda, Md的National Institute ofHealth。NCB1-BLAST2使用几个搜索参数，其中所有那些搜索参数设定为默认值，包括例如 unmask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum low complexitylength=15/5, mult1-pass e-value=0.01, constant for mult1-pass=25, dropoff forfinal gapped alignment=25 以及 scoring matrix=BL0SUM62o术语“多核苷酸”意为聚合物形式的核苷酸，其长度为至少10个碱基或者碱基对，其为核糖核苷酸或者脱氧核苷 酸，或者核苷酸任意一种类型的修饰形式，并意图包含单链或者双链形式的DNA和/或RNA。在本领域中，该术语通常与“寡核苷酸”可交换地使用。多核苷酸可以包括本文公开的核苷酸序列，其中胸腺嘧啶(T)也可以为尿嘧啶(U);该定义属于DNA与RNA的化学结构之间的差别，具体地观察到RNA中的四种主要碱基中之一为尿嘧啶(U)而非胸腺嘧啶(T)。术语“多肽”意为至少约4，5，6，7或8个氨基酸的聚合物。在本说明书中，使用标准的三字母或者单字母的氨基酸名字。在本领域中，该术语通常与“肽”或者“蛋白质”可交换地使用。“重组”的多核苷酸(如DNA或者RNA分子)或者“重组”的多肽为在体外进行分子操作的多核苷酸或者多肽。具有本领域普通技术人员能容易地确定杂交反应的“严格性”，该严格性是通常地凭经验计算的，其取决于探针长度，洗涤温度以及盐浓度。通常地，为了适当的变性，较长的探针要求较高的温度，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常地取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境下时，变性的核酸序列再退火的能力。探针与可杂交序列的想要的同源性程度越高，则能使用越高的相对温度。结果是，随后更高的相对温度将倾向于使反应条件更严格，而更低的温度较不如此。杂交反应严格性的额外细节以及解释参见 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995)。以下可以确定为本文定义的“严格的条件”或者“高严格性的条件”，而其不限于此:(I)洗涤采用低离子强度及高温度，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠在50° C下；(2)在杂交中采用变性剂，如甲酰胺，例如具有下列成分的50%(v/v)甲酰胺:0.1%胎牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH为6.5的具有750mM的氯化钠、75mM柠檬酸钠的42°C的50mM磷酸钠缓冲液；或者(3) 42° C采用50% 甲酰胺，5X SSC (0.75M NaCl, 0.075M 柠檬酸钠)，50mM 磷酸钠(pH6.8)，0.1% 焦磷酸钠，5x Denhardt溶液，超声的鲑鱼精子DNA (50 u g/ml)，0.1%SDS以及10%硫酸葡聚糖，并且在42° C的0. 2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)以及55° C的50%甲酰胺中洗涤，随后通过含EDTA的0.1xSSC在55° C下进行高严格性洗涤。〃“中等严格的条件”描述为，然而不限于 Sambrook 等人 Molecular Cloning:ALaboratory Manual, New York:Cold SpringHarbor Press, 1989中的那些条件，并包括不如上述严格的洗涤溶液以及杂交的条件(例如温度，离子强度以及％SDS)的使用。中等严格条件的实例为在溶液中，37° C下过夜孵育，所述溶液包含:20%甲酰胺，5X SSC (150mM NaCl, 15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5X Denhardt溶液，10%硫酸葡聚糖以及20mg/ml的经变性剪切的鲑鱼精子DNA，随后使用约37-50° C的IxSSC洗涤滤器。技术人员能认识到如何在必要时调节温度，离子强度等等，从而适应如探针长度等等因素。术语“变体”指显示描述的类型或者标准的变化的分子，如与具体描述的蛋白质(如示于图1或者图2的CAE-蛋白)在相应的位置(或者多个位置)具有一个或者多个不同的氨基酸残基的蛋白质。类似物是变体蛋白的实例。剪接同等型及单核苷酸多态性(SNP)是变体的其它实例。本发明的具有荚膜异多糖酸降解(CAE)活性的多肽包括在此具体指出的那些，以及等位基因的变体，保守的替换变体，类似物以及同源物，其可以在本文列出或者在本领域中容易获得的的方法之后，在经过度实验分离/产生及表征。也包括组合了不同CAE蛋白或其片段的部分的融合蛋白，以及CAE蛋白与异种多肽的融合蛋白。该CAE蛋白共同地指CAE相关的蛋白，本发明的蛋白或CAE。术语“CAE相关蛋白”指至少10，15，25，50，100, 150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700 或者多于 700 个氨基酸的多肽片段或者CAE蛋白质序列。详述本发明总的来说涉及“超洁净”的质粒DNA制备物，其制备方法及在这些方法中有用的酶。经报导地，发现多糖特别是荚膜异多糖酸污染“洁净”的质粒DNA制备物，当使用时，例如用于基因治疗时，其在人类和哺乳动物中诱导毒性作用。据信诱导这些毒性作用的组合物尚未在文献中确定。可能被DNA制备物中的多糖污染的存在不利地影响的其他应用包括临床诊断，法医学及其他生物技术方法，如其上包括核酸的芯片及微阵列，以及在分子研究(如建立染色体，转录起始位点的分析，X-射线晶体学以及DNA结构研究等)中。存在从DNA制备物中去除此类污染分子的急需。除了别的之外，因此，本发明提供了分离的，纯化的以及重组的多肽及涉及其应用的方法，所述多肽具有荚膜异多糖酸降解活性。本发明还提供了编码该多肽的分离的多核苷酸。本文描述的多肽具有一系列的应用，并使得在生物材料中消化荚膜异多糖酸的方法，以及在从包括生物大分子的组合物中去除内毒素的方法成为可能。值得注意的是，所述多肽也使得质粒DNA制备物的制备成为可能，优选地为革兰氏阴性细菌质粒DNA，其包含少于约0.1mg每毫克的质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及更优选地少于约0.05mg每毫克的质粒DNA的荚膜异多糖酸。在特定的优选实施方案中，在由本文描述的方法制备的质粒组合物中找不到可检测的荚膜异多糖酸。所述质粒组合物可能还具有非常低水平的，或者不可检测水平的其他多糖污染物，例如糖醛酸及岩藻糖。本发明部分涉及这一发现:本发明的多肽化合物能够消化荚膜异多糖酸(也称作M-抗原)，其为由一系列的肠细菌产生的胞外多糖，所述肠细菌包括大多数大肠杆菌株。取决于细菌，例如，荚膜异多糖酸可以包括多种比例的岩藻糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸以及乙酸盐和丙酮酸盐(参见例如Sutherland, Biochem.J.115，935-945 (1969)。如前文所记录的，发现了内毒素及·多糖，特别是荚膜异多糖酸污染核酸的制备物，所述制备物例如用于治疗用途，同时使用现有的标准纯化步骤很难将内毒素及多糖如荚膜异多糖酸从核酸中分离出来。相应地，本文描述的多肽可以通常地用于材料中荚膜异多糖酸的消化。通常地，含有荚膜异多糖酸的任意材料可以使用本文描述的多肽处理，典型地，所述材料为生物材料。所述生物材料可以得自微生物，人类或者动物的组织以及环境样品的部分，所述环境样品如考古学上的残留物、堆肥或者其他分解物质、泥炭沼、植物物质、沉淀物、污泥、泥土以及废水，废水例如其从来源上为地面上或者地面下的。在特定的实施方案中，所述生物材料为生物粘液。根据这些实施方案，例如，所述荚膜异多糖酸可以存在于完整细菌的细胞膜中。在其他的实施方案中，所述生物材料可以为粗细菌裂解液，部分地纯化的细菌裂解液以及包括提取的细菌核酸的含水溶液。在另一个实施方案中，所述生物材料可以为生物膜。在另一个实施方案中，所述生物材料可以为浆柏或者浆柏衍生物(例如，如那些机械地或者化学地由木头或者纤维来源制备的)。如前文所记载的，根据本发明的其他方面，本文描述的多肽可以用于从包含细菌大分子(例如，质粒DNA)的含水组合物中去除内毒素的方法中。在特定的优选方面，所述多肽用于纯化质粒DNA的方法中，所述质粒DNA典型地为革兰氏阴性细菌质粒DNA。质粒DNA组合物本发明的一个关键的方面是高度纯化的质粒组合物及药物级别的质粒DNA组合物。这些组合物，例如，可以通常由本文描述的荚膜异多糖酸酶促消化方法制备，其可以与或者可以不与常规的纯化技术组合，常规的纯化技术如一种或多种层析或者过滤步骤的组合。因此,本发明包括,或者进一步地包括制备及分离高度纯化的质粒组合物的方法，所述质粒组合物基本上不含多糖，所述多糖包括荚膜异多糖酸，岩藻糖以及糖醛酸，以及其他的污染物，并因此为药物级别的DNA。除了具有非常低的，优选地不可检测水平的荚膜异多糖酸和其他多糖之外，由本文描述的方法制备及分离的所述质粒DNA通常包括非常低水平的内毒素，所述内毒素包括一种或者多种污染性的染色体DNA、RNA、蛋白质及内毒素,并优选地含有绝大多数闭环形式的质粒DNA。根据本文描述的方法制备的所述质粒DNA具有足够的纯度用于研究及基于质粒的疗法。本发明的质粒组合物可以包括任意类型具有任意尺寸的载体。例如，可以由本文描述的方法纯化的质粒DNA的尺寸范围可以为从约0.3kbp (小环或者最小的转录单位)到约50kbp，典型地3kbp到20kbp，或者更大(例如5到lOOkbp，或者更大，如得自噬菌体的穿梭载体、HAC、YAC、MAC及得自EBV或者其他的非整合病毒的游离体)。在某些实施方案中，所述 DNA 包括约 0.3kbp、0.5kbp、0.75kbp、lkbp、3kbp、5kbp、lOkbp、15kbp 或者 20kbp 的载体骨架，治疗性的基因以及相关的调节序列。这可以应用于单链DNA(即0.3kb到50kb等等，如得自Ml3的那些)。因此例如，载体骨架可以能够携带约l_50kbp或者更大(例如3-20kbp)或者约l_50kb，或者更大(例如3-20kbp)的插入物。该插入物通常地取决于该质体组合物将用于的应用。对于基因疗法或者基于疫苗的应用，例如，该插入物可以包括来自任何生物体的DNA，然而典型 地为哺乳动物来源的，并除了编码治疗蛋白的基因之外，可以包括调节序列(如启动子)、聚腺苷酸化序列、增强子、基因座控制区等等。