一种利用pcr技术快速获得大量质粒dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法，属于分子生物学【技术领域】。本发明根据需要获得的模板质粒DNA序列信息设计引物，上下游引物分别与质粒DNA的两条模板链互补并且两条引物的5’端20个碱基互补。利用这两条引物对0.5μg模板质粒进行PCR扩增，可在体外快速获得大量质粒DNA。与传统质粒获取方法相比，本发明不依赖宿主菌，应用范围广；跳过了质粒转化、菌体培养、质粒提取等步骤，既节省了时间又节约了成本。
【专利说明】—种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用聚合酶链式反应(PCR)技术快速获得大量质粒DNA的方法，可用于提高体外获得质粒DNA的效率以及增加质粒DNA的产量，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]质粒是一种能够独立于染色体进行自我复制的遗传单位，绝大部分质粒都是环形双链DNA。从上世纪70年代开始，研究者开始在天然质粒的基础上开发出大量具有不同功能及特性的专用质粒载体。目前，这些人工构建的质粒已经成为基因工程中最常用、最核心也是最有效的工具之一。
[0003]有报道称，仅2013年，以质粒为核心的基因免疫及治疗市场产值接近450亿美元，并且这一市场还呈现不断扩大的趋势，相应对质粒DNA的需求也不断加大。
[0004]通常情况下，大量获得某一质粒主要依赖于将该质粒转化宿主菌(一般为大肠杆菌)，并使其大量繁殖，对菌体进行裂解以释放质粒并对其收集纯化。具体步骤包括:质粒转化宿主菌，菌体培养，质粒提取纯化等步骤。整个过程需要2-3天，周期较长。如果目标质粒为低拷贝质粒，提高质粒产量往往需要通过扩大菌体培养规模，延长培养时间等方法来实现，相应的成本也将增加。
[0005]质粒DNA导入宿主菌后，其复制会对宿主菌造成负担。质粒上某些基因的表达还可能对宿主菌具有毒害作用，这些情况都对于高效获得大量质粒DNA都会产生负面影响。
[0006]为了缩短周期，降低成本，势必要寻求一种不依赖于宿主菌的获得大量质粒的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法，具有高效快速，节省成本，应用范围广泛等优点，能弥补传统方法的不足，为快速获得大量质粒DNA提供新的途径。
[0008]本发明采用的技术方案如下:
利用PCR技术快速获得大量质粒DNA，包括以下步骤:
1、根据需要获得的模板质粒DNA序列信息设计引物(上游引物，下游引物)，上下游引物分别与质粒DNA的两条模板链互补并且两条引物的5’端20个碱基互补；
2、利用步骤(I)中设计的引物对0.5 μ g模板质粒进行PCR扩增；
3、对步骤2中获得的产物取2μ L进行琼脂糖电泳，检测产物浓度，并将剩余部分于-20 ° C保存备用；
上述PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳检测步骤包括:
(I)PCR 反应体系(50 μ L):5 X TransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5mM each) 5 μ L，上游引物(10 mM)2 μ L，下游引物(10 mM)2 μ L，模板质粒DNA 0.5 μ g,TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,灭菌水补足至 50 μ L。
[0009](2)PCR 反应程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 s，50 ° C 40 s，72 ° C I min，共25 循环；72。C 5 min。
[0010](3)琼脂糖凝胶电泳检测:称取0.4 g琼脂糖粉末，加入40 mL 0.5XTBE缓冲液中，微波加热至琼脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有0.5 X TBE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2 μ?与上样缓冲液混匀的PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准(DNAmarker),接通电源在5 V/cm条件下电泳30 min,电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,轻轻地置于紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标准(DNA marker)判断扩增条带的浓度及大小，将剩余PCR产物于-20 ° C保存备用。
[0011]本发明的显著优点:本发明涉及的技术通过对少量模板质粒DNA进行PCR扩增，可快速获得大量质粒DNA，与传统方法相比具有以下显著优点:
(I)周期短:利用PCR技术扩增质粒，只需要几个小时即可获得大量可直接用于后续操作的质粒DNA，与传统方法2-3天的周期相比，大大缩短了质粒获取的周期。
[0012](2)操作简便:进行一次PCR反应即可获得大量质粒，省去了传统方法质粒转化宿主菌、细菌培养、质粒提取等大量工作，简化了操作流程。
[0013](3)成本低廉:由于跳过了培养细菌的相关过程，节约了该过程中的药品、仪器、人工等方面的消耗，节约了成本。
[0014](4)应用范围广泛:利用本发明涉及的技术获取质粒DNA，无需宿主菌参与，对于依赖特殊宿主菌才可以进行复制的质粒同样适用。
[0015](5)高产稳定:通过提高PCR的循环数，可以使生成的质粒DNA以指数形式增加，质粒拷贝数的高低不会对产量造成影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是应用本发明中方法扩增得到的pSG76-CS质粒与传统方法获得的pSG76_CS质粒电泳对照图。图中M为TaKaRa DL2000 DNA分子量标准，I为应用本发明中方法获得的PSG76-CS质粒，2为传统方法获得的pSG76-CS质粒。
【具体实施方式】
[0017]我们在科研过程中需要获得大量pSG76_CS质粒(Kolisnychenko V, PlunkettIII G, Herring CD, Feher T, Posfai J, Blattner FR, Posfai G.Engineering aReduced Escherichia coli Genome.Genome Research, 2002, 12: 640-647.)用于基因敲除，但该质粒在细菌中的复制要求宿主菌提供PIR蛋白(一种PSG76-CS质粒复制依赖的调节蛋白)，本实验室没有保藏相关菌种，无法通过传统方法获得该质粒。因此，我们通过本发明中涉及的方法对少量本实验室保藏的PSG76-CS质粒进行PCR扩增，以获得大量的PSG76-CS 质粒。
