一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物碱总碱含量测试技术领域，具体涉及一种测定三尖杉科植物中三 尖杉生物碱总碱含量的方法。
【背景技术】
[0002] 三尖杉科(Cephalotaxaceae)仅有三尖杉属1属，该属植物共有7个种2个变种，包 括篦子三尖杉（0.〇1；^61'；〇、日本粗榧（(].1^1'1'；[1^1：011丨3)、宽叶粗榧（(].]^11：丨；1^〇1丨3)、粗榧 ((].8；[11611818)、海南粗榧（0.1]1&1111；[；0、三尖杉（0.；1^01'1：11116；0、高山三尖杉（0.；1^01'1：111161 var .alpine)、台湾粗榧（C. sinensis var.wilsoniana)、贡山三尖杉（C. lanceolata)。本科 分布于东亚南部及中南半岛，主产中国。零星分布于横断山脉以东、秦岭至大别山与江苏南 部以南的省区及台湾。
[0003] 该科植物均含有次生代谢产物三尖杉生物碱，为该科植物特有的次生代谢产物。 于1954年首次发现，目前已鉴定出的三尖杉生物碱有50多种。其中部分化合物已被鉴定具 有药物活性而备受关注，例如：三尖杉酯碱（h a r r i n g t ο n i n e )、高三尖杉酯碱 (homoharringtonine)、脱氧三尖杉酯喊（deoxyharringtonine)和异三尖杉酯喊 (isoharringtonine)。这些化合物在治疗白血病、淋巴癌、皮肤癌、鼻咽癌等疾病方面有效。
[0004] 不同种的三尖杉科植物含有的三尖杉生物碱不同，不同的部位也有明显差异。并 且随着产地、植株年龄及逆境的变化而变化。尽管可以通过液质联用、核磁共振的方法逐个 定量、定性分析这些单体化合物。但是，目前仍然缺少安全、快捷、准确的三尖杉生物碱总碱 的测定方法。
[0005] 因此，建立三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱测定方法对于快速评估收获时期和 药物提取等方面有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的所要解决的技术问题是提供一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总 碱含量的方法，该方法简便、安全、快捷、准确。
[0007] 本发明利用三尖杉生物碱的母环结构具有亚甲二氧基，亚甲二氧基在酸性条件下 可以水解生成甲醛，而甲醛和变色酸进一步反应可以显色，根据朗博-比尔(Lambert-Beer) 定律可以测定总碱含量。
[0008] 本发明上述所要解决的技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种测定三尖杉 科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)选取三尖杉碱标准品，采用有机溶剂配制一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准 溶液，将该组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液挥干有机溶剂，然后加入变色酸溶液、浓磷 酸和过氧化氢，摇匀后微波加热，得标准品反应液；
[0010] (2)将标准品反应液冷却至室温，加入蒸馏水定容，并比色，将比色得到的吸光值 与步骤（1)中的三尖杉碱标准溶液的浓度相关联，建立三尖杉碱吸光度值-浓度的标准曲 线；
[0011] (3)选取三尖杉科植物样品，烘干后粉碎，获得生药粉末，取生药粉末，加入氨水， 混匀后再加入氯仿浸提，浸提结束后过滤、离心，取氯仿层，挥发掉氯仿，残留物用有机溶剂 定容；
[0012] 或选取三尖杉科植物的悬浮培养细胞，离心后，取沉淀物，加入氨水，混匀后再加 入氯仿，搅拌后超声处理，浸泡过夜浸提，浸提结束后过滤，取滤液，并挥发掉氯仿，残留物 用有机溶剂定容；
[0013] (4)取定容后样品，加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢，摇匀后微波加热，冷却至 室温，加入蒸馏水定容，并比色，将测得的吸光值代入步骤(2)建立的三尖杉碱吸光度值-浓 度的标准曲线，获得三尖杉科植物样品的浓度，经换算即获得三尖杉科植物样品中三尖杉 生物碱总碱含量。
[0014] 在上述测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法中：
[0015] 步骤（1)中所述的一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液的浓度分别优选为0、 250、500、1000、2000yg/mL。
[0016] 步骤(1)和步骤(3)中所述的有机溶剂优选为甲醇。
[0017] 步骤（1)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与每个三尖杉碱标准溶液的用量 关系优选为：200~400yL:2~4mL、50~100yL:50~150yL，其中变色酸溶液的浓度优选为 0.1~0.2g/mL，浓磷酸的质量百分含量优选为80~85%，过氧化氢的浓度优选为0.020~ 0·025mol/L。
[0018] 步骤（1)中变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与每个三尖杉碱标准溶液的用量关系 最佳为：300yL: 3mL、70yL: 100yL，其中变色酸溶液的浓度最佳为0. lg/mL，浓磷酸的质量百 分含量最佳为85%，过氧化氢的浓度最佳为0.025mol/L。
[0019] 步骤(1)和步骤(4)中在三尖杉生物碱总碱中加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢 时，反应充分，加热时间短。
