可检测多种转基因水稻的质粒标准分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种定性检测多种转基因水稻的质粒标准分子。该质粒标准分子含转基因水稻中高频率使用的外源调控元件（基因）P-CaMV35S、T-NOS、P-Ubi基因片段，外源标记基因Bar、Hpt片段和水稻内标准基因SPS、PEPC等片段。实验证明：该质粒标准分子可作为阳性标准品用于转基因水稻的定性筛选、监测等工作。
【专利说明】可检测多种转基因水稻的质粒标准分子
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种转基因水稻定性筛选检测用质粒DNA，具体涉及一种可检测多种转基因水稻的质粒标准分子。
【背景技术】
[0002]在转基因生物安全管理体系建设中，转基因安全监管问题是当务之急。其中，转基因生物的检测是安全监管的重要组成部分。
[0003]在转基因生物的检测中，需要对检测活动设置阳性对照，以进行检测结果的监控。通常以从已知的转基因产品中提取的基因组作为阳性对照，但由于我国对转基因产品控制严格，很难得到传统的阳性对照材料，因此亟需研制新型阳性对照材料。质粒标准分子以其制备快捷，成本经济，易于复制等优点，在转基因检测中具有较好的应用前景。
[0004]尽管质粒标准分子已开始出现在转基因作物的定性筛选、监测、定量检测等领域。如转基因水稻克螟稻2号质粒标准分子(中国生物工程杂志，2012)、转基因水稻华恢I号质粒分子(生物技术通报，2012)、转基因玉米NK603质粒分子(农业生物技术学报，2011 )、转基因大豆M0N89788质粒分子(中国专利，专利号201010106138)等等。
[0005]但是，上述报道的质粒分子只能针对单一水稻转化体，而实践中当需要检测多种转基因水稻或检测对象不确定是哪种转化体时，就必须多次检测，既繁琐，且检测成本高，花费时间长。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是构建一个可检测转基因水稻质粒标准分子，在转基因水稻筛选检测时，用其作为阳性对照品可检测多种转基因水稻，达到覆盖面积广，单次检测就可获得多重结果的目的。
[0007]本发明通过分析我国转基因水稻的转化元件、标记基因等信息和分子特征，筛选出了检测覆盖率可达到98.5%的组合元件，包括？-0&1^355、1'-勵5、？-证1、8&1'、肋丨五个外源调控元件(包括标记基因)；还筛选出了内标准基因SPS和PEPC。
[0008]选用上述任意1-5个外源调控元件和任意1-2个内标准基因，可构建转基因水稻定性筛选检测的质粒标准分子。
[0009]上述外源调控基因和内标准基因的序列号及所含核苷酸片段如表1所示:
[0010]表1外源调控元件和内标准基因的序列号SEQ ID NO含核苷酸片段SEQIDNO含核苷酸片段
【权利要求】
1.一种定性检测多种转基因水稻的质粒标准分子，其特征是含有选自SEQ ID NO:3~SEQ ID NO: 7中任意一个或几个核苷酸片段，且含有SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9中任意一个或两个核苷酸片段。
2.权利要求1所述的质粒标准分子，含有SEQID N0:3~SEQ ID N0:9共7个核苷酸片段。
3.权利要求1所述的质粒标准分子，含有SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2的核苷酸片段。
4.权利要求3所述的质粒标准分子，其特征是将以下核苷酸片段共同构建于载体: 1)选自SEQID N0:3~SEQ ID NO:7中任意连接顺序的一个或几个核苷酸片段，和 2)选自SEQID N0:8和SEQ ID NO:9中任意连接顺序的一个或两个核苷酸片段。
5.权利要求4所述的质粒标准分子，所述共同构建是将I)和2)片段分别以平端克隆方式共同构建于pUC57-Amp载体的EcoRV位点。
6.权利要求2~5中任一所述的质粒标准分子的构建方法，其特征是由下列5个引物对分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合得到SEQ ID N0:1:
引物对 I:SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 ；
引物对 2:SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 ；
引物对 3:SEQ ID NO: 14 和 SEQ ID NO: 15 ；
引物对 4:SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17 ；
引物对 5:SEQ ID NO: 18 和 SEQ ID NO: 19。
7.权利要求2~5中任一所述的质粒标准分子的构建方法，其特征是由下列2个引物对分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合得到SEQ ID NO:2:
引物对 6:SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21; 引物对 7:SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。
8.权利要求1~5中任一所述的质粒标准分子在转基因水稻定性筛选、监测中的应用。
9.权利要求8所述的用途，所述应用是作为转基因水稻检测用的阳性对照物质或阳阳性标准品。
10.以下核苷酸片段在构建检测转基因水稻的质粒标准分子中的应用: 1)选自SEQID NO:3~SEQ ID NO:7中任意一个或几个核苷酸片段，和 2)选自SEQID N0:8和SEQ ID NO:9中任意一个或两个核苷酸片段。
【文档编号】C12N15/66GK103540665SQ201310492926
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】金芜军 申请人:中国农业科学院生物技术研究所