专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物源杀菌剂的生产方法，尤其涉及一种利用促生拮抗菌衍 生菌株M18G，构建携带质粒pME6032Phz的基因工程菌株M18G/pME6032Phz，高效生产吩 嗪-l-羧酸的方法。属于微生物源农药生产技术领域。
背景技术：
农作物病害引起的损失幅度约占总产量的25 75%，以我国主要的粮食作物水 稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害平均引起减产10%计，每年造 成经济损失达300多亿元人民币之巨，严重威胁粮食作物的安全生产。目前，生产上控制植 物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。在生产上，目前使用的 大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份 会对人体健康造成潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，有些化学农药 难以分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会和经济的可持续发 展；而且，现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，在努力发展新一代高效、安 全、低毒、对环境相容性好的化学农药的同时，还需要大力研究和发展生物源农药。
1992年，世界环境与发展大会曾经提出，在新世纪之前，生物源农药的使用量要达 到农药使用总量60%的目标。然而，时至今日，作为发达国家的美国还只占15%左右，而我 国约占5% 。目前，与化学农药相比，在生产上已经推广使用的生物源农药，其种类和数量都 较少，有些品种则由于使用年久，引起了植物病原菌的抗药性，防治效果不够理想。以水稻 纹枯病为例，该病害与稻瘟病、白叶枯病列为水稻作物生长过程中常年发生的三大主要病 害，防治该病害的药剂主要依赖于老牌生物源农药井岗霉素。但是，经过将近40年的长时 期地使用，部分水稻纹枯病菌的融合群已产生抗药性；而且，井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有 效，对其他病原菌没有明显的防治效果，使用范围具有很大的局限性。 生物农药促生拮抗菌M18，对植物病害具有高效、安全、广谱的杀菌作用，与环境 相容性好，易于在环境中降解。该促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局 指定的保藏单位北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC NO. 0462。生物农药促生拮抗菌M18的制备和应用，已经获得国家发明专利，专利号为 00119857. 2。但是，生物农药促生拮抗菌M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过M18 活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌实施抑制作用，其合成的活性成 分含量容易受到环境条件的影响。因而，对植物病害的防治效果具有不稳定性的缺陷，难以 在农业生产中进行大规模的推广应用。 已经查明，促生拮抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-l-羧酸，从促生 拮抗菌M18的发酵液中提取吩嗪-l-羧酸，利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治 同样具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征；同时，能克服利用促生拮抗菌M18防治 病害效果不稳定性的缺陷。但是，利用野生型促生拮抗菌株M18，发酵生产吩嗪-1-羧酸的
3产量仅为每升200-300毫克，活性成分的生产成本太高，不具备在农业生产中应用的价值。 近年来，已有运用分子生物学的技术，对促生拮抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的调控机制，开 展深入地研究。运用基因工程手段，对促生拮抗菌M18基因组中的双组分调控基因gacA 开展了定向失活突变，获得了 M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的产量，使其发 酵效价达到每升1500-1700毫克左右。该研究成果的技术方法已经于2004年在《微生物 学报》44巻第761 765页公开，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩 嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。 以吩嗪-l-羧酸为主要成分的微生物源杀菌剂，经我国农药命名单位确认，定 名为申嗪霉素，获得了农业部颁发的农药临时登记证(登记证号为LS20031381)。在名 称为"利用促生拮抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法"的中国发明专利中(专利号 200610023459. 9)，提供一种了利用促生拮抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制备杀菌剂的方 法，利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂，通过两种衍生菌株的代谢产物的 复配，达到提高防治效果的目的，能更加稳定、有效的控制植物病害，对瓜菜经济作物，特别 是对甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治取得了显著成就。但是，我国以及亚洲地区人群的最主 要的粮食作物稻米，是一种低附加值的商品，如果按目前的发酵水平生产申嗪霉素，用于防 治水稻作物病害的成本仍然偏高，仍然难以为粮农所接受并开展大面积的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种利用工程菌株M18G携 带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，用以提高吩嗪-1-羧酸的产量，降低制备杀 菌剂申嗪霉素的成本，有效防治水稻病害。 为实现上述目的，本发明从促生拮抗菌M18基因组中，扩增出吩嗪-1-羧酸生物 合成的编码基因片段phzAl-Gl，并将该基因片段插入表达质粒pME6032中，置于强启动子 Ptac的控制下，构建成重组质粒pME6032Phz ;然后，将该重组质粒pME6032Phz导入促生拮抗 菌M18的衍生菌株M18G中，构建成基因工程菌株M18G/pME6032Phz。该工程菌株在扩增吩 嗪-l-羧酸生物合成的编码基因的拷贝数的同时，实现编码基因的高效稳定表达。最后，基 因工程菌株M18G/pME6032Phz在黄豆粉培养液中培养，高效稳定地生产吩嗪-l-羧酸，使吩 嗪-1-羧酸的产量达到每升5700 6600毫克的水平。
