两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物或保健品的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及马齿苋来源生物碱应用于制备抗炎药物或保 健品的应用。
【背景技术】
[0002] 马齿苋又名长命菜、马苋菜，属马齿苋科一年生肉质草本植物马齿苋的全草。马齿 苋耐光耐阴，喜暖且耐旱耐涝，适宜生长在空气干燥而土壤潮湿的地方。马齿苋生长力、抗 病能力强，分布广泛，资源丰富，作为药食同源野生植物之一，既是一种保健功能食品，又具 有重要的药用价值。2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具 有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，可用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便 血、痔血及崩漏下血。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关， 其主要化学成分包括：有机酸类、黄酮类、萜类、香豆素类、生物碱类、挥发油及多糖等。现代 药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、松弛 或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。
[0003] 近年来，马齿苋因其丰富的营养、多样的药理作用以及药食两用的特性备受学者 关注。到目前为止，关于马齿苋抗炎活性的研究集中在马齿苋不同溶剂提取物的报道，本组 研究发现，马齿苋来源生物碱具有抗炎功效，可能为其抗炎作用的主要化合物。
[0004] 炎症是机体对于刺激的一种防御反应，常表现为红、肿、热、痛及其他功能障碍。当 机体受到外来病原体刺激时，常引起各种炎症介质过量释放以及炎症细胞过度激活。巨噬 细胞作为机体抗击外来物侵袭的重要一关，可调节机体防御功能，会分泌炎症因子及炎症 介质，包括转化生长因子（Transforming growth factor，TGF)、白细胞介素（Interleukin， IL)、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF)、前列腺素 2 (Prostaglandin E2，PGE2) 以及一氧化氮（Nitric oxide，NO)等，这些生物活性物质也会影响炎症反应过程中酶的 表达，如诱导性一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS)和环氧化酶 (Cyclooxygenase 2, C0X-2)。
[0005] 细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中一种成分， 其作为病原体入侵巨噬细胞后形成体外炎症模型，可使巨噬细胞大量分泌上述生物活性物 质。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物或保健品的应 用。
[0007] 为实现本发明的上述目的，本发明提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物 或保健品的应用，所述两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone。
[0008] 所述oleracimine的分子式为C1SH26N 20,结构式为。
[0009] 所述oleracone的分子式为C14H17N0 2,结构式为。
[0010] 所述抗炎药物或保健品中含有oleracimine的化合物及其盐或衍生物；所述抗炎 药物或保健品中含有oleracone的化合物及其盐或衍生物。
[0011] 所述抗炎是指抑制由巨噬细胞释放过量炎症细胞因子或炎症介质而导致的炎症； 所述炎症细胞因子包括IL-6、TNF- α，所述炎症介质为N0、PGE2。
[0012] 所述抗炎药物或保健品为炎症细胞因子过度表达抑制剂、巨噬细胞产生过量NO 的抑制剂等。
[0013] 与现有技术相比本发明的有益效果。
[0014] 本发明提供的两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物或保健品的应用，通过对 LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264. 7炎症反应的抑制试验，表明马齿苋来源oleracimine和 oleracone具有抑制炎症因子IL-6、TNF-α和抑制炎症介质N0、PGE2的作用，蛋白免疫印 迹法及实时荧光定量PCR显示oleracimine对iN0S、C0X-2蛋白和基因表达具有抑制作用， 有效证明了两种马齿苋来源生物碱具有抗炎的功效。综上，马齿苋来源生物碱oleracimine 和oleracone均具有良好的抗炎活性，可作为先导化合物用于制备抗炎活性药物，来预防 或治疗由N0、IL-6、TNF- α和PGE2过量而导致的炎症。
【附图说明】
[0015] 图1A为oleracimine对LPS诱导RAW264. 7巨噬细胞的存活率的影响示意图。
[0016] 图1B为oleracone对LPS诱导RAW264. 7巨噬细胞的存活率的影响示意图。
[0017] 图2A为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞产生N0的抑制作用示意图。
[0018] 图2B为oleracone对LPS刺激RAW264. 7细胞产生N0的抑制作用示意图。
[0019] 图3A为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌IL-6的影响示意图。
[0020] 图3B为oleracone对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌IL-6的影响示意图。
[0021] 图4A为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌TNF- α的影响示意图。
[0022] 图4Β为oleracone对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌TNF- α的影响示意图。