编码治疗蛋白的基因可以为基因组来源的，并从而含有如在其基因组组织中所反映的外显子及内含子，或者其可以得自互补的DNA。该载体可以包括，例如能以高拷贝数量复制的载体骨架，所述骨架对于治疗基因的插入具有多聚接头，编码可选择标记物的基因(例如四环素或者卡那霉素抗性基因)，并且其在物理上是小的及稳定的。所述质粒的载体骨架有利地允许哺乳动物片段、其他真核的、原核的或者病毒DNA的插入，并且所得的质粒可以按照本文描述地纯化，并用于体内或者离体的基于质粒的疗法或者其他应用。所述质粒组合物可以还包含其他药学上可接受的组分，缓冲剂、稳定剂或者用于改进基因转移以及特别是质粒DNA转移进入细胞或者生物体的化合物。通常，本文提供“超净”质粒DNA组合物。典型地，所述质粒DNA组合物为革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物。如本文所描述的，开发了有效的基于酶促的方法，其使得荚膜异多糖酸污染从多种细菌材料中去除，所述细菌材料如质粒DNA样品。在不同的实施方案中，所述方法的第一步可以涉及检测作为污染源(如质粒DNA污染)的荚膜异多糖酸。这可以直接或者间接地实现，例如，通过测试样品中岩藻糖的存在(如下所述)，这是由于已知岩藻糖占荚膜异多糖酸的约22%。在一个实施方案中，所述质粒DNA组合物为革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA以及少于约0.1mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在该实施方案中更优选地，所述组合物包含少于约0.05mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在一个尤其优选的实施方案中，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸。如本文另外记载的，本发明的所述质粒DNA组合物也优选地包括低水平的或者不可检测的水平的其他多糖污染物，如糖醛酸或者岩藻糖。因此，在一个实施方案中，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.1mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。在该实施方案中更优选地，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。优选地，在所述的质粒DNA组合物中不能发现可检测的糖醛酸。在这些和其他实施方案中，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物优选包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。在该实施方案中更优选地，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地，在所述的质粒DNA组合物中不能发现可检测的岩藻糖。组合来说，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。例如，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。优选地，在所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸以及可检测的糖醛酸。按照另一种组合，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。例如，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的0.05mg的荚膜异多糖酸，以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸以及可检测的岩藻糖。在再另一个组合中，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸，以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。例如，所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸，以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地，在所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸、可检测的糖醛酸以及可检测的岩藻糖。除了前述的荚膜异多糖酸、糖醛酸和/或岩藻糖的减少的水平，本文描述的质粒组合物可以也包括，例如，少于0.0lmg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物；更优选地，所述组合物包括每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.0Olmg,少于0.0OOlmg或者少于0.0OOOlmg的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白 质和/或内毒素污染物。在一个实施方案中，例如，所述质粒组合物可以包含少于0.1mg (更优选地少于0.05mg，再更优选地无可检测的量)每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸，以及少于0.01mg(更优选地少于0.0Olmg,再更优选地0.0OOlmg)每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的宿主细胞染色体DNA或者基因组DNA污染物。所述质粒组合物可以还包含每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物的少于0.1mg (更优选地少于0.05mg，再更优选地无可检测的量)的荚膜异多糖酸，以及每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.0lmg (更优选地少于0.0Olmg,再更优选地0.0OOlmg)的宿主细胞蛋白污染物。用于检测荚膜异多糖酸、糖醛酸、岩藻糖以及其他多糖的水平的测试在本领域内为公知(或者本文所描述)；检测可能存在于质粒组合物中的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素的方法也是本领域公知的。在一个实施方案中，例如，本发明的质粒组合物可已包括每mg的革兰氏阴性细质粒DNA的少于0.1mg,优选地少于0.05mg的荚膜异多糖酸(例如，0.04,0.03,0.02或者0.0lmg)，更优选地不含有可检测的荚膜异多糖酸，其按照二喹啉甲酸(BCA)测试进行测量。适用的BCA测试描述于例如Meeuwsen等人的Biosc1.Bioeng.89, 107-109 (2000)；以及Verhoef等人的Carbohyd.Res.340(11)，1780-1788(2005)中。示例性的用于测量荚膜异多糖酸水平的BCA测试见于实施例16。在另一个实施方案中，所述质粒组合物可以包括荚膜异多糖酸，其水平列举于前段中，以及进一步地包含每mg的革兰氏阴性质粒DNA的少于约0.1mg的，优选地少于约0.05mg的糖醛酸(如0.04,0.03,0.02或者0.0lmg),以及更优选地按照糖醛酸测试没有可检测的糖醛酸。通常地，质粒DNA样品的糖醛酸含量使用标准曲线进行测量，所述标准曲线由硫酸肝素或者葡萄糖醛酸作为标准获得。例如，硫酸肝素类似于来自E.Coli的多糖污染物，这是由于糖醛酸包含约25%的硫酸肝素总重。硫酸肝素按重量50%由糖组成。这些糖的半数为葡萄糖胺，糖的另外一半为艾杜糖醛酸以及葡萄糖醛酸，剩下的硫酸肝素由糖的修饰提供，所述修饰包括硫酸酯以及乙酰胺。可选地，葡萄糖醛酸可以用于产生用于直接测量糖醛酸的标准曲线。标准溶液置于玻璃试管中，所述玻璃试管具有硼酸盐/硫酸溶液(例如0.025M四硼酸钠十水合物，其溶解于具有1.84的比度的硫酸中)并进行混合。将咔唑的纯乙醇溶液加入混合物中， 所述整个混合物进行涡旋震荡并浸没于沸水中。将试管冷却，并在分光光度计中读出所述溶液在530nm的吸收。将获得的标准的吸收值对标准的浓度进行作图。当DNA样品经历相同的反应时，质粒DNA样品的糖醛酸含量可以从其在530nm处的吸收值进行推断。质粒DNA样品的多糖含量可以随后通过将糖醛酸的量加倍进行推断，所述加倍的倍数从3.3到9.1 (取决于样品中荚膜异多糖酸、ECA以及0-和K-抗原的普遍性)。示例性的用于测量糖醛酸水平的糖醛酸测试见于实施例16。在另一个实施方案中，所述质粒组合物可以包括前述段落中所列举水平的荚膜异多糖酸和/或糖醒酸，并进一步包含每mg的革兰氏阴性质粒DNA的少于约0.1mg,优选地少于约0.05mg的岩藻糖(例如0.04,0.03,0.02或者0.0lmg),以及更优选地没有可检测的岩藻糖，其按照岩藻糖测试进行测量。用于样品中的岩藻糖含量的测试的基本步骤可见于Morris，Anal.Biochem.121，129-134(1982)。溶液制备及溶液储存条件以及用于此测试的样品的详细描述也已经公开(Passonneau, J.V.和0.H.Lowry.1974.1n:Methods ofEnzymatic Analysis, U.H.Bergmeyer(ed.), 2nd edition, Academic Press:NewYork, volume4, pp.2059-2072)。使用这种方法，测定了所述质粒DNA样品的岩藻糖水平，并计算了荚膜异多糖酸水平的浓度。如本文别处描述的，发现荚膜异多糖酸是多种来源的质粒DNA中的首要污染物，所述质粒DNA甚至是GMP级别的质粒DNA。示例性的用于测量岩藻糖水平的岩藻糖测试见于实施例16。在这些以及其他的实施方案中，所述革兰氏阴性质粒组合物当与多糖选择性标记试剂组合时，优选地不包含可视觉检测的多糖。通常地，多糖可视化测试涉及将多糖使用荧光试剂标记，然后检测其存在，例如，在电泳介质中。优选地，该试剂与本文描述的质粒组合物组合时没有可检测的多糖。在一个实施方案中，所述多糖选择性标记试剂为(4，6-二氯三嗪基)_氨基荧光素(DTAF)。其他的多糖选择性标记试剂是已知的，或者对于本领域技术人员是明显的。示例性的利用多糖选择性标记试剂的测试见于实施例16。此外，本文描述的荚膜异多糖酸降解方法导致质粒DNA组合物的粘度降低。相应地，通过将与处理的质粒DNA组合物的粘度与未处理的质粒DNA样品的粘度相比，可以检测荚膜异多糖酸的存在。示例性的利用质粒DNA的粘度水平的测试见于实施例16。