本发明的方法具体包括以下步骤 1、扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因片段(phzAl-Gl) 设计一对引物，引物的核苷酸序列如下 正向5' -ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3， 反向5' -TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3' 序列中下划线为限制性内切酶Kpn I、Bgl II的酶切位点；然后以促生拮抗菌M18
基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，扩增吩嗪_1_羧酸生物合成的
编码基因，扩增产物通过琼脂糖电泳检测，回收长度为6. 8kb的基因片段phzAl-Gl。 2、构建重组质粒pME6032Phz 将回收的基因扩增片段phzAl-Gl，经限制性内切酶Kpn 1、Bgl II酶切，连接酶连 接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-1-羧酸生物合成编码基因的表达置于强启动子Pta。控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆菌；从大肠 杆菌中提取构建的基因重组质粒pME6032Phz。
3、构建基因工程菌株M18G/pME6032Phz 制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述基因重组质粒 pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在28 37。C条件下，培养1 2天，从中筛选出 基因工程菌株M18G/pME6032Phz。
4、基因工程菌株M18G/pME6032Phz的培养 将基因工程菌株M18G/pME6032Phz接种在甘油培养基的平板上，在26 3(TC下， 活化生长20 24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，26 3(TC下活化10 12小 时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升 的三角瓶中，在26 3(TC的摇床中振荡培养9 11小时，摇床转速为160 180转/分； 最后转接到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温 度和转速不变，发酵时间为60 72小时，得到吩嗪-l-羧酸含量为每升5700 6600毫克。
本发明中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为蛋白胨 1. 8 2. 2%、甘油1. 3 1. 7%、硫酸镁0. 05 0. 1%、磷酸二氢钾0. 01 0. 05%、余量为 水，pH 6. 8 7. 2。 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉4. 5 5. 5%、玉米浆1. 4 1. 7%、葡萄糖1. 0 1. 4%、余量为水，pH 6. 5 7. 0。 本发明利用基因工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz，生产吩嗪-l-羧酸的方法的 优点是 1、提高吩嗪-1-羧酸合成基因的拷贝数。将吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因插 入质粒pME6032，导入菌株M18G中，提高了吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因的拷贝数。由 于质粒能在染色体外稳定地独立复制，原先每一个细胞的染色体仅携带2个拷贝的编码基 因，现在由质粒携带后，每一个细胞内的质粒数可达8至10拷贝；因而，吩嗪-l-羧酸生物 合成编码基因的拷贝数也增加了 8至10拷贝。 2、增强并稳定吩嗪-1-羧酸合成基因的表达量。在质粒中，吩嗪-l-羧酸生物合 成的编码基因置于强启动子Pta。的控制下，该启动子的表达活性不受M18G细胞中各种阻抑 因子对吩嗪-1-羧酸合成编码基因表达的控制，大大提高了编码基因的表达量，而且使编 码基因获得了稳定的表达。 3、高效并稳定地合成吩嗪-1-羧酸。在多基因拷贝和高效稳定表达的双重作用
下，基因工程菌株M18G/pME6032Phz经黄豆粉培养液中培养，吩嗪-l-羧酸的合成量达到每
升5700 6600毫克，与原先的衍生菌株M18G相比，发酵效价平均提高2. 6 3. 1倍。 4、降低吩嗪-1-羧酸的生产成本。与衍生菌株M18G生产吩嗪_1_羧酸的葡萄糖
培养液相比，在利用工程菌株M18G/pME6032Phz生产吩嗪_1_羧酸时，所采用的黄豆粉培养
液成分中，玉米浆取代了约三分之二的葡萄糖用量，并且，玉米浆的用量约为所取代葡萄糖
量的50%，同时，玉米浆价格仅为葡萄糖的90%。这样，利用工程菌株M18G/pME6032Phz生
产吩嗪-l-羧酸，在提高发酵效价的前提下，还进一步降低了生产成本。 5、利用本发明构建的高产基因工程菌株生产吩嗪-1-羧酸，制备杀菌剂申嗪霉
素，用于对植物进行喷雾或灌根施用，可防治水稻纹枯病、白叶枯病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各种腐霉和疫霉引起的植物病害。同时，因 大大降低了生产成本，达到应用于防治植物病害的农本要求，利于申嗪霉素在农业生产中 获得大规模推广应用。
图1为本发明中质粒pME6032Phz的构建示意图。
具体实施例方式
以下，通过附图和具体的实施例对本发明的技术方案及技术效果作进一步描述。
以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1 1、扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因片段(phzAl-Gl) 设计一对引物，用以扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因片段(phzAl-Gl)，引 物的核苷酸序列如下 正向5' -ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3， 反向5' -TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3' 序列中的下划线为限制性内切酶Kpn I、Bgl II的酶切位点。该引物委托上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。 然后，以促生拮抗菌M18基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引 物，扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因，产物通过0. 