本发明涉及中药资源开发利用技术领域，具体来说是一种利用暗紫贝母愈伤组织生产暗紫贝母总生物碱的方法。
背景技术：
暗紫贝母（fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia）系百合科多年生草本植物，是名贵药材川贝母的主要基原植物之一。目前，以暗紫贝母干燥鳞茎为主要来源的川贝母是贝母中的佳品，习称“松贝”，具有清热润肺、化痰止咳的功效，是治疗咳嗽的重要良药。暗紫贝母在自然环境中生长缓慢，周期长，从种子萌发到长成药材，需要4-5年的时间，远不能满足市场需求，由于长期采挖，野生资源极度匮乏，面临枯竭。为了解决暗紫贝母资源紧缺问题，有大量研究集中于暗紫贝母组培快繁培养方面，期望通过鳞茎再生来增加种苗资源，实现规模化人工栽培，这在一定程度上缩短了生产周期，但面临许多问题，如组培苗驯化成功率不高，且种植区域受限等。随着贝母生物碱成分研究的不断发展，直接从贝母组培鳞茎或组培物中提取生物碱更具有优势，可以在短期内繁殖大量材料来供提取生物碱，且不受时间和区域限制。
申请号为“200910164379.9”的中国发明专利公开了一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法，该方法是将愈伤组织打碎后进行培养生产川贝母，属于发酵工程范畴，存在着培养复杂，过程不容易控制的问题。并且，暗紫贝母与川贝母生物碱成分在质与量上存在一定的差异，对暗紫贝母生物碱进行组培生产研究具有重要意义，但目前未见相关利用暗紫贝母来生产贝母总生物碱的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种利用暗紫贝母愈伤组织生产暗紫贝母总生物碱的方法，本发明方法利用愈伤组织来制备贝母总生物碱，其具有生产周期短、操作简单的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用暗紫贝母愈伤组织制制备暗紫贝母总生物碱的方法，步骤包括：
（1）愈伤组织的诱导：以实验室通过组织培养生产的鳞茎为外植体，选取幼嫩的鳞瓣片切成0.5cm的小块，接种于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+琼脂5g/l+蔗糖30g/l的培养基上，控制ph为5.8、培养室温度为23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照时间12小时/天、光照强度2000l条件下诱导培养30-35天获得到大量愈伤组织；
（2）增殖与生物碱积累培养：将步骤（1）中产生的愈伤组织切成0.8×0.8cm，接种至培养基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+琼脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培养基中，控制培养温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照时间12小时/天、光照强度2000l条件下培养30-35d后获得生物碱含量高的培养物；
（3）贝母生物碱含量测定：收集步骤（2）培养后的愈伤组织，置于干燥的滤纸上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，以西贝母碱为对照，提取暗紫贝母生物碱，并检测其含量。
本发明中，提取暗紫贝母的提取方法采用《中国药典》（2005版）的操作方法。
本发明方法还提供一种利用上述方法制备的暗紫贝母总生物碱。对于本领域技术人员来说，利用本发明方法制备的暗紫贝母总生物碱在生物制药领域中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益技术效果是：本发明利用暗紫贝母作为贝母总生物碱的提取原料，其愈伤组织具有繁殖快、增殖率高的特点，通过激素调控次生代谢产物积累，达到了快速生产暗紫贝母总生物碱的目的，其培养后的愈伤组织中西贝母碱百分含量高达0.32%，是药典中规定的药材标准含量的6倍多。本发明方法操作简单，贝母总生物碱产量高，适合工业生产应用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用暗紫贝母愈伤组织制制备暗紫贝母总生物碱的方法，步骤包括：
（1）愈伤组织的诱导：以实验室通过组织培养生产的鳞茎为外植体，选取幼嫩的鳞瓣片切成0.5cm的小块，接种于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+琼脂5g/l+蔗糖30g/l的培养基上，控制ph为5.8、培养室温度为23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照时间12小时/天、光照强度2000l条件下诱导培养30-35天获得到大量愈伤组织；
（2）增殖与生物碱积累培养：将步骤（1）中产生的愈伤组织切成0.8×0.8cm，接种至培养基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+琼脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培养基中，控制培养温度23±1℃、空气相对湿度50%-60%、光照时间12小时/天、光照强度2000l条件下培养30-35d后获得生物碱含量高的培养物；
（3）贝母生物碱含量测定：收集步骤（2）培养后的愈伤组织，置于干燥的滤纸上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，磨成粉末过3号筛，取2g粉末加入40ml的三氯甲烷-甲醇（4:1）溶液进行贝母生物碱的提取，过滤去渣定容至50ml。取2-5ml溶液，蒸干，加10ml三氯甲烷溶液，溶解待测。以西贝母碱为对照品（对照品溶液0.2mg/ml），制作标准曲线，通过紫外分光光度计依法测定供试品吸光度，并从标准曲线上读出样品的含量，计算即得（《中国药典》2,015）。测得步骤（2）培养后的愈伤组织中西贝母碱百分含量高达0.32%，是药典中规定的药材标准含量的6倍多。
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。