通常地，随着存在于质粒组合物中的荚膜异多糖酸的水平(和/或糖醛酸、岩藻糖或者其他多糖或者其他污染物的水平)降低，该质粒组合物的LD5tl (对于50%的试验种群致死的剂量)上升。例如，通过减少荚膜异多糖酸的水平到每mg革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.lmg，在一个实施方案中，质粒组合物的相应的LD5tl上升至少25% ;更优选地，在本实施方案中，至少50%。通过进一步地降低荚膜异多糖酸(以及其他多糖)的水平，并且可选地类似地减少其他污染物的水平，所述污染物如染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素，所述质粒组合物的相应的LD5tl可能上升至少50%，至少75%或者至少100%。作为另一个实例，通过降低荚膜异多糖酸的水平到每mg的革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.5mg,以及将染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物的水平降低到每mg的革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.0lmg,所述质粒组合物的相应LD5tl上升至少50%，更优选地在本实施方案中为至少100%。一般而言，本发明 的质粒组合物可能用于广泛的应用中，举几个例子来说，包括以下的那些领域:生物恐怖(试剂检测和分析)、环境科学(如农业、园艺学以及林学)，食品科学、法医学、分子生物学、健康及医学(例如基因疗法、诊断、重组蛋白表达)以及空间科学。本文描述的高纯质粒组合物可以用于体内或者离体，例如用于基因疗法和基于疫苗的应用(即所述质粒组合物可以给予哺乳动物，包括人类)。除此之外地，或者可选地，所述质粒组合物可以用于常规的诊断以及法医技术中，例如，用于改进此类方法学的稳定性、特异性、可再现性和/或灵敏性。这可以包括例如得自环境的样品的分析、检测或者检查，例如来自公共供水系统，来自食品的样品以及来自其他生物学或者临床的样品，所述样品如血、唾液、痰、精液、颊部涂片、尿或者粪便废物，细胞及组织的活组织检查以及微解剖，羊水或者植物、动物或者人类患者的组织匀浆，等等。本文描述的质粒组合物的应用的其他实例包括微生物基因分型，植物及动物的DNA指纹图谱，泥土、水、植物及动物中病原体及有益微生物的检测，被不同的生物实体污染的生物样品及环境样品的法医鉴定，以及分子学研究，如，例如建立染色体、转录信息的分析、X-射线晶体学以及DNA结构研究。所述的质粒组合物也可以用于与固体基质芯片连接或者组合使用的形式，除其他之外，其检测基因、突变或者mRNA表达水平，如核酸微阵列以及分子检测芯片，其采用如荧光、放射能力、光学干涉测量法、拉曼光谱、半导体或者其他的电子学(参见如美国专利N0.7，098，286 ;美国专利N0.6，924，094以及美国专利N0.6，824，866 (其各个在此结合作为参考))。
方法如本文别处描述的，本发明的多肽可以在广泛范围的方法中应用，尤其是涉及、要求或者受益于荚膜异多糖酸的消化或者降解的那些方法，所述荚膜异多糖酸典型地为生物材料中的，如细菌样品或者包含细菌大分子的组合物(如含水的组合物)。一般来说，含有不期待的荚膜异多糖酸的生物材料可以使用本文描述的多肽处理，所述生物材料包括生物膜(即包裹在自行产生的聚合物基质中的微生物的构造的群体，其或者粘附于活的或者无生命的表面，或者其独自存在)、细菌裂解物、质粒DNA等等。本文描述的方法通常涉及生物材料中或者在包含生物材料的组合物中的荚膜异多糖酸的降解。通常地，所述方法使 用本文描述的多肽，用于消化或者降解可能存在于材料中的荚膜异多糖酸。本文描述的方法的一个实施方案涉及，例如来自生物材料的荚膜异多糖酸的消化。可选地，该方法可以涉及含水组合物中荚膜异多糖酸的消化，所述含水组合物含有细菌大分子。作为另外可选的，所述方法可以涉及使用多肽处理含水的组合物以消化荚膜异多糖酸，所述组合物包含质粒DNA。使用多肽来消化存在于样品中的荚膜异多糖酸；因此，所述多核苷酸具有荚膜异多糖酸降解活性，或者为荚膜异多糖酸降解酶。在一个特定的实施方案中，该方法涉及在生物材料中消化，以及该方法包括使生物材料与多肽接触，所述多肽能够消化荚膜异多糖酸。所述生物材料可以为例如粗细菌裂解液，部分地纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸(如革兰氏阴性质粒DNA)的含水溶液。可选地，所述生物材料可以为细菌粘液。作为另外可选的，所述生物材料可以为生物膜，所述生物膜包含革兰氏阴性细菌。在另一个可选的实施方案中，所述细菌材料可以存在于浆柏(例如木或者纤维浆柏)组合物、溶液或者混合物中。在另一个实施方案中，该方法涉及从含水组合物中去除内毒素，所述组合物含有细菌大分子，并且该方法包括消化该含水组合物中的荚膜异多糖酸，以及随后将该含水组合物与层析材料组合，以从细菌大分子中分离内毒素。在一个优选的实施方案中，所述方法涉及纯化质粒DNA，如革兰氏阴性细菌质粒DNA，并且所述方法包括使用多肽处理含有质粒DNA的含水组合物以消化荚膜异多糖酸，并将质粒DNA从处理的含水组合物中分离，例如使用常规的层析技术。在下文描述的一系列的工业方法中也可以采用所述多肽。在特定的方面，已经开发了用于从质粒DNA样品中去除污染性多糖的方法，其使得多糖的去除成为可能，包括从质粒DNA样品中去除包括LPS之外的那些。除此之外，RNA及LPS也从所述质粒DNA样品中去除。因此，本发明的方法导致了纯化的质粒DNA，如下所述，其含有极低的以及在多个情况下不可检测水平的多糖。不像前述的方法无法确定污染性多糖的水平，可以进行特定步骤来对DNA样品中的多糖水平定量，从而使得研究者能够确信多糖从DNA样品的去除。总的来说，可以采用本文描述的任意多肽。例如，所述多肽可以包含与SEQ IDNO:1具有至少90%同源性的氨基酸序列，或者所述多肽可以包含与SEQ ID NO:2具有至少90%同源性的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，所述多肽具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列。对于本文描述的特定方法的起始物料为大量的细菌材料，或者含水组合物，其包含该生物材料，如细菌细胞或者其他细菌物质，其通过例如发酵或者细胞培养、从环境中分离或者得自组织或者其他生物体(如真菌、细菌等等)制备。在一个实施方案中，所述生物材料包括得自肠细菌的细菌细胞，所述肠细菌如E.Coli0在另一个实施方案中，所述生物材料为细菌粘液，根据此实施方案中，例如，荚膜异多糖酸存在于细菌的细胞膜中。在一个优选的实施方案中，所述生物材料为革兰氏阴性细菌质粒DNA材料。多种细胞类型可以用作本文描述的方法的原料，如细菌(例如革兰氏(_)、革兰氏(+ )以及古细菌)、酵母以及其他的原核及真核细胞，包括哺乳动物细胞和重组细胞。在这些以及其他的细胞类型中，细菌细胞，以及尤其优选革兰氏阳性(+ )以及革兰氏阴性(_)细菌细胞，如E.Co I 1、沙门氏菌或杆菌，而革兰氏阴性(-)细菌细胞为最优选的。在特定的实施方案中，所述细菌为革兰氏阴性(_)细菌，在本实施方案中更优选的细菌为E.Col1.根据本文描述的方法，E.Coli宿主株是有用的，所述宿主株具有广泛选择的并是广泛接受的，同时所述宿主株除了其他商业来源，可得自Stratagene (La Jolla, CA), Qiagen (Valencia, CA),New England BioLabs (Ipswich, MA)以及 Promega (Madison, WI)。典型地，所述生物材料为细菌裂解液，或者其衍生物。因此，细菌的起始物料(如细菌细胞等等)必须裂解或者瓦解以形成裂解物。总而言之，细菌裂解步骤涉及用于打开细菌细胞的任意常规方法，从而将核酸及其他细胞组分从中释放出来。所述裂解步骤可能涉及机械方法、裂解试剂或溶液，或其组合的使用。对于得自发酵或者细胞培养的生物材料，所述细胞使用如下所述的化学的或者机械的技术瓦解，从而形成粗裂解液。例如，采用细菌培养时，将细菌细胞裂解，从而形成粗细菌裂解液。通过这些操作，细胞组分从细胞中释放，所述细胞组分包括DNA、RNA、蛋白质、荚膜异多糖酸以及其他多糖。在特定的实施方案中，所述裂解液可能经历预处理的步骤，如纯化步骤，以去除细胞污染物以及内毒素，从而形成部分纯化的(如细菌的)裂解液。当使用裂解试 剂时，裂解试剂用于破坏细胞膜，从而使DNA、RNA以及蛋白质从细胞中释放。一种优选的裂解试剂包括碱性溶液。在常规碱性裂解步骤中可以采用多种碱，包括，例如，氢氧化盐，如氢氧化钾(K0H)、氢氧化锂(LiOH)或者氢氧化钠(NaOH)。典型地，所述碱为氢氧化钠。通常，在裂解溶液中采用去污剂，其单独使用或者与碱性溶液组合使用。一般而言，以及取决于其应用，所述去污剂可以为阳离子的、阴离子的、非离子的或者两性离子的去污剂或者其组合。一种示例性的阴离子去污剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。一种示例性的两性离子的或者非离子的去污剂为Tween20。用于裂解细菌细胞的机械方法包括搅拌，超声，离心，冷冻/解冻，弗氏细胞压碎器等等，其单独使用或者与裂解溶液及试剂组合使用。用于裂解细菌细胞并释放和提取蛋白质及核酸的碱性裂解以及机械技术通常是公知的，并且描述于如前文的Sambrook等人的。在一些实施方案中，可能期待形成澄清的裂解液制备物，其中宿主细胞的染色体DNA、蛋白质以及膜部分已经至少部分地去除了，如通过裂解液的化学处理或者离心，从而留下含有质粒DNA的溶液。可选地可以在步骤中不同的点加入RNA酶，以产生澄清的、基本上不含RNA的裂解液。如本文另外地记载的，开始多种细胞的和核酸污染物的去除可以改进荚膜异多糖酸的消化和/或质粒DNA使用常规层析技术的进一步的纯化。产生澄清的裂解液的方法在本领域内公知。例如，可以通过使用氢氧化钠或者其等价物(0.2N)以及十二烷基硫酸钠(SDS) (1%)来处理宿主细胞，离心并丢弃上清液。产生澄清的裂解液的此方法通常描述于，例如 Burnboim 等人的 Nucl.Acids Res., 7, 1513 (1979)；以及 Horowicz 等人的 Nucl.Acids Res.，9，2989 (1981)。对于许多用途，例如治疗用途如用于基因疗法或者疫苗的形成，可能期待在样品与荚膜异多糖酸降解多肽接触之前或之后，进一步纯化得自细菌或者其他裂解液的核酸。在如前所述形成细菌裂解液之后，在使用所述多肽尝试消化荚膜异多糖酸之前，通常优选地使粗裂解液经过分离技术，以消除至少部分的存在的其他核酸、蛋白质以及细胞污染物。因此，在一个实施方案中，例如，在使用多肽处理之前，将含有生物物质的材料或者组合物与离子交换层析材料组合。