[0018]具体过程为:
(I)引物设计
根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的质粒PSG76-CS序列信息，设计特异性上下游引物(上游引物:5 ’ -ATGTAACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCCTCT-3 ’，下游引物:5 ’ -GGCTTCTCAGTGCGTTACATCCCTGGCTTGTT-3’)，上下游引物分别与质粒DNA的两条模板链互补并且两条引物的5’端20个碱基互补。
[0019](2)利用特异性引物对0.5 μ g pSG76-CS质粒进行PCR扩增。
[0020]PCR 反应体系(50 μ L):5 X TransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5mM each) 5 μ L，上游引物(10 mM)2 μ L，下游引物(10 mM)2 μ L，pSG76_CS 质粒 DNA 0.5μ g, TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,灭菌水补足至 50 μ L。
[0021]PCR 反应程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 s，50 ° C 40 s，72 ° C I min，共 25循环；72。C 5 min。
[0022](3)琼脂糖凝胶电泳检测:称取0.4 g琼脂糖粉末，加入40 mL 0.5 X TBE缓冲液中，微波加热至琼脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有0.5 X TBE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2 μ?与上样缓冲液混匀的PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准(DNAmarker),接通电源在5 V/cm条件下电泳30 min,电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,轻轻地置于紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标准(DNA marker)判断扩增条带的浓度及大小，将剩余PCR产物于-20 ° C保存备用。
[0023]如图1所示，应用本发明中方法扩增得到的pSG76-CS质粒与传统方法获得的PSG76-CS质粒进行电泳对照。图中M为TaKaRa DL2000 DNA分子量标准，I为应用本发明中方法获得的PSG76-CS质粒，2为传统方法获得的pSG76-CS质粒。通过比较I和2的在琼脂糖凝胶中的相对位置可知，利用本发明中方法成功获得了 PSG76-CS质粒。在之后的实验中，利用本实施例中获得的PSG76-CS质粒进行基因敲除，能顺利完成敲除实验，这也说明了本实验中获得的PSG76-CS质粒可以正常行使其上各元件的功能。
[0024]以上列举的只是本发明的具体实施例，本发明不仅限于以上实施例，更换作为PCR模板的质粒可以获得不同种类的质粒产物，并且这些质粒的所有功能都被完整的保留。依据本发明的构想对实施例进行的各种有效变形，均应认为在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法，其特征在于: (I)、根据需要获得的模板质粒DNA序列信息设计引物(上游引物，下游引物)，上下游引物分别与质粒DNA的两条模板链互补并且两条引物的5’端20个碱基互补； (2 )、利用步骤(I)中设计的引物对0.5 Ug模板质粒进行PCR扩增； (3)、对步骤(2)中获得的产物取2 μ L进行琼脂糖电泳，检测产物浓度及条带大小，并将剩余部分于-20 ° C保存备用。
2.根据权利要求1所述利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法，其特征在于PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳检测步骤，包括:
(1)PCR 反应体系(50 μ L):5XTransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5 mMeach) 5 μ L，上游引物(10 mM) 2 μ L，下游引物(10 mM) 2 μ L，模板质粒 DNA 0.5 μ g,TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,灭菌水补足至 50 μ L ； (2)PCR 反应程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 S，50 ° C 40 S，72 ° Cl min，共 25循环；72。C 5 min ； (3)琼脂糖凝胶电泳检测:称取0.4g琼脂糖粉末，加入40 mL 0.5XTBE缓冲液中，微波加热至琼脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有.0.5 X TBE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2 μ?与上样缓冲液混匀的PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准(DNA marker),接通电源在5 V/cm条件下电泳30 min，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标准(DNA marker)判断扩增条带的浓度及大小，将剩余PCR产物于-20 ° C保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK104388420SQ201410560288
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】丁锐, 张立军, 陈旭辉, 崔振海, 敖永华, 于金龙, 马蓉, 曹松屹, 秦萍 申请人:沈阳农业大学