7%琼脂糖电泳检测，回收长度约 为6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)，基因片段的准确性经核苷酸测序验证。其中，所述M18基 因组DNA的制备利用AxyPr印细菌基因组DNA试剂盒进行，基因片段的回收利用AxyPr印 DNA凝胶回收试剂盒进行，均由爱思进生物技术(杭州)有限公司提供，产品目录号分别为 AP-MN-BT-GDNA-4和AP-GX-50 ;所述基因扩增反应的条件以及琼脂糖电泳，分别按照J.萨 姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第 8章第611 618页和第5章第387 400页中所述的方法进行。其中，所使用的DNA聚合 酶LA Taq和基因扩增试剂盒，购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号DRR002AG。琼 脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段(phzAl-Gl)的核苷酸测序验证委托上 海英骏生物技术有限公司完成。
2、构建重组质粒pME6032Phz 将步骤1中回收的基因扩增片段(phzAl-Gl)，经限制性内切酶Kpn I、 Bgl II酶 切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-l-羧酸生物合 成编码基因的表达置于强启动子Pta。控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆 菌。最后，从大肠杆菌中提取构建的基因重组质粒pME6032Phz并验证。
构建的基因重组质粒pME6032Phz如图1所示，含有吩嗪_1_羧酸的生物合成编码 基因的片段经限制性酶Kpn 1、Bgl 1I酶切后，插入质粒pME6032中，并置于强启动子P^ 的控制下，构建成重组质粒pME6032Phz。图中9816bp表示质粒pME6032的长度，为9816 个碱基对；phzAl-Gl为吩嗪-l-羧酸的生物合成编码基因片段；phzM为上游修饰基因；〃 为基因縮短片段的符号；Kpn I、Bgl II为限制性内切酶位点；图中的数字分别表示基因中
6的核苷酸序号，+1为phzAl-Gl生物合成编码基因的转录起始位点。TetA和TetR为质粒 pME6032中的选择标记基因；P^为启动子；T4_32 term为终止子；pl5A origin为质粒的复 制起始位点；LacIQ r印ressor所标志的基因为阻遏蛋白编码基因。 上述基因片段定向插入质粒、感受态大肠杆菌的制备、转化以及重组质粒的提取 和验证分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实 验指南(第三版)》，第1章第68 71页和第96 99页及第8章第663 666页中所述 的方法进行。其中质粒pME6032由瑞士洛桑大学微生物学系Dieter Haas博士提供。限制 性内切酶和插入用的连接酶均购自深圳中晶生物技术有限公司。大肠杆菌中重组质粒的提 取，采用B型少量质粒快速提取试剂盒，由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供， 产品目录号MK014-2。重组质粒的验证所使用的限制性酶、DNA聚合酶LA Taq和基因扩增 试剂盒，均购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH 公司上海代理公司。 3、构建基因工程菌株M18G/pME6032Phz 制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒pME6032Phz 转化到M18G的感受态细胞中，在28t:条件下，培养2天，从中筛选出基因工程菌株M18G/ pME6032Phz。 促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞的制备方法、重组质粒pME6032Phz 转化到M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz 的筛选方法，均按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克 隆实验指南(第三版)》，第1章第96 99页中所述的方法进行。
4、基因工程菌株M18G/pME6032Phz的培养 将基因工程菌株M18G/pME6032Phz接种在甘油培养基平板上，在26。C下活化生 长24小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26t:下活化10小时，然后，将活化的 M18G/pME6032Phz菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在 26t:的摇床中振荡培养9小时，摇床转速为160转/分；最后转接到含有65毫升黄豆粉培 养液、体积为250毫升的特殊三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为 60小时，在发酵液中，获得吩嗪-1-羧酸含量为每升6200毫克。 其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为蛋白胨1.8%、 甘油1. 3%、硫酸镁0. 07%、磷酸二氢钾0. 03%、余量为水，pH7. 0。 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉4.5%、玉米浆1.4%、葡萄糖 1. 0%、余量为水，pH 6. 5。 在此配方下的吩嗪-l-羧酸产量，与促生拮抗菌的衍生菌株M18G的产量相比，提
高了约2.9倍。 实施例2 1、采用与实施例1相同的方法扩增吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因，产物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、将回收的基因扩增片段(phzAl-Gl)，经限制性内切酶Kpn 1、Bgl II酶切，连接 酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-1-羧酸生物合成编码 基因的表达置于强启动子P^控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆菌。最