典型地，所述层析材料为阴离子交换层析树脂。在优选的实施方案中，所述阴离子交换层析树脂包括二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)。一般来说，常规的DNA，包括质粒DNA，可以采用清除技术。生物材料也可以在使用多肽处理后与层析材料组合。这通常地涉及亲和层析和/或疏水相互作用层析。在特定的实施方案中，生物材料或者含水组合物与阴离子交换层析树脂组合，使用多肽处理，与亲和层析树脂组合，与疏水相互作用层析树脂组合，并经历过滤，以该顺序。一旦所述生物材料经过裂解或者制备，该材料使用本文描述的多肽处理。典型地，处理涉及使多肽与生物材料接触或者混合，从而该多肽到达该材料或者组合物中存在的荚膜异多糖酸底物。优选地，将所述生物材料及所述多肽孵育，以使所述酶以及荚膜异多糖酸底物之间能够充分 地相互作用。典型地，该孵育可以持续I到6个小时，6到12个小时，12到24个小时，或者更长，其取决于所消化的样品的尺寸，所使用的多肽的量，以及环境因素，所述环境因素如温度、气氛等等。该孵育通常在0° C至100° C的温度下进行，更优选地在25° C至75° C (例如30° C至50° C)。在一些实施方案中，可以期待在孵育过程中改变温度，例如在较冷的温度下开始该孵育，并随后在剩余的孵育循环中升高温度，或者反过来。如前文所记载的，通常期待在使用本发明的多肽处理之前或者之后，纯化所述生物材料或者含有生物材料的含水组合物。一般来说，这可能涉及使所述材料或者组合物经历一个或者多个层析方法或者进行过滤。在一个实施方案中，采用层析分离的组合。因此例如，可以在该方法中的不同时间将所述生物材料或者组合物与层析材料组合。适用的层析材料包括，例如，除了一系列其他的之外，离子交换层析树脂(例如阴离子交换层析树脂以及阳离子交换层析树脂)、疏水相互作用层析树脂以及亲和层析树脂。在一个实施方案中，所述层析材料选自阴离子交换层析树脂，阳离子交换层析树脂，疏水相互作用层析树脂及亲和层析树脂。如前文所记载的，所述生物材料或者组合物可以在使用多肽处理之前或之后，或者处理之前以及之后与层析材料(或者多种层析材料)组合，其采用单次的或者多次层析分离。例如，所述样品可以与层析材料组合，使用本文描述的多肽处理，然后经历第二次(或者第三次、第四次、第五次等等)层析步骤。除此之外，所述样品可以经历常规的过滤技术，从而进一步地纯化或者从所述样品中去除污染物。所述过滤步骤可以在所述方法中相对早地进行，例如在使用酶处理之前，或者在所述方法中更晚地进行，例如作为最终产品的储存或者使用之前的最终过滤步骤。在另一个方面，因此，本发明的方法包括能够降解存在于细菌裂解样品中的荚膜异多糖酸的多肽的用途，所述用途为至少一个额外的层析技术之前或者之后。所述额外的层析步骤可以可选地存在，或者典型地作为一个或多个最终的纯化步骤存在，或者至少在样品或者质粒纯化方案的结尾或者接近结尾存在，或者在荚膜异多糖酸消化步骤之前。因此，优选一次或者多次离子交换层析、亲和层析(如硼酸盐亲和层析)、疏水相互作用层析以及过滤与所述荚膜异多糖酸降解步骤结合。其他的技术可以包括凝胶渗透或者尺寸排阻层析、羟磷灰石(I型和II型)层析以及反相层析。一般来说，任意可用的涉及核酸分离的层析步骤以能改变以应用。除此之外，任一个或者多个步骤或者技术中可以采用高效层析技术或者系统。因此，本发明的方法包括荚膜异多糖酸消化步骤，所述步骤具有一个或者多个离子交换层析步骤，并可以进一步包括亲和层析、疏水相互作用层析或者凝胶渗透层析和/或过滤(如切向流过滤(TFF)或者尺寸排阻过滤)。离子交换层析的步骤，例如可以用于流化床离子交换层析以及轴向和/或径向高分辨率阴离子交换层析中。在一个优选的实施方案中，在荚膜异多糖酸降解步骤之前进行离子交换层析，从而去除可能妨碍酶与底物相互作用的颗粒。本发明在此描述的方法，例如用于纯化质粒DNA的方法，是可扩展的，并因此可以修改放大到大规模生产。在本发明的一些实施方案中，荚膜异多糖酸降解步骤可以与额外的纯化步骤组合，以产生含质粒DNA的高纯度产品。其可以例如，与至少一种絮凝物去除(如裂解液过滤、沉降或者离心)、离子交换层析(如阳离子或者阴离子交换)以及疏水相互作用层析组合。在一个实施方案中，所述荚膜异多糖酸降解步骤在离子交换层析之后。在这些以及其他的实施方案中，所述荚膜异多糖酸降解步骤在疏水相互作用层析之前。在优选的实施方案中，细菌裂解之后为离子交换层析，离子交换层析之后为亲和层析(例如，使用硼酸盐或者其他的连二醇或者顺式二醇特异的化合物)，其随后为疏水相互作用层析。在一个或者多个这些步骤之后或者之间，可以使样品经历过滤，例如切向流过滤。这些步骤使得可真实地扩展的质粒生产方法成为可能，该方法能够产生大量的具有高纯度水平的质粒DNA。宿主细胞DNA及RNA、蛋白质、内毒素及荚膜异多糖酸污染物优选地为不可检测的。如前文所记载的，本发明的方法也可以使用进一步的步骤，所述步骤为尺寸排阻层析(SEC)、反相层析、羟磷灰石层析和/或其他可用的层析技术、方法或者系统，根据本申请，以上与本文描述的步骤相组合。可以采取絮凝物去除步`骤，从而为所得到的质粒DNA产物带来更高的纯度。该步骤可以用于去除一大部分的沉淀材料(絮凝物)。一种实施絮凝物去除的机理是通过裂解液过滤步骤，如通过I到5_，优选地3.5mm的栅格过滤器，随后以深层过滤作为精制过滤步骤。实施絮凝物去除的其他方法为通过离心或者沉降。可选地，所述絮凝物可以通过离子交换层析去除。因此，在内毒素去除和/或质粒DNA纯化过程中的不同时间，可以使样品经历一次或者多次离子交换层析(如阴离子或者阳离子交换层析)、亲和层析、疏水相互作用层析以及过滤(如通过0.2 y m和/或0.45 y m的滤器过滤)以及可选地，过滤或者经历层析方法第二次、第三次或者第四次或者更多次。因此，例如，可以使所述样品经受第一次层析材料，使用多肽处理，经受第二次层析材料，然后经受第三次层析材料。该样品也可以在该顺序的不同时间进行过滤，例如在第一次层析分离之后，或者在第三次层析分离之后。应当认识到，使所述样品经受第一次层析材料也涉及将想要的样品的部分(例如含有纯化的质粒DNA的部分)从层析材料上洗脱，并丢弃样品不想要的部分。取决于所述层析材料的性质，想要的部分可能留在层析材料中并在不同的步骤中洗脱，而不想要的材料在该材料上流过，或者不想要的材料可能留在层析材料中而想要的部分在该层析材料上流过。在上述过程的不同位置，有利地对核酸产量和纯度进行分析测定。典型地，该测试在各个纯化步骤之前和之后对例如来自制备型离子交换层析或者过滤的各个含有核酸的组分进行。进行这些分析测定的代表性方式包括纯度的HPLC分析、产量的分光光度法测定，用于蛋白质分析的银染以及SDS-PAGE以及用于DNA分析的琼脂糖凝胶电泳以及DNA印迹。在特定的实施方案中，本文描述的方法产生纯化的浓度，其中质粒DNA浓度(包括例如主要为超螺旋的或者其他的质粒DNA)为大约70%，75%, 80%, 85%, 90%, 95%以及优选地99%，或更大。除此之外，通常也期待分析测定中间产物以及最终产物中多糖的存在，所述多糖如荚膜异多糖酸、糖醛酸和/或岩藻糖。对于荚膜异多糖酸及其他的多糖适用的测试本文另外描述(例如在实施例16中)。下文中进一步地详细描述了特定的层析以及过滤技术。离子交换层析。 如前文所记载的，离子交换层析可以用于在使用多肽处理之前或者之后纯化所述生物样品。该方法通常地在生物裂解液中或者裂解液衍生物中，将核酸例如质粒DNA从污染性内毒素、痕量蛋白质及残留的细胞污染物中分离。阳离子或者阴离子交换可以选用，其取决于污染物的性质以及溶液的pH。例如，阴离子交换层析通过将负电性的(或者酸性的)分子结合于正电性的支持物上起作用。离子交换层析的应用，随后，使得分子能够基于其电荷而被分离。分子的各种类(酸性、碱性以及中性)可以容易地通过该技术分离。可以采用分步的洗脱方案，其中多种污染物在早期组分中洗脱，而所述质粒DNA在随后的组分中洗脱。离子交换层析对于从质粒DNA 制备物中去除蛋白质以及内毒素是相对地常见的方法。使用的所述离子交换层析或者任意一种或者更多种其他层析步骤或者技术可以采取固定相、置换层析法方法、模拟移动床技术和/或连续床柱或系统。能够用于本发明的方法中的离子交换柱包括阳离子以及阴离子离子交换柱。在更优选的实施方式中，所述离子交换层析材料为阴离子交换层析树脂。例如，所述阴离子交换层析材料树脂可以包括二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、季氨基乙基(QAE)或者聚乙基亚胺基(PEI)树脂。在一个实施方案中，所述阴离子交换层析树脂包括DEAE。在另一个实施方案中，所述阴离子交换层析树脂包括季铵树脂。例如，可以使用一种或者多种本文描述阴离子交换层析树脂填充层析柱。柱的最优容量按照经验，基于所使用的树脂以及纯化的核酸的大小决定。对于多种质粒DNA，优选的树脂为没有孔的或者具有大
的孔尺寸的(例如大于1000A，优选地约3000人到4000人),具有中等的珠子尺寸的(例如，约20到500 u m的直径)，其不浸出基质组分的那些。理想地，该树脂是可洗涤的，如使用氢氧化钠洗涤，从而允许重复的使用。也可以使用相对弱的阳离子及强的阳离子交换柱。相对强的阳离子交换柱典型地具有聚羟基化的聚合物涂布的、并通过丙磺酸基、由丙磺酸基功能化的葡聚糖基质功能化的表面，或者具有聚羟基化的聚合物涂布的表面，所述聚羟基化聚合物由乙磺酸基功能化。使用各个的这些材料的强阳离子交换柱的实例除了别的之外，分别包括POROS HS 、POROSS 以及SP-Sephadex 柱。相对弱的阳离子交换柱典型地具有葡聚糖基质，该基质由羧甲基或者由羟基功能化的丙烯酸基质功能化。使用各个的这些材料的弱阳离子交换柱的实例除了别的之外，分别包括CM-S印hadex 以及BiO-Rex70TM。在本发明的方法中，也可以使用相对弱的阴离子及强的阴离子交换柱。弱的阴离子交换柱典型地具有聚乙烯亚胺(所述聚乙烯亚胺能够表面离子化到PH为约9)、含有磺酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物或者葡聚糖基质(其由二乙基氨基功能化)涂布的表面。使用各个的这些材料的弱阴离子交换柱的实例除了别的之外，分别包括POROSPI 柱、DOWeX50 柱以及DEAE-Sephadex 。相对强的阴离子交换柱典型地具有季铵化的聚乙烯亚胺涂布的表面，其具有离子化的表面，pH为约I到约14。该强阴离子交换柱的实例为POROS HQ 柱或者SOURCE 柱。用于前文列出的柱的树脂可得自Amersham/Pharmacia (Piscataway，N.J.), PerSeptive Biosystems(Foster City,Calif.), TosoHaas (Montgomeryville, Pa.), GE Healthcare (Piscataway, NJ),以及其他供应商。