专利名称：能催化吲哚生成靛蓝的质粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化工中基因工程菌生产靛蓝的技术领域，尤其涉及一种能催化吲哚生成靛蓝，能共表达细胞色素P450 BM3单加氧酶和葡萄糖脱氢酶的质粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310、制备方法及其用途。
背景技术：
靛蓝是一种蓝色色素，是最早发现的天然染料之一。据统计，到1998年为止，世界染料的年总产量为800,000吨，其中靛蓝占80,000吨。染料靛蓝最初是从植物中提取的，直至1883年它的化学结构被阐明后，化学合成制备方法被广泛采用，它以生产简便、原料充足、纯度高、使用方便等优点迅速普及，很快取代了植物靛蓝。但化学合成靛蓝环境污染严重，并有潜在的致癌作用。随着人们环境保护和劳动保护意识的加强，采用生物技术方法合成靛蓝逐渐引起了研究者的注意。生物转化合成靛蓝不仅简化工艺，可能降低成本，而且对消除潜在致癌物，防止环境污染，具有较多的优越性。因此发展生物法合成靛蓝是极具有前途的。
P450酶系是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，因其主要组成中的P450蛋白与CO结合后在450nm处有特征光吸收峰而得名。迄今为止的研究表明，它可以催化成千上万的化学反应，参与的主要反应有烷基的羟基化、烷基的环氧化，羟基的氧化，氨、氧、硫部位上的脱烷基化，氨部位上的羟基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脱氨、脱氢和脱卤素，氧化性的C-C键断裂以及其它一些还原催化反应。有专著甚至指出它可能是自然界中最具催化多样性的生物催化剂，由于该酶系的性质和功能以及在生命活动过程中的作用，P450酶系受到了广大研究者的高度重视，P450酶系作用的重要性已经成为当代生物学研究中一个值得注意的领域。国外的研究工作主要分布于对该酶系在生物机体中的作用以及利用该酶系的催化作用大规模生产手性药物等方面，而在国内，虽有大量关于该酶系的综述性和研究性报导，但研究工作却只局限在该酶系在生物机体中的作用，目前尚未见有用该酶系的催化作用制备手性药物的报导，有学者指出，主要原因是国内目前尚未能获得适量的酶。
在P450酶系中，P450 BM3是从巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中发现的具有脂肪酸羟基化活性的P450酶，在NADPH和O2存在下，它具有快速催化链长大约为C12-C18的饱和脂肪酸的加单氧酶活性。在国外，德国斯图加特大学技术生化研究所R.D.Schmid领导的科研小组于2000年利用定向进化技术获得具有三个突变位点的P450 BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)，他们发现这一突变酶竟能催化吲哚生成靛蓝；详见“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into anindole-hydroxylating catalyst”《Chemistry-A European Journal》Li Q S，Schwaneberg U，Fischer P，Schmid R D.2000，61531-1536。
而后由浙江大学生物工程研究所梅乐和教授领导的科研小组在此基础上，通过易错PCR技术进一步定向进化P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)变体基因，获得一个高于P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)催化吲哚活性的P450 BM3突变酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)，提高了靛蓝的产量。详见“催化吲哚生成靛蓝的细胞色素450BM-3定向进化研究”《生物化学与生物物理进展》李红梅、梅乐和、VladaUrlacher、Schmid RolfD.2005，32(7)1-6。
但是P450 BM3催化吲哚生成靛蓝需要还原型辅酶NADPH的参与，这就限制了P450 BM3用于合成靛蓝的实用性。
发明内容
本发明提供了一种能共表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶，并能催化吲哚合成靛蓝的质粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310。
本发明还提供了上述质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的制备方法。
本发明还提供了质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚合成靛蓝的用途。
一种能催化吲哚生成靛蓝的质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脱氢酶基因共同连接在同一个表达载体pET28a(+)构建。
制备带有上述质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌的方法，包括以下步骤(1)以pQE30-gdh0310为模板经PCR扩增得到gdh0310基因片段；，将该基因片段连接到pMD18-T质粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310转化到E.coli JM109中，并涂布到含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；(3)挑选克隆接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养扩增质粒；(4)提取扩增后的质粒，经EcoRI和XhoI酶解，将所得酶切片段定向连接到经EcoRI和XhoI酶解处理过的pET28a(+)-P450 BM3上，构建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)将重组质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310转化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；(6)挑选克隆接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒；(7)提取扩增质粒，用NcoI和XhoI对重组质粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310进行双酶切，通过电泳鉴定；(8)将电泳鉴定正确的质粒转化到E.coliBL21中，得到带有质粒(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)的重组菌E.coliBL21。
上述质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚生成靛蓝。