7后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。 3、制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒 pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在3(TC条件下，培养1天，从中筛选出基因工程 菌株M18G/pME6032Phz。 4、将基因工程菌株M18G/pME6032Phz接种在甘油培养基的平板上，在28°C下活 化生长22小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，28t:下活化11小时，然后将活化 的M18G/pME6032Phz菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在 2『C的摇床中振荡培养10小时，摇床转速为170转/分；最后转接到含有65毫升黄豆粉培 养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为66小 时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸含量为升每6600毫克。 其中，所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为蛋白胨2.2%、甘油1.7%、硫 酸镁0. 05%、磷酸二氢钾0. 01%、余量为水，pH 7. 2。 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉5.0%、玉米浆1.6%、葡萄糖 1. 2%、余量为水，pH 6. 8。 在此配方下的吩嗪-1-羧酸产量，相比促生拮抗菌的衍生菌株M18G，提高了约3. 1 倍。 实施例3 1、采用与实施例1相同的方法扩增吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因，产物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、将回收的基因扩增片段(phzAl-Gl)，经限制性内切酶Kpnl、Bgl II酶切，连接 酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-1-羧酸生物合成编码 基因的表达置于强启动子P^控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆菌。最 后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。 3、制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒 pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在32。C条件下，培养2天，从中筛选出高效生产 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、将利用基因工程技术构建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接种在甘油培养基的 平板上，在3(TC下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，3(TC下活化 12小时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250 毫升的三角瓶中放大，在3(TC的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转 接到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转 速不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸产量为每升5700毫克。
其中，所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫 酸镁O. 1%、磷酸二氢钾0. 05X、余量为水，pH6. 8 ; 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉5.5%、玉米浆1.7%、葡萄糖 1. 4%、余量为水，pH 7. 0。 在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz发酵生产吩嗪_1_羧酸，与促生拮抗 菌衍生菌株M18G的产量相比，提高了约2. 6倍。
实施例4
1、采用与实施例1相同的方法扩增吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因，产物通过
1. 0%琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。 2、将第a步骤中回收的基因扩增片段(phzAl-Gl)，经限制性内切酶KpnI、 Bgl II
酶切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-l-羧酸生物
合成编码基因的表达置于强启动子Pta。控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠
杆菌。最后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。 3、制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒 pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在35。C条件下，培养1天，从中筛选出高效生产 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、将利用基因工程技术构建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接种在甘油培养基的 平板上，在3(TC下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，3(TC下活化 12小时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250 毫升的三角瓶中放大，在28t:的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转 接到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转 速不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-l-羧酸产量为每升6400毫克。;其中， 所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫酸镁0. 1%、磷 酸二氢钾0. 05%、余量为水，pH6. 8 ; 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉5.0%、玉米浆1.7%、葡萄糖 1. 4X、余量为水，pH 6. 8。在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz发酵生产吩嗪-l-羧 酸，与促生拮抗菌衍生菌株M18G的产量相比，提高了约3. 0倍。