典型地，所述样品与存在于柱中的离子交换层析树脂组合。所述柱可以为0.5ml的柱，1.5ml的柱，IOml的柱，20ml的柱，30ml的柱，50ml的柱，IOOml的柱，200ml的柱，30ml的柱，400ml 的柱，500ml 的柱，600ml 的柱，700ml 的柱，800ml 的柱，900ml 的柱，1000ml( 1L)的柱，2000ml (2L)的柱，20L的柱，30L的柱，40L的柱，50L的柱，60L的柱，70L的柱，80L的柱，90L的柱，100L的柱，或者具有大于100L的体积的柱，以及任意其他具有前面列出的体积之间的容量的柱。典型地，所述离子交换层析材料在使用前平衡，所述平衡在pH从约6.0到约7.2，以及盐浓度为从约IOOmM到200mM进行。因此，所述柱可以在pH为约6.0，6.1,6.2,6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1, 7.2或者任意其他这些pH值之间的pH下，以及在IOOmM, 125mM, 150mM, 1·75mM, 200mM或其他位于前面列出的盐浓度数值之间的任意浓度下进行。能用于平衡所述层析材料的通常使用的盐包括NaCl，KCl或者其他任意的能够调节到与KCl的离子强度匹配的盐。对于离子交换层析而言，填充材料以及用于制备该材料的方法，以及制备的过程，聚合及使阴离子及阳离子交换层析功能化，以及从中洗脱及分离质粒DNA在本领域中为公知的。除此之外，可以使用二价金属离子的螯合剂，如，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，用于抑制质粒由于DNA降解酶的降解，所述降解酶在大肠杆菌的裂解液中。对于二价金属离子的螯合试剂的浓度优选地为0.1到lOOmM。当将目标蛋白质施用到阴离子交换基质上，可以采用任意合适的基质，所述基质包括但不限于氨基乙基、二乙基氨基乙基、四级氨甲基、四级氨乙基、二乙基-(2-羟丙基)氨基乙基、三乙基氨基甲基、三乙基氨基丙基以及聚乙烯亚胺交换齐U，从而达到目标蛋白质的过滤。商业上可得的阴离子交换剂的实例包括，纤维素离子交换剂如DE32及DE52 (WHATMAN, Florham Park, N.J.),葡聚糖离子交换剂如DEAE-SEPHADEX C-25, QAE-SEPHADEX C-25, DEAE-SEPHADEX C-50 以及 QAE-SEPHADEXC-50 (Pharmacia, Piscataway, N.J.),琼脂糖或者交联的琼脂糖如DEAE BIO-GEL A (BIO-RA
D,Hercules, Calif.)，DEAE-SEPHAROSE CL-6B 以及 Q-SEPHAROSE Fast Flow (Pharmacia)，合成的有机聚合物如MONO Q (Pharmacia) ,DEAE-5-PW以及HRLC MA7P (BIO-RAD)以及涂布的二氧化硅基质如DEAE Si5500及TEAPSi 100。期待地，所述阴离子交换基质在非常低的盐浓度下平衡，并在碱性PH (例如pH8.0到11.5)下使用，从而促进酸性和弱碱性的污染物的
彡口口 当将目标蛋白质施用于阳离子交换基质时，预期可以采用使用羧甲基、磺酸盐、磺乙基或者磺丙基基团功能化的任意基质。期待地，所述阳离子交换基质在酸性的pH (例如pH3.0到6.5)平衡和使用以促进碱性和弱酸性的污染物的结合。商业上可得的阳离子交换剂的实例为，基于纤维素的CM23，CM32以及CM5 2 (WHATMAN);基于葡聚糖的 CM-SEPHADEX C-25, SP-SEPHADEX C-25, CM-SEPHADEX C-50 以及 SP-SEPHADEXC-50 (Pharmacia);基于琼脂糖或者交联琼脂糖的 CM BIO-GEL A (BIO-RAD), CM-SEPHAR0SEFast Flow and S-SEPHAROSE Fast Flow (Pharmacia);基于合成的有机聚合物的 MONOS (Pharmacia)，SP-5-PW 和 HRLC MA7C (BIO-RAD)，以及涂布的二氧化硅基质，如 CM Si300 及SP SilOO0所述样品(例如裂解液或者其衍生物，包括核酸)典型地在加载缓冲液中加载到柱上，所述缓冲液包含比核酸从柱上洗脱的浓度更低的盐浓度。一般地说，在特定的实施方案中，所述盐浓度为从约10到50mS，其取决于所使用的树脂。一般地说，对于较弱的阴离子交换树脂，使用较低电导率的溶液，然而对于较强的阴离子交换树脂，使用较高电导率的溶液。所述柱随后使用几个柱容量的缓冲液洗涤，以去除与树脂弱结合的物质。随后，使用根据常规方法，使用平缓连续的盐水梯度从柱上洗脱各组分，所述方法例如使用Tris-HCl缓冲溶液中高达1.5M NaCl。从柱上收集样品组分。对于中等规模的制备而言(例如从约IOOmg到约3克核酸)，组分典型地为至少50ml到2升，其中预期有核酸峰，在预期的峰后的组分中体积增加。核酸产量及纯度的分析测定对一种或者多种组分施行。除此之外，鲎变形细胞溶解物(LAL)测试(例如检测内毒素的脂类A部分)可以对于各个组分施行，从而测定残留的内毒素和/或其他本文描述的测试可以对各个组分实施，从而测定剩余的多糖污染物水平，例如在各个组分中的荚膜异多糖酸或者相关的多糖(如下文所述)。含有高水平的核酸以及低的内毒素或者低的荚膜异多糖酸的组分可以积累或者保持为分开的组分。如下所述，所得到的核酸样品可以再次过滤(例如，通过0.2 y m的滤器)或者经历进一步的层析技术，其取决于内毒素及多糖的水平及期待的纯度。本文公开的离子交换层析材料的支持基质不是严格的，然而，基于葡聚糖、纤维素、交联葡聚糖、合成的有机聚合物、涂布的二氧化硅或者琼脂糖的支持物基质在本领域中是常规的并适于在此的用途。亲和层析如前文所记录的，亲和层析能够额外地或者可选地采用，以纯化所述的生物样品。本发明的一个特别的方面涉及使用本文描述的多肽的荚膜异多糖酸降解方法，以及使所消化的材料与亲和层析材料组合，以选择性地去除消化的多糖，如荚膜异多糖酸。尤其优选的亲和层析材料对连二醇或者顺式二醇具有亲和性。在一个特别的实施方案中，所述亲和层析材料为硼酸盐层析树脂，如基于硼酸或者基于硼酸盐的树脂。

在基本的方面，所述亲和层析涉及选择性的吸附剂的制备，所述制备通过使分子共价地固定化在适用的不溶的支持物上，所述分子含有可识别的区域，对于进行分离的靶样品，该区域是特异的。所述固定化的化合物通常指配体，以及公认地所述配体与支持物的偶联必须以不影响其被目标识别的能力的方式完成。在配体及要纯化的目标分子之间的亲和性可以通过使含有样品的样品通过含有选择性吸附剂的柱完成，后者样品包括目标分子。随后通过使用缓冲液洗涤柱完成纯化，所述缓冲液用于将不需要的材料从吸收性基质中释放，随后将吸收的目标分子洗脱。通过将一定体积的生理缓冲溶液，例如PH约7.2的磷酸盐缓冲液通过该柱完成洗涤。在洗涤步骤中所使用的缓冲液的体积不应该大到使目标分子损失的地步，然而从另一方面来说，也不应该有限到不去除杂质的地步。洗脱是将目标分子从柱上去除的步骤，其通过溶剂进行，所述溶剂减少目标分子与配体的亲和性或者配体-靶分子复合物的分子与固体支持物的亲和性。与抗原偶联的抗体的洗脱可以通过盐梯度以改变PH ;缓冲的步骤梯度以改变离子强度；或者其他方法完成。理想的固体支持物或者基质应该具有几个性质，包括大孔性、机械稳定性、容易活化、疏水性以及惰性，也即低的特异性吸收。在这些全部的方面中，没有基质是理想的；基质通常按照经验确定。本领域技术人员通常使用的亲和层析基质包括交联葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺，纤维素，二氧化硅以及聚(甲基丙烯酸羟乙酯)。对于免疫吸附而言，珠状的琼脂糖由于其高的蛋白质吸收能力、高孔性、亲水性、化学稳定性、缺少电荷以及对于非特异性吸收的相对惰性，通常地为本领域技术人员优选的固体支持物。配体可以物理地吸附到基质上，或者共价地与含有羟基或者氨基的聚合物基质通过双官能的试剂连接。连接通常需要两步:基质的活化和配体与活化的基质的偶联。活化的基质是商业上可得的。将配体偶联到基质上的选择性方法部分地由基质的选择决定，部分地由配体的选择决定。在用于样品施用的制备中，用于平衡亲和柱的特异性的缓冲条件应该反应所使用的作用体系的特异性质。所使用的缓冲液的性质，包括其PH及离子强度，应该对于所述配体-靶分子体系是最优的。应用于柱的目标样品应该优选地包含于与用于平衡柱一样的缓冲液中。在样品施用以及吸附之后，柱可以使用开始的缓冲液洗涤以去除任何未结合的样品及任何杂质。随后将柱用与开始的缓冲液不同的缓冲液洗涤也是常见的，其用于去除非特异性吸附的物质。 靶分子的洗脱可以通过多种方法完成，其包括但不限于在此所列出的这些。典型地，缓冲液的条件可以变化，从而结合复合物的亲和充分地下降，从而破坏彼此或者与固体支持物的有效结合。这通过改变缓冲液的PH或者离子强度，或者两者，或者通过离液序列高的离子，例如氰酸盐来实现。可以通过梯度洗脱获得增强的分离。适用的洗脱方法包括使用:离液序列高的试剂如KSCN ;有机溶剂如乙二醇、DMSO或者乙腈；变性剂，如8M尿素或者6M鸟嘌呤；电泳洗脱；压力引发的洗脱以及金属离子洗脱。不完全的洗脱导致产品的损失以及柱容量的损失。理想地，洗脱条件应该在一个或者两个柱体积通过柱之后，实现产品的完全洗脱。亲和层析的详细讨论可以见于Handbook of Affinity Chromatography, DavidS.Hage(ed.)CRC Press(2006)和 Affinity Chromatography:A Practical Approach,编辑为 Dean P.D.G., Johnson, ff.S., Middle, F.A., Affinity Chromatography, Principlesand Methods,由 Pharmacia 出版,(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden),以及 Immunoaffinity Purification:Basic Principles and OperationalConsiderations, Yarmush, M.L,等人，(1992) Biotech Adv.，10:412-446。用于亲和层析的配体在结构上及生物学上与所要纯化的靶分子紧密联系。出于本发明的目的，可以采用任何适用的亲和层析材料及其配体，从而将目标样品(如质粒DNA)结合并洗脱。一般地说，这进行对每个情况特异的配体的选择。优选地，用于亲和层析材料的配体对于二醇复合物具有特异性，其优选地为连二醇或者顺式二醇。多糖，例如，如荚膜异多糖酸含有连二醇复合物。在特别地优选的实施方案中，所述亲和层析材料为硼酸盐亲和层析材料。硼酸盐亲和柱首先被Weith等人，Biochemistry9, 4396-4401，1970用于糖和核酸组分的分离；此后，该技术用于广泛范围的顺式二醇化合物的分离，所述化合物包括核苷、核苷酸、碳水化合物、糖蛋白以及酶。一般来说，硼酸与顺式二醇之间的作用机理涉及硼酸盐在碱性条件下的羟基化；所述硼酸盐从三角形共面形式变为四面体硼酸盐阴离子，其随后能够与顺式二醇形成酯。所得到的酯可以在酸性条件下水解，从而将此反应逆转。其他的用于制备连二醇的方法描述于 Barry 等人的，Australian J.Chem.37, (1984) ；Gable, 0rganometallicsl3(6), 248688(1994) ；Liu,J.Microbial Methods29, 85-95(1997)Kinrade 等人，DaltonTrans-37I3-37I6(2OC)3)；以及 Zhao 等人的，AnalyticalSciences, 22(5)，747(2006)中。用于本方法中的亲和层析材料的适用的硼酸盐配体包括，例如3-氨基苯基硼酸(3aPBA)，2-(((4-二羟硼基苯基)-甲基)乙基氨基)乙基，2-(((4-二羟硼基苯基)-甲基)二乙基氨基)乙基，P_( -氨基乙基)苯基-硼酸盐，聚(对乙烯基苄基硼酸)，N- (4-硝基-3-二羟基硼基苯基)琥珀酸，4-(N-甲基)羧酰胺-苄基硼酸)，3-硝基-4-羧酰基苄基硼酸，2-硝基-3-琥珀酰胺基-苄基硼酸以及3-琥珀酰胺基-4-硝基苄基硼酸等等。一种优选的硼酸盐配体为3-氨基苯基硼酸(3aPBA).