其催化吲哚生成靛蓝包括以下步骤(1)由LB琼脂平板挑取带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加一定量卡那霉素的LB液体培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；(2)发酵培养基中添加一定量卡那霉素，加入适量葡萄糖，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG诱导，同时加入适量底物吲哚，将温度调为30℃继续培养24h；(3)将所得培养液离心10min，收获细胞，并用水洗涤2-3次，加入适量N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
催化吲哚生成靛蓝还可采用以下步骤(1)由LB琼脂平板挑取带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加一定量卡那霉素的LB液体培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；(2)发酵培养基中添加一定量卡那霉素，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG诱导6-8h，装液量为25-50ml/250ml摇瓶；(3)将所得发酵液离心10min，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得到的菌体于4℃下保存备用；(4)称取湿菌体，悬浮于Tris-HCl缓冲液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振荡条件下30-35℃恒温反应8h；(5)反应结束后，将所得反应液离心10min，加入适量N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
本发明在突变酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)突变基因的基础上，将该突变基因与葡萄糖脱氢酶基因共同连接在同一个表达载体pET28a(+)上，将此质粒转入E.coliBL21，得到的菌株能同时表达细胞色素P450 BM3单加氧酶和葡萄糖脱氢酶，并能协同作用催化吲哚生成靛蓝，在反应体系中形成辅酶再生循环系统，从而大幅度提高靛蓝的产量，使生物转化合成靛蓝更加实用化。与只能表达P450 BM3的菌株E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)相比较，其催化活性提高了22-27倍，为生物转化生产染料靛蓝提供了广阔的应用前景。
具体实施例方式
以pQE30-gdh0310为模板经过PCR扩增得到gdh0310基因片段，将所得gdh0310基因片段用电泳检测并从琼脂糖凝胶中切胶回收葡萄糖脱氢酶基因片断，通过“A-T”连接方式连接到pMD18-T质粒上，得到pMD18-gdh0310；将所得pMD18-gdh0310转化到E.coli JM109中，并涂布到终浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；挑选大约8个克隆接种到3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒；用碱裂解法提取扩增质粒，并用EcoRI和XhoI在37℃酶解，将获得的酶切片段定向连接到用同样双酶切处理过的pET28a(+)-P450 BM3上，构建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
将重组质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310转化到E.coli DH5α，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；挑选8个克隆接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒；用碱裂解法提取扩增质粒，并转化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了带质粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21。
由LB平板挑取带质粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加卡那霉素至终浓度为30μg/ml的LB种子培养基中，180r/min，37℃摇床过夜培养12h；发酵培养基中添加卡那霉素至终浓度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG至终浓度0.5-1.0mM诱导，同时加入适量底物吲哚，将温度调为30℃继续培养24h，得到蓝色细胞，用N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
或者由LB琼脂平板挑取带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加一定量卡那霉素的LB液体培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；在发酵培养基中添加一定量卡那霉素，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG诱导6-8h，装液量为25-50ml/250ml摇瓶；将所得发酵液离心10min，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得到的菌体于4℃下保存备用；称取湿菌体，悬浮于Tris-HCl缓冲液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振荡条件下30-35℃恒温反应8h；反应结束后，将所得反应液离心10min，加入适量N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
序列表序列信息(a)序列特征，此序列不包括pET28(+)，P450 BM3基因片断上游通过NheI酶切位点连接到pET28a(+)上，下游与葡萄糖脱氢酶基因片断通过EcoRI酶切位点连接，葡萄糖脱氢酶基因片断下游通过XhoI酶切位点与pET28a(+)连接，此序列从P450 BM3基因的启动子开始，到葡萄糖脱氢酶基因的终止子结束。
长度3946个碱基类型核酸链型单链拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)最初来源P450 BM3基因片断和葡萄糖脱氢酶基因均来自于巨大芽孢杆菌(d)序列描述ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAG
GAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCT
ATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAAGAATTCGGATCCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAGTTGTAACAGGCGGATCAAAAGGATTGGGTCGCGCAATGGCCGTTCGTTTTGGTCAAGAGCAGTCAAAAGTGGTTGTAAACTACCGCAGCAATGAAGAAGAAGCGCTAGAAGTAAAAAAAGAAATTGAACAAGCTGGCGGCCAAGCAATTATTGTTCGAGGCGACGTAACAAAAGAGGAAGACGTTGTGAATCTTGTAGAGACAGCTGTTAAAGAGTTTGGCACATTAGACGTTATGATTAACAATGCTGGTGTTGAAAACCCGGTTCCTTCACATGAATTATCGTTAGAAAACTGGAATCAAGTAATCGATACAAACTTAACAGGCGCGTTTTTAGGAAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAATGATATTAAAGGAAACGTTATTAACATGTCCAGCGTTCACGAGATGATTCCTTGGCCACTATTTGTTCACTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAACTAATGACAGAAACATTGGCTCTTGAATATGCGCCAAAAGGTATCCGCGTAAATAACATTGGACCAGGCGCGATCGATACGCCAATCAACGCTGAAAAATTCGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGACGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGCTACATCGGCAACCCGGAAGAAATTGCATCAGTTGCAGCATTCTTAGCATCGTCACAAGCAAGCTACGTAACAGGTATTACACTATTTGCTGATGGCGGTATGACAAAATATCCTTCTTTCC
AAGCGGGAAGAGGTTAATAA具体操作采用如下步骤进行1.葡萄糖脱氢酶基因的获得以pQE30-gdh0310为模板经PCR扩增得到gdh0310基因片段，设计相应的上下游引物分别是5’-AAAAGAATTCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAG-3’和5’-AAAAACTCGAGTTATTAACCTCTTCCCGCTT-3’。
为便于与pET28a(+)-P450 BM3联接，上下游引物的5’端分别设计了EcoRI和XhoI酶切位点。
PCR扩增反应体系为向500μl的eppendorf管中加入10nmol的dNTPs，各10pmol的上游引物和下游引物，约1ng质粒pQE30-gdh0310作为模板DNA，1.25U Taq Platinum聚合酶，5μl的PCR缓冲液，然后用无菌的蒸馏水加至总体积50μl。PCR反应参数是94℃变性8min后，94℃/30s，54℃/30s，72℃/1min，循环30次；72℃延伸10min。
将所得gdh0310基因片段用电泳检测并从琼脂糖凝胶中切胶回收葡萄糖脱氢酶基因片断，通过“A-T”连接方式连接到pMD18-T质粒上，得到pMD18-gdh0310，将所得pMD18-gdh0310转化到E.coli JM109中，并涂布到终浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；挑选大约8个克隆接种到3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒，用碱裂解法提取扩增质粒，经EcoRI和XhoI在37℃酶解后，用电泳检测并从琼脂糖凝胶中切胶回收葡萄糖脱氢酶基因片断。
酶切过程中，质粒pMD18-gdh0310以及限制性内切酶的用量为质粒pMD18-gdh031010μlEcoRI1μlXhoI 1μl缓冲液(10×H)3μl无菌水 15μl总体积 30μl
2.表达载体pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的构建对上述质粒pMD18-gdh0310用EcoRI，XhoI双酶切，获得的酶切片段定向连接到用同样双酶切处理过的pET28a(+)-P450 BM3上，构建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
酶切过程中，质粒pET28a(+)-P450 BM3以及限制性内切酶的用量为质粒pET28a(+)-P450 BM310μlEcoRI 1μlXhoI 1μl缓冲液(10×H) 3μl无菌水15μl总体积30μl连接过程中，连接酶、葡萄糖脱氢酶基因片断与质粒pET28a(+)-P450BM3的用量为葡萄糖脱氢酶基因片断 4μl质粒pET28a(+)-P450 BM3 4μlT4 DNA连接酶 1μl缓冲液(10×) 1μl总体积 10μl3.连接效果的鉴定将重组质粒转化到到E.coli DH5α，涂布到含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；挑选约8个克隆接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒，用碱裂解法提取扩增质粒，并转化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了带质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21；用NcoI和XhoI对重组质粒进行双酶切鉴定，利用DNA电泳检测葡萄糖脱氢酶基因片段是否已连接到pET28a(+)-P450 BM3上。
4.全细胞生物转化生产靛蓝a)由LB琼脂平板挑取带质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆，接种到添加卡那霉素至终浓度为30μg/ml的LB(pH7.0-7.5)种子培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；LB发酵培养基中添加卡那霉素至终浓度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG至终浓度0.5-1.0mM诱导，同时加入适量终浓度为0.1-10mM的底物吲哚，将温度调为30℃继续培养24h。
将所得培养液以8000r/min离心10min，收获细胞，所得细胞用水洗涤2-3次，加入适量的N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质，8000r/min离心保留上清液，测吸光值，并根据标准曲线计算靛蓝含量，得到靛蓝产量为49.98-915.3mg/L。
b)种子培养基中添加卡那霉素至终浓度为30μg/ml，由平板挑取带质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21接入，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；LB发酵培养基中添加卡那霉素至终浓度30μg/ml，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG至终浓度0.5mM诱导6-8h。装液量为25-50ml/250ml摇瓶。
发酵培养结束后，发酵液于8000r/min离心10min，收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤两次，得到的菌体于4℃下保存备用；称取0.2-0.4g湿菌体，悬浮于20mlTris-HCl缓冲液中，加入100-200mM葡萄糖和一定量终浓度为0.1-10mM的吲哚，于100r/min振荡条件下30-35℃恒温反应8h；反应结束后，反应液于8000r/min离心10min，加入适量的N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质，8000r/min离心保留上清液，测吸光值，并根据标准曲线计算靛蓝含量，得到靛蓝产量为13.1-659mg/L。
权利要求