实施例5 1、采用与实施例1相同的方法扩增吩嗪-l-羧酸生物合成的编码基因，产物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为6. 8kb的基因片段(phzAl-Gl)。
2、将第a步骤中回收的基因扩增片段(phzAl-Gl)，经限制性内切酶Kpn I、Bgl II 酶切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-l-羧酸生物 合成编码基因的表达置于强启动子Pta。控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠 杆菌。最后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。构建的基因重组质粒pME6032Phz。
3、制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒 pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在37。C条件下，培养1天，从中筛选出高效生产 吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株M18G/pME6032Phz。 4、将利用基因工程技术构建的工程菌株M18G/pME6032Phz，接种在甘油培养基平 板上，在2『C下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，28t:下活化12 小时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫 升的三角瓶中放大，在3(TC的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转接 到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速 不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-l-羧酸产量为每升6000毫克。
其中，所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫 酸镁O. 1%、磷酸二氢钾0. 05X、余量为水，pH6. 8 ; 所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉4.8%、玉米浆1.5%、葡萄糖1. 4%、余量为水，pH 7. 0。 在此配方下利用工程菌株M18G/pME6032Phz发酵生产吩嗪_1_羧酸，与促生拮抗 菌衍生菌株M18G的产量相比，提高了约2. 8倍。
权利要求
一种利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于包括如下步骤1)设计一对引物，引物的核苷酸序列如下正向5’-ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3’反向5’-TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3’序列中下划线为限制性内切酶Kpn I、Bal II的酶切位点；然后以促生拮抗菌M18基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因，扩增产物通过琼脂糖电泳检测，回收长度为6.8kb的基因片段phzA1-G1；2)将回收的基因扩增片段phzA1-G1，经限制性内切酶Kpn I、Bgl II酶切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-1-羧酸生物合成编码基因的表达置于强启动子Ptac控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆菌；从大肠杆菌中提取构建的基因重组质粒pME6032Phz；3)制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述基因重组质粒pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在28～37℃条件下，培养1～2天，从中筛选出基因工程菌株M18G/pME6032Phz；4)将基因工程菌株M18G/pME6032Phz接种在甘油培养基的平板上，在26～30℃下，活化生长20～24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，26～30℃下活化10～12小时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26～30℃的摇床中振荡培养9～11小时，摇床转速为160～180转/分；最后转接到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为60～72小时，得到吩嗪-1-羧酸含量为每升5700～6600毫克；其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、余量为水，pH 6.8～7.2；所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为黄豆粉4.5～5.5％、玉米浆1.4～1.7％、葡萄糖1.0～1.4％、余量为水，pH 6.5～7.0。
全文摘要
本发明涉及一种利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，从促生拮抗菌M18基因组中扩增出吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因片段phzA1-G1，并将该基因片段插入表达质粒pME6032中，置于强启动子Ptac的控制下，构建成重组质粒pME6032Phz；然后将该重组质粒导入促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G中，构建成基因工程菌株M18G/pME6032Phz。该工程菌株在扩增吩嗪-1-羧酸生物合成编码基因的拷贝数的同时，实现编码基因的高效稳定表达。最后将基因工程菌株M18G/pME6032Phz在黄豆粉培养液中培养，高效稳定地生产吩嗪-1-羧酸，大幅提高吩嗪-1-羧酸的产量。利用本发明的高产基因工程菌株制备吩嗪-1-羧酸，其生产成本能达到应用于防治水稻纹枯病的农本要求，可用于杀菌剂申嗪霉素的制备，大规模地防治植物病害。
文档编号C12R1/01GK101705265SQ20091019866
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者周泉, 许煜泉 申请人:上海交通大学