本文公开的用于亲和层析材料的一类支持物基质包括硼酸盐亲和层析材料，这不是严格的，然而基于葡聚糖、纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅、聚苯乙烯以及聚甲基丙烯酸酯的支持基质在本领域中是常规的，并适用于本文应用。硼酸盐亲和基质在多个商家处可以商业上得到，包括例如Sigma-Aldrich Inc.(硼酸凝胶；聚甲基丙烯酸酯支持物)(间氨基苯基硼酸-丙烯酸酯；丙烯酸珠支持物);Bio-Rad(AfT1-GeieOl ;聚丙烯酰胺支持物)fierce (免疫的硼酸凝胶；聚丙烯酰胺支持物)；以及Tosoh (间氨基苯基硼酸-琼脂糖；琼脂糖支持物)(TSKgel硼酸盐-5PW柱；聚甲基丙烯酸酯支持物)。其他提供硼酸及其衍生物的公司包括 Denisco (Hyderabad, India)以及 Synthonix Corporation (WakeForest, NC)。描述于美国专利N0.5，969，129 (在此以其全文结合作为参考)中的含有硼酸盐基团的聚合物凝胶也可以使用。用于硼酸盐亲和层析的原理、理论及设备也描述于Boronate Affinity Chromatography, Chapter8, pages215-230, Handbook of Affinity Chromatography, DavidS.Hage (ed.) CRC Press (2006)。疏水相互作用层析法在采用了疏水相互作用层析(HIC)材料和方法的实施方案中，这些层析方法通常地采用基质上的疏水 部分吸引用于纯化的样品中分子的疏水区域。一般来说，HIC支持物要通过聚集效果起效，典型地，当这些分子结合的时候，，没有共价键或者离子键形成或者共享。疏水相互所用层析是有利的，这是由于其至少部分地去除开环的质粒形式以及其他污染物，如基因组DNA、RNA以及内毒素。出于本发明的目的，可以采用任何适用的疏水相互作用基质，用于目标样品(如质粒DNA)结合并洗脱。该疏水相互作用基质包括，但不限于天然的或者人工的表面，所述表面含有无电荷的基团，如甲基、乙基或者其他烷基基团。这些基团与蛋白质形成疏水键，所述蛋白质通过基质，并导致多核苷酸和/或多肽的分离，该分离基于所述多核苷酸和/或多肽与基质基团之间的相互作用的强度。树脂材料的疏水性程度可以根据培养基中的盐浓度或者洗脱液中的盐浓度而变化。疏水相互作用柱通常地包括基础基质(例如交联的琼脂糖或者合成的共聚物材料)，疏水性的配体(如烷基或者芳基)偶联于其上。优选的疏水相互作用层析树脂通常地包括2到20个碳原子长的烷基部分(如4到18个碳原子或者6到15个碳原子)，其典型地是未取代的。用于疏水相互作用层析的基体材料的孔直径通常在500到4000A,然而其可以在所述的范围内，根据要分离的样品及其组分的分子尺寸进行适当的选择。一般来说，由于核酸在填充材料上的保留以及吸附能力可能根据孔直径变化，优选地对于具有相对地大的分子尺寸的核酸使用具有相对地大的孔直径的基体材料，而对于具有相对地小的分子尺寸的核酸使用具有相对地小的孔直径的基体材料。疏水相互作用层析可以在低压或者高压下进行，其中所述柱在含水缓冲液的存在下使用相对高的盐浓度(如1.2到1.7M硫酸铵)平衡，并在含水缓冲液的存在下使用相对低的盐浓度(如从1.2M到0.5M降低的硫酸铵梯度)洗脱。因此，多核苷酸以及多肽根据与基质上的疏水基团之间疏水相互作用的不同强度洗脱，也即按照蛋白质疏水性提高的顺序。用于相对低压的应用的商业上可得的疏水相互作用基质的例子包括phenyl SEPHAR0SE(Pharmacia)以及丁基、苯基以及醚T0Y0PEARL650系列树脂(Toso Haas)。其他的商业上可得的疏水相互作用 层析树脂包括Phenyl SEPHAR0SE6FAST FLOW 柱，其具有低度或者高度的修饰(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden) ；Phenyl SEPHAROSE HighPerformance column(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden) ；0ctyl SEPHAR0SE HighPerformance column(Pharmacia LKB Biotechnology, AB,Sweden) ；FRACT0GEL EMDPropyl 或 FRACT0GEL EMD Phenyl columns(E.Merck, Germany) ；MACRO-PREP Methyl或 MACRO-PREP t-Butyl Supports (Bio-Rad, California);以及 WP H1-Propyl(C3) column (J.T.Baker, New Jersey).再其他的商业上可得的疏水相互作用层析树脂为可得自Sigma-Aldrich, Inc (St.Louis, MO)的(例如，TSK-GEL Butyl-NPR ； TSK-GEL Ether-5Pff ； TSK-GEL Phenyl-5PW ;其各个及其他可能具有多种颗粒尺寸)，GEHealthcare (Piscataway, NJ)(例如，HiScreen Phenyl FF (high or low sub) ；HiScreenButyl FF ；HiScreen Butyl-S FF ；HiScreen OctylFF)。从疏水相互作用基质的洗脱可以按照分步的或者线性梯度来进行。适用的洗脱缓冲液在现有技术中是公知的。适用的柱的尺寸与离子交换层析材料一起描述于前文。类似地，本文公开的疏水相互作用层析材料的支持物基质不是严格的，然而，基于葡聚糖、纤维素、交联琼脂糖、合成的有机聚合物、涂布的二氧化硅或者琼脂糖的支持物基质在本领域中是常规的并适于在此的用途。用于疏水相互作用层析的基体材料的合成以及用于制备、聚合及功能化疏水相互作用层析及洗脱和分离如质粒DNA样品的方法在现有技术中是公知的，并尤其描述于美国专利N0.6，441，160以及美国专利N0.7，169，917中(其各自在此以其全文结合作为参考)。过滤根据特定的优选实施方案，也可以进行一次或者多次过滤、超过滤或者渗滤步骤，包括切向流过滤。通过尺寸排阻滤器的过滤可以用于至少部分地去除内毒素及其他污染物，而导致最小程度上的核酸损失。对于多种应用，例如可能期待进一步地纯化样品(如质粒DNA)，降低所得的样品的盐浓度，将所述样品浓缩，和/或将缓冲液换为更适宜的缓冲液用于随后应用。对于治疗上的应用，如在基因疗法中的应用，可以期待将得自切向流过滤或者其他步骤的核酸进一步地纯化。可以进行一次或者多次(开始或最后)的过滤、超过滤或者渗滤，从而通常地获得该结果(或者多种结果)。如果期待，可以将更小的MWCO超过滤膜用于随后的或者最终的渗滤步骤，而不是此前用于开始的纯化，由于核酸典型地在稍后的阶段是高度纯化的，以及主要地小的溶解质分子通过膜进入滤液中。对于多种质粒DNA中，例如，可以使用10，000到100，000MWC0或者更大的膜。具有约100，000MWC0的膜的空纤维设备是常用的，尤其当处理浓缩的核酸溶液时，这是由于更小的滞留容量，增加的流量，更高的产量以及更短的处理时间。根据本领域已知的标准技术，标准的，商业上可得的过滤及渗滤材料适用于此方法中。细微颗粒尺寸的污染物从流体中的过滤已经通过使用不同的多孔滤器介质完成，污染的组合物通过所述介质，从而滤器留下污染物。污染物的滞留可以通过机械过滤或者电动的颗粒捕获及吸附发生。在机械过滤中，颗粒当其试图通过小于其的孔时，被物理捕获而截留。在电动的捕获机制中，所述颗粒与多孔滤器中的表面碰撞，并通过短程吸引力留在表面上。为了实现电动捕获，可以使用电荷修饰的系统以改变滤器的表面电荷特征(参见例如TO 90/11814 )。例如， 要去除的污染物为阴离子的时，可以使用阳离子的电荷改性剂来改变滤器的电荷特征，从而使得污染物被滤器截留。在特定的实施方案中，在过滤之前或者之后，样品使用含有两性离子去污剂的含水溶液进行处理。适用的两性离子剂包括例如EMPIGEN BB (正十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸)，ZWITTERGENT 3-08, ZWITTERGENT 3-10, ZWITTERGENT 3-12，ZWITTERGENT 3-14，ZWITTERGENT 3-16，chaps, CHAPSO 以及其他。在一个优选的实施方案中，所述样品使用切向流过滤进行过滤。用于切向流过滤白勺原理、理论以及设备描述于Michaels, S.L.等人的，"Tangential Flow Filtration^inSeparations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, ff.P.0lson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, 111.(1995).为了将样品通过切向流过滤进行过滤及浓缩，例如，通常选择膜，所述膜具有的分子量截留值(MWCO)基本上低于要保留的分子的分子量。一般的规律是选择的膜具有比要保留的分子的分子量低3到6倍的分子量截留值。装载所述膜，将切向流过滤系统初始化(通常地使用水冲洗并测试水过滤的流速及完整性)，将样品加入，建立切向流，设置进料及保留压强，并收集滤液。当达到期待的浓度或者体积时，停止该过程并回收样品。