1.一种能催化吲哚生成靛蓝的质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脱氢酶基因共同连接在同一个表达载体pET28a(+)上构建，从P450 BM3基因的启动子开始，到葡萄糖脱氢酶基因的终止子结束的基因序列为ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAGGAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAAGAATTCGGATCCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAGTTGTAACAGGCGGATCAAAAGGATTGGGTCGCGCAATGGCCGTTCGTTTTGGTCAAGAGCAGTCAAAAGTGGTTGTAAACTACCGCAGCAATGAAGAAGAAGCGCTAGAAGTAAAAAAAGAAATTGAACAAGCTGGCGGCCAAGCAATTATTGTTCGAGGCGACGTAACAAAAGAGGAAGACGTTGTGAATCTTGTAGAGACAGCTGTTAAAGAGTTTGGCACATTAGACGTTATGATTAACAATGCTGGTGTTGAAAACCCGGTTCCTTCACATGAATTATCGTTAGAAAACTGGAATCAAGTAATCGATACAAACTTAACAGGCGCGTTTTTAGGAAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAATGATATTAAAGGAAACGTTATTAACATGTCCAGCGTTCACGAGATGATTCCTTGGCCACTATTTGTTCACTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAACTAATGACAGAAACATTGGCTCTTGAATATGCGCCAAAAGGTATCCGCGTAAATAACATTGGACCAGGCGCGATCGATACGCCAATCAACGCTGAAAAATTCGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGACGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGCTACATCGGCAACCCGGAAGAAATTGCATCAGTTGCAGCATTCTTAGCATCGTCACAAGCAAGCTACGTAACAGGTATTACACTATTTGCTGATGGCGGTATGACAAAATATCCTTCTTTCCAAGCGGGAAGAGGTTAATAA。
2.一种制备带有如权利要求1所述质粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310的重组菌的方法，包括以下步骤(1)以pQE30-gdh0310为模板经PCR扩增得到gdh0310基因片段；，将该基因片段连接到pMD18-T质粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310转化到E.coli JM109中，并涂布到含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；(3)挑选克隆接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养扩增质粒；(4)提取扩增后的质粒，经EcoRI和XhoI酶解，将所得酶切片段定向连接到经EcoRI和XhoI酶解处理过的pET28a(+)-P450 BM3上，构建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)将重组质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310转化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；(6)挑选所得克隆接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒；(7)提取扩增质粒，用NcoI和XhoI对重组质粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310进行双酶切，通过电泳鉴定；(8)将电泳鉴定正确的质粒转化到E.coli BL21中，得到带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coli BL21。
3.如权利要求1所述的质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310在催化吲哚生成靛蓝中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于催化吲哚生成靛蓝包括以下步骤(1)由LB琼脂平板挑取带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加一定量卡那霉素的LB液体培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；(2)在发酵培养基中添加一定量卡那霉素，并加入适量葡萄糖，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG诱导，同时加入适量底物吲哚，将温度调为30℃继续培养24h；(3)将所得培养液离心10min，收获细胞，并用水洗涤2-3次，加入适量N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于催化吲哚生成靛蓝还可采用以下步骤(1)由LB琼脂平板挑取带有质粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重组菌E.coliBL21阳性克隆接种到添加一定量卡那霉素的LB液体培养基中，150-180r/min，37℃摇床过夜培养12h；(2)在发酵培养基中添加一定量卡那霉素，将种子液按1-2％(v/v)的接种量接入，150-180r/min，37℃摇床培养至菌浓OD600约为0.8-1.2，加IPTG诱导6-8h，装液量为25-50ml/250ml摇瓶；(3)将所得发酵液离心10min，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得到的菌体于4℃下保存备用；(4)称取湿菌体，悬浮于Tris-HCl缓冲液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振荡条件下30-35℃恒温反应8h；(5)反应结束后，将所得反应液离心10min，加入适量N，N-二甲基甲酰胺提取蓝色物质。
全文摘要
本发明公开了一种能共表达P450BM3和葡萄糖脱氢酶，并能催化吲哚合成靛蓝的质粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制备方法及其用途。它是将P450BM3基因和葡萄糖脱氢酶基因共同连接在同一个表达载体pET28a(+)上，将此质粒转入E.coliBL21，得到的菌株能同时表达细胞色素P450BM3单加氧酶和葡萄糖脱氢酶，并能协同作用催化吲哚生成靛蓝，与以往菌株相比，其催化活性提高了22－27倍，为生物转化生产染料靛蓝提供了广阔的应用前景。
文档编号C12N15/53GK1880459SQ200610050388
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月18日 优先权日2006年4月18日
发明者梅乐和, 陆燕 申请人:浙江大学