[0020] 使用浓磷酸和过氧化氢作为反应介质，三尖杉生物碱总碱中的亚甲二氧基水解为 甲醛，甲醛和变色酸反应生成紫色络合物在该介质条件下可以一步完成，并且使用浓磷酸 较浓硫酸安全性得以提高。
[0021 ]步骤(1)和步骤(4)中微波加热时，微波功率优选为1000~1200W，加热时间优选为 30~38s〇
[0022] 步骤(2)和步骤(4)中比色时，优选于波长540~580nm处比色。
[0023] 步骤(2)和步骤(4)中比色时，最佳于波长558nm处比色。
[0024]在波长为558nm处比色，具有响应值高的特点，可以提高检测的灵敏度。
[0025]步骤（3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系优选为2~5g: 2~5mL: 25~ 40mL，步骤(3)中沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为3~5g:0.5~1.5mL:10~20mL，其中氨 水的质量百分含量为20~28%。
[0026]步骤(3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系最佳为：38:21111^3〇1111^，其中氨 水的质量百分含量为28% ;步骤(3)中沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为4g:lmL:15mL。
[0027]步骤(3)中选取三尖杉科植物样品，烘干后粉碎时，将三尖杉科植物样品优选于 105°C烘干30~45min后，再于80~85°C继续烘干至衡重，烘干的样品优选粉碎至颗粒小于 420μπι，获得生药药粉。
[0028]步骤(3)中三尖杉科植物样品优选为三尖杉科植物叶片、枝条或者杀青后的树皮； 三尖杉科植物优选为海南粗榧。
[0029]步骤(3)中超声时，超声波的频率优选为80Hz，超声时间优选为30min。
[0030] 步骤(3)中浸提结束后过滤、离心时，离心机转速为3000~5000r/min，离心时间为 10~20min〇
[0031] 步骤(4)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与定容后样品的用量关系优选为： 200~400yL: 2~4mL、50~1 OOyL: 50~150yL，其中变色酸溶液的浓度优选为0.1~0.2g/mL， 浓磷酸的质量百分含量优选为80~85%，过氧化氢的浓度优选为0.020~0.025mol/L。
[0032] 步骤(4)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与定容后样品的用量关系最佳为： 300yL: 3mL、70yL: 100yL，其中变色酸溶液的浓度为0 . lg/mL，浓磷酸的质量百分含量为 85%，过氧化氢的浓度为0.025mol/L。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0034] (1)本方法选择磷酸与过氧化氢作为反应介质，避免了浓硫酸的使用，可以提高试 验的安全性，且结果更加准确；
[0035] (2)本方法采用微波加热的方法可以促进反应的进行，缩短反应时间，使实验更为 快捷；
[0036] (3)本方法采用溶剂挥干的方法，可以排除不同提取方法使用溶剂不同，因背景误 差而导致测定结果不一致的问题；
[0037] (4)本方法确定了该反应体系条件下，响应值最高的检测波长，检测灵敏度高。
【附图说明】
[0038] 图1是实施例1中建立的吸光度值-浓度的标准曲线。
【具体实施方式】 [0039] 实施例1
[0040] 本发明方法精密度、稳定性、准确度和回收率情况
[0041] ( - )稳定性测试
[0042] (1)分别取海南粗榧叶片和嫩枝，在105°C烘干30min，然后再在80°C烘干12小时， 粉碎样品后，用40目筛子过滤，获得干粉。
[0043] (2)分别称取叶片和嫩枝干粉3g，加氨水(28% )2mL，加氯仿30mL后，震荡搅拌器搅 拌均勾，浸泡过夜，离心15min(3000r/min)，取氯仿层溶液10mL，通风橱内挥发干氯仿，残渣 用甲醇溶解，转移至lmL容量瓶中定容，设3次重复。
[0044] (3)分别取海南粗榧叶片和嫩枝样液50yL和三尖杉碱标准品溶液100yL (2mg/mL， 采用甲醇配制，购自上海源叶生物科技有限公司，下同），放入50mL的烧杯中，挥发干甲醇， 加新鲜配制的变色酸溶液3 0 0 μ L (0 . 1 g / m L，过滤），加入浓磷酸3 m L、过氧化氢7 0 μ L (0.025mol/L)，摇勾，于微波炉中加热（1200w)35s，取出后室温下冷却，加蒸馏水3mL，摇勾， 冷却至室温后，加水定容至10mL。
[0045] (3)分别在卟、211、411、611、811、1211、2411于波长558腦比色测定，测定的吸光值如表1 所示，分别计算其平均值和相对标准偏差(RSD)。结果表明标准品和样品反应后溶液24h内 检测结果的RSD均在5%以下，三尖杉碱标准品及样品变色反应后溶液24h内显色很稳定。 [0046]表1样品及标准样品反应后溶液稳定性检测结果
[0047]
[0048](二)精密度测试
[0049] 取三尖杉碱标准溶液(2mg/mL，采用甲醇配制）100yL，放入50mL的烧杯中，挥发干 甲醇，加新鲜配制的变色酸溶液3 0 0 μ L (0.1 g / m L，过滤），加入浓磷酸3 m L、过氧化氢7 0 μ L (0.025mol/L)，摇匀，于微波炉中加热（1200w)35s，取出后室温下冷却后，加水定容至10mL。 重复6次。计算平均吸光值，相对标准偏差。
[0050] 检测结果为：平均吸光值为0.4307，相对标准偏差(RSD)为0.59%，表明实验仪器 精密度良好。
[0051] (三)重复性测试
[0052] (1)分别取海南粗榧叶片和嫩枝，在105°C烘干30min，然后再