一个优选的过滤方法为使用超过滤膜的渗滤，所述膜具有30，000到500，000MWC0的分子量截留值，这取决于质粒的尺寸。该渗滤步骤使得在浓缩之前可以进行缓冲液交换。如前所述地，典型地使用切向流过滤将洗脱液浓缩3到4倍至目标浓度，其中使用例如30kD的膜截留值，该浓度通过渗滤在恒定的体积下进行缓冲液交换，并调节到到目标质粒浓度。所得的质粒DNA溶液可以随后进一步过滤，例如，通过0.2 y m滤器，并典型地分为几个等份，其储存于相对冷的温度(如 0° C)下的容器中，直至进行进一步的处理。附加地或者可选地，所述滤器可以为结合核酸的，同时允许内毒素及其他的污染物通过所述滤器。一旦不想要的材料通过所述滤器，可以将核酸从滤器上洗脱并收集。适用的尺寸排阻滤器可得自多个商业来源,其包括例如Ambion (Austin, TX)，GE Healthcare (Piscataway, NJ), Gelman(Ann Arbor, Mich.), Pall-Filtron (East Hills, N.Y.), Roche (Basel, Switzerland), Sartorius(Edgewood, N.Y.),以及 Thermo ScientificPierce (Rockford, IL)。所使用的滤器是这样的一种:其结合内毒素及其他污染物而允许核酸通过。已经发现了 Pall Ultipor N66S滤器去除几乎全部内毒素而核酸产率高。在一次或者更多次本文描述的层析或者过滤步骤之前，含有核酸的裂解液溶液或者裂解液衍生物也可以预先过滤(如使用0.45iim滤器)。根据前述的规程纯化的DNA要与脂质载体复合以用于基因疗法时，例如，将DNA交换进入低电导率的缓冲液中可能是期待的，其优选地通过渗滤进行。低电导率的缓冲液意味着包括低于IOmS的任意缓冲液，其优选地低于约lmS。除了前文所述的过滤技术外，也可以采用常规的过滤方法(也即尺寸排阻层析材料)° 参见，例如 Gel Filtration Principles and Methods, Edition Al, AmershamBiosciences, 2002。本文描述的多肽可以额外地或者可选地用于多种工业上的过程中，所述过程要求或者受益于荚膜异多糖酸或者其他多糖的消化。一般而言，这可能涉及处理机器、产品和/或洗脱管线及产品、中间产物或者带有本文描述的多肽的流出物，从而例如去除或者防止这些工业过程中导致的腐蚀，污垢或者其他的累积。一个特别的实例是生物膜的去除或者预防(例如，那些含有细菌如革兰氏阴性细菌的)，所述生物膜可能在过程中或者随着时间形成；生物膜及类似的材料可以使通道及导管变窄或者堵塞，或者增加机器部件或者系统的磨损。可以从本文描述的多肽使用中受益的代表性工业上的过程包括，例如，纸及纤维素制造过程，膜重建以及清洁，循环，水-水处理(如需氧固体及泥渣的消化)，石油化学精制及废物修复，高纯度的水过滤及系统，水冷却系统/热交换器，以及食物处理。对于纸或者纤维素处理操作，例如，生物膜可能在中间产物处理液流中形成，其可能不利地影响下游处理和/或影响最终产品的质量。本文描述的多肽可以通过去除、最小化或者预防此类生物膜使该过程受益。多肽如前文所记载地，本发明涉及能够降解荚膜异多糖酸的多肽，所述荚膜异多糖酸可在如生物材料中发现。这可以包括如得自细菌的生物膜或者细菌核酸制备物，所述细菌如大肠杆菌，沙门氏菌或者其他的肠细菌，所述制备物如得自大肠杆菌的质粒DNA。本文描述的多肽也有益地使得高纯革兰氏阴性细菌质粒DNA制备物的制备成为可能。在特定的实施方 案中，所述多肽包括大致地对应于SEQ ID NO:1及其保守的氨基酸替换的氨基酸序列。该多肽通常地对应于全长的荚膜异多糖酸降解多肽，所述多肽具有约84，354道尔顿的分子量。一般而言，所述多肽为分离的多肽。在特定的实施方案中，所述多肽分离自细菌来源的生物体，并经过纯化。典型地，多肽具有至少70%的纯度，该纯度更优选地为至少80%，更优选地为至少90%，更优选地为至少95%，更优选地为至少98%，更优选地为至少99%。本文提供多肽片段。该片段例如当与全长蛋白比较时，可以是在N-端或者C-端截断的，或者可以缺少内部残基。例 如，特定片段缺少对于多肽所期待的活性(例如生物的或其他)并非必需的氨基酸残基。在一个特定的实施方案中，所述多肽包含大致地对应于SEQ ID NO:2及其保守氨基酸替换的氨基酸序列。该多肽大致地对应于全长多肽的截短的形式，其中缺少全长多肽(SEQ ID NO:1)的开头的106个氨基酸。除了本文描述的全长的及截短的多肽，还考虑了可以制备多肽变体，例如通过向多肽DNA中引入合适的核苷酸变化，和/或通过期待的多肽的合成，或者通过分离和纯化具有荚膜异多糖酸降解活性的变体多肽。本领域技术人员应意识到氨基酸的变化可能改变该多肽特定的翻译后加工，如改变糖基化位点的数量或位置或者改变膜锚定的性质。本文描述的多肽全长和/或截短序列中的或者在各种结构域中的变化可以使用例如任意的技术和准则制造，所述技术及准则用于保守的和非保守的突变，其于文献中列出(例如美国专利N0.5，364，934 (以其全文在此结合作为参考))。变化可以为替换，删除或者插入一个或多个用于编码多肽的密码子，与天然序列多肽相比，其导致多肽氨基酸序列的变化。可选地，所述变化通过将一个或者多个功能域中至少一个氨基酸替换为任意其他的氨基酸。确定哪个氨基酸残基可以插入、替换或者删除而不会不利地影响期待的活性的指导能通过比较同源蛋白分子的序列与所述多肽的序列，并最小化高同源性的区域内氨基酸序列变化的数量来建立。氨基酸替换可以通过将一个氨基酸用另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸替换来实现，例如将亮氨酸替换成丝氨酸，即保守的氨基酸替代。插入或者删除可以可选地在约I到5个氨基酸的范围，5到10个氨基酸的范围，10到25个氨基酸的范围，25到50个氨基酸的范围，或者更多，如100个氨基酸或者更多。所允许的变化可以通过以下确定:系统地在序列中产生氨基酸的插入、删除或者替换，然后通过全长的或者成熟的天然序列测试所得到的变体所体现的活性。如前文所记载的，多肽可以为本文描述的全长的或者截短的多肽的变体。通常，多肽变体与本文公开的全长多肽序列(如SEQ ID NO:1)具有至少约80%的氨基酸序列同一性，可选地至少约81%的氨基酸序列同一性，可选地至少约82%的氨基酸序列同一性，可选地至少约83%的氨基酸序列同一性，可选地至少约84%的氨基酸序列同一性，可选地至少约85%的氨基酸序列同一性，可选地至少约86%的氨基酸序列同一性，可选地至少约87%的氨基酸序列同一性，可选地至少约88%的氨基酸序列同一性，可选地至少约89%的氨基酸序列同一性，可选地至少约90%的氨基酸序列同一性，可选地至少约91%的氨基酸序列同一性，可选地至少约92%的氨基酸序列同一性，可选地至少约93%的氨基酸序列同一性，可选地至少约94%的氨基酸序列同一性，可选地至少约95%的氨基酸序列同一性，可选地至少约96%的氨基酸序列同一性，可选地至少约97%的氨基酸序列同一性，可选地至少约98%的氨基酸序列同一性，以及可选地至少约99%的氨基酸序列同一性。对于截短的多肽变体而言，所述多肽变体与本文公开的截短的多肽序列(如SEQID NO:2)具有至少约80%的氨基酸序列同一性，可选地至少约81%的氨基酸序列同一性，可选地至少约82%的氨基酸序列同一性，可选地至少约83%的氨基酸序列同一性，可选地至少约84%的氨基酸序列同一性，可选地至少约85%的氨基酸序列同一性，可选地至少约86%的氨基酸序列同一性，可选地至少约87%的氨基酸序列同一性，可选地至少约88%的氨基酸序列同一性，可选地至少约89%的氨基酸序列同一性，可选地至少约90%的氨基酸序列同一性，可选地至少约91%的氨基酸序列同一性，可选地至少约92%的氨基酸序列同一性，可选地至少约93%的氨基酸序列同一性，可选地至少约94%的氨基酸序列同一性，可选地至少约95%的氨基酸序列同一性，可选地至少约96%的氨基酸序列同一性，可选地至少约97%的氨基酸序列同一性，可选地至少约98%的氨基酸序列同一性，以及可选地至少约99%的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQID NO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID N0:1及其保守的氨基酸替换具有至少99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQID NO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸替换具有至少约98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID N0:2及其保守的氨基酸替换具有至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，示例性的目标保守替换列于表I中。如果该替换导致了生物活性的变化，或者期待的活 性的变化，可以引入更多其它的变化，如描述于下文作为氨基酸类别参考的，并对产品进行筛选。不言而喻的，能够编码该保守替换的密码子在本领域内已知的。表I
权利要求
1.一种用于纯化质粒DNA的方法，所述方法包括使用多肽处理含有质粒DNA的含水组合物以消化荚膜异多糖酸，然后将质粒DNA从经处理的含水组合物中分离； 优选地，所述含水组合物选自粗细菌裂解液、部分纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸的含水溶液； 优选地，所述含水组合物为粗细菌裂解液； 优选地，所述含水组合物为部分纯化的细菌裂解液；或者 优选地，所述含水组合物为含有提取的细菌核酸的含水溶液。
2.权利要求I的方法，其中，所述分离包括将所述经处理的含水组合物与层析材料组合； 优选地，所述层析材料选自阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、疏水相互作用层析树脂及亲和层析树脂；或者 优选地，所述分离包括将所述经处理的含水组合物与亲和层析树脂组合，随后将经处理的含水组合物与疏水相互作用层析树脂组合；更优选地，所述亲和层析树脂包括基于硼酸的或者含有硼酸盐的化合物。