[0023] 图5Α为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌PGE^影响示意图。
[0024] 图5B为oleracone对LPS刺激RAW264. 7细胞分泌PGE^影响示意图。
[0025] 图6A为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞表达的iNOS蛋白的影响示意图。
[0026] 图6B为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞表达的C0X-2蛋白的影响示意图。
[0027] 图6C为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞表达的蛋白条带图。
[0028] 图7A为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞表达的iNOS基因影响示意图。
[0029] 图7B为oleracimine对LPS刺激RAW264. 7细胞表达的C0X-2基因影响示意图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
[0031] 本实施例提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物或保健品的应用，所述两 种马齿苋来源生物喊为oleracimine和oleracone。
[0032] 为进一步验证本发明的有益效果，提供以下实验例。
[0033] 1、实验原料及相关试剂、分组。
[0034] DMEM高糖培养基、胎牛血清购于美国Hyclone公司；青霉素、链霉素购于杭州四季 青公司；LPS购于美国Sigma公司；IL-6、TNF- a、PGEJ^ ELISA试剂盒购于美国Cayman公 司；细胞裂解液、PMSF及Griess试剂购于碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白质浓度测定 试剂盒、引物购于上海生工公司；iNOS单克隆抗体、C0X-2单克隆抗体、内参单克隆抗体购 于美国CST公司；辣根过氧化酶标记的二抗抗体购于北京中杉金桥生物公司；PVDF膜购于 美国Millipore公司；化学发光底物（ECL)购于美国Pierce公司；EastepRNA提取试剂 盒、GoScript?反转录试剂盒购于Promega公司；SYBR /^rewix 试剂盒购于TaKaRa 公司。
[0035] 分组：共分为三组，即对照组、LPS组和实验组。
[0036] 2、两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone的制备方法。
[0037] (1)马齿苋来源生物碱为oleracimine的制备方法，包括以下步骤。
[0038] 步骤1、称取马齿苋干燥药材50kg，采用水煎煮提取，水的用量为药材用量的8-16 倍，煎煮提取两次，每次2h，水提液过滤，合并滤液直接浓缩，得药液备用。
[0039] 步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的AB-8或D101大孔吸附树脂吸附除 杂，分别以水和50%乙醇洗脱，对50%乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。所述水 的洗脱除杂用量为2-3个柱体积，所述50%乙醇的洗脱用量为冲至颜色变浅为止。所述大 孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用 水洗至无醇味。
[0040] 步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复3次萃取，40°C以下减压回收乙酸乙酯 至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。所述乙酸乙酯与浓缩液的用量比为1:1 (V:V)。
[0041] 步骤4 :将步骤3中乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶以 200-400目，依次用石油醚-丙酮（1:1、1:2、1:3、1:5，v: v)梯度洗脱，每个比例洗脱得40个 部位（即每个比例洗脱得40个瓶，每瓶200mL)，共得到160个部位（即共得到160个瓶)，经 薄层色谱进行检测，显色，合并显色的90-130洗脱部位（即合并显色的90-130瓶，弃去1-89 瓶与131-160瓶)，将合并后的90-130部位经40°C以下减压浓缩至干，备用。
[0042] 步骤5 :将步骤4中所得物再经0DS中压柱层析分离（Octadecylsilyl，十八烷基 硅烷键合硅胶填料，填料粒度为20-40 μ m)，用甲醇-水（50/50，v/v)等度洗脱(加压，使流 速为lml/min，温度为室温)，得到10个部位(即等度洗脱得10个瓶，每瓶100mL，依次标记)， 经薄层色谱进行检测，显色，合并6-7部位，50°C以下减压浓缩至干，备用。
[0043] 步骤6 :将步骤5中所得物经Sephadex LH-20,以甲醇-水（70/30,v/v)等度洗脱， 即得新骨架生物碱化合物oleracimine。经超高效液相色谱，归一法测定纯度均为90-99%。
[0044] (2)马齿苋来源生物碱为oleracone的制备方法，包括以下步骤。
[0045] 重复上述oleracimine制备方法中的步骤1-3,接着将步骤3中乙酸乙酯萃取物 干法上样，经硅胶柱层析分离，所述硅胶为200-400目，依次用石油醚-丙酮（1:1，1:2,1: 3， 1:5, v:v)梯度洗脱得到130个洗脱部位，按顺序记为洗脱部位1-130,经薄层色谱进行检 测，显色，合并90-130洗脱部位，将合并后的洗脱部位经40°C以下减压浓缩至干，备用。将 步骤4中所得物再经0DS中压柱层析分离，用甲醇-水（70/30, v/v)等度洗脱，得到10个洗 脱部位，按顺序记为部位1-10,经薄层色谱进行检测，显色，将洗脱部位3在50°C以下减压 浓缩至干，得浓缩物备用。将步骤5中所得浓缩物经Sephadex LH-20,以甲醇-水（50/50， v/V)等度洗脱，根据颜色紫红色带接，即得马齿苋来源生物碱oleracone。经超高效液相色 谱，归一法测定纯度均为90-99%。
[0046] 3、MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生