3.权利要求I或2的方法，其中，在使用多肽处理之前预处理所述含水组合物以从含水组合物中部分去除内毒素，所述预处理包括将所述含水组合物与层析材料组合； 优选地，所述层析材料为阴离子交换树脂；以及 更优选地，所述阴离子交换树脂包括季铵树脂。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其进一步包括过滤所述含水组合物以进一步从质粒DNA中分离内毒素； 优选地，所述过滤在从层析材料洗脱经处理的含水组合物之后进行。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中，所述多肽为重组多肽。
6.权利要求I的方法，其中，在使用多肽处理之前预处理所述含水组合物以从含水组合物中部分去除内毒素，所述预处理包括将所述含水组合物与层析材料组合；在使用多肽处理后与亲和层析树脂组合，随后与疏水相互作用层析树脂组合；以及在将质粒DNA从所述疏水相互作用层析树脂上洗脱后，过滤以进一步从质粒DNA中分离内毒素。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述多肽包含与SEQIDNO: I或者SEQ IDNO:2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列； 优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO: I或者SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列； 更优选地，所述多肽为SEQ ID N0:1或者SEQ ID N0:2。
8.权利要求I的方法，其中，所述质粒DNA为革兰氏阴性细菌质粒DNA。
9.一种用于纯化质粒DNA的方法，所述方法包括 Ca)通过将含水组合物与阴离子交换树脂组合预处理含有质粒DNA的含水组合物； (b)使用多肽处理所述经预处理的含水组合物以消化荚膜异多糖酸； (c)将所述质粒DNA从经处理的含水组合物中分离，该分离包括将经处理的含水组合物与亲和层析树脂组合，随后将经处理的含水组合物与疏水相互作用层析树脂组合；以及 Cd)过滤所述质粒DNA ； 优选地，所述阴离子交换树脂包括季铵树脂；优选地，所述亲和层析树脂包括基于硼酸的或者含有硼酸盐的化合物； 优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO: I或者SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列；更优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO: I或者SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列；再更优选地，所述多肽为SEQ IDNO:I 或 SEQ ID NO:2 ； 优选地，所述质粒DNA为革兰氏阴性细菌质粒DNA ;或者 优选地，所述多肽为重组多肽。
10.一种多肽，其包含与SEQ ID NO: I及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列； 优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: I及其保守的氨基酸取代具有至少95%同源性； 更优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: I及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性； 再更优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: I及其保守的氨基酸取代具有至少99%同源性； 具体地，所述氨基酸序列为SEQ ID NO: I。
11.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列； 优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少95%同源性； 更优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性； 再更优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2及其保守的氨基酸取代具有至少99%同源性； 具体地，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
12.权利要求10-11中任一项的多肽，其中，所述多肽为纯化的多肽、重组的多肽或同时为两者。
13.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少90%序列同一性的核酸序列； 优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少95%序列同一性； 更优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少98%序列同一性； 再更优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少99%序列同一性； 具体地，所述核酸序列为SEQ ID NO:7。
14.一种分离的多核苷酸,其包含与SEQ ID NO:8或其互补序列具有至少90%序列同一性的核酸序列； 优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 8或其互补序列具有至少95%序列同一性； 更优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 8或其互补序列具有至少98%序列同一性； 再更优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 8或其互补序列具有至少99%序列同一性； 具体地，所述核酸序列为SEQ ID NO:8。
15.—种载体,其包含权利要求13的多核苷酸,其中，所述载体选自质粒、病毒及曬菌体；优选地，所述载体为质粒或者噬菌体，例如为噬菌体； 优选地，所述核酸序列与SEQ ID NO: 7或其互补序列具有至少99%序列同一性；具体地，所述核酸序列为SEQ ID NO:7 ;或者优选地，所述载体为重组表达载体。
16.—种载体,其包含权利要求14的多核苷酸,其中，所述载体选自质粒、病毒及曬菌体； 优选地，所述载体为质粒或者噬菌体，例如为质粒；或者 优选地，所述核酸序列与SEQ ID N0:8或其互补序列具有至少99%序列同一性；具体地，所述核酸序列为SEQ ID NO:8 ;或者优选地，所述载体为重组表达载体。
17.一种用于消化生物材料中的荚膜异多糖酸的方法，所述方法包括使所述生物材料与能够消化荚膜异多糖酸的多肽接触； 优选地，所述生物材料为细菌粘液；更优选地，所述荚膜异多糖酸存在于细菌的细胞膜中； 优选地，所述生物材料选自粗细菌裂解液、部分纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸的含水溶液； 优选地，所述生物材料为粗细菌裂解液； 优选地，所述生物材料为部分纯化的细菌裂解液； 优选地，所述生物材料为含有提取的细菌核酸的含水溶液； 优选地，所述生物材料为生物膜；或者 优选地，所述多肽为重组多肽。
18.权利要求17的方法，其中，所述多肽包含与SEQID N0:1或者SEQID N0:2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列； 优选地，所述多肽包含与SEQ ID NO: I或者SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列； 更优选地，所述多肽为SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:2。
19.一种用于从含有细菌大分子的含水组合物中去除内毒素的方法，所述方法包括消化所述含水组合物中的荚膜异多糖酸，随后将所述含水组合物与层析材料组合，以从细菌大分子中分离内毒素； 优选地，所述含水组合物得自细菌裂解液； 更优选地，在使用多肽处理之前预处理所述细菌裂解液，以从所述裂解液中部分去除内毒素； 再更优选地，所述预处理包括使所述细菌裂解液与层析材料组合； 进一步优选地，所述层析材料为阴离子交换树脂； 再进一步优选地，所述阴离子交换树脂包括季铵树脂。
20.权利要求19的方法，其中，所述细菌大分子包括质粒DNA； 优选地，所述质粒DNA为革兰氏阴性细菌质粒DNA。
21.权利要求19-20中任一项的方法，其中，通过使用具有荚膜异多糖酸降解活性的多肽处理所述含水组合物来消化荚膜异多糖酸。
22.权利要求19-20中任一项的方法，其中，所述层析材料选自阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、疏水相互作用层析树脂及亲和层析树脂； 优选地，所述亲和层析树脂包括基于硼酸或者硼酸盐的树脂。
23.权利要求19-22中任一项的方法，其进一步包括在从层析材料上洗脱所述生物大分子后过滤所述含水组合物，以进一步从生物大分子中分离内毒素。
24.权利要求19的方法，其中，所述含水组合物首先与亲和层析树脂组合，随后与疏水相互作用层析树脂组合； 优选地，所述亲和层析树脂包括基于硼酸或者硼酸盐的树脂。
25.权利要求19-24中任一项的方法，其中，所述多肽为重组多肽。
25.权利要求19-25中任一项的方法，其中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或者SEQ IDNO:2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列； 优选地，所述多 肽包含与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO: 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列； 更优选地，所述多肽为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
全文摘要
本发明通常涉及高纯质粒组合物及其制备方法，所述高纯质粒组合物具有低的或者不可检测水平的荚膜异多糖酸及其他污染物。也描述了在该方法中有用的多肽。本文描述的方法及组合物具有一系列的用途，包括在生物恐怖主义、环境科学、食品科学、法医学、分子生物学以及健康和医学领域内的各种应用。
文档编号C12N9/24GK103255130SQ201310018399
公开日2013年8月21日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者N·S·坦普尔顿 申请人:格兰达利斯有限公司