专利名称：环戊烯酮衍生物的制作方法
技术领域：
本发明是关于可以在医药领域中使用的、具有抗癌作用等生理活性的环戊烯酮衍生物以及该化合物的制造方法。
以往，临床治疗方法中使用的药物涉及烷基化剂、代谢抑制剂、植物生物碱等抗癌药、抗生素、免疫促进剂和免疫调节剂等多种药剂，但这些药物疗法还不能说已经十分完善。
研究报告指出，在这些药物中，由天然物质得来的前列腺素中在5员环上具有α，β-不饱和羰基的前列腺素A和J类能抑制DNA合成，可以作为安全性高的抗癌药，目前已经合成了它们的各种衍生物(参见特开昭62-96438)。
本发明的目的是，研制具有抗癌作用、细胞凋亡诱发作用、抗菌作用等生理作用的环戊烯酮衍生物，提供该化合物的制造方法以及含有该化合物的药物。
为了实现上述目的，本发明人进行了深入的研究，结果发现，使由[III]式表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(以下简称环戊烯酮)与羧酸和/或其反应性衍生物反应，可以生成由[II]式表示的环戊烯酮衍生物，该环戊烯酮衍生物具有很强的癌细胞增殖抑制活性等生理活性。
本发明可以概括如下本发明的第1发明是关于由下列通式[I]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐。
式中，R1和R2是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基，但不包括R1＝R2＝-CH3的情况。
本发明的第2发明是关于由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物与相当于由下列通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的R3、R4的羧酸和/或其反应性衍生物同时或顺次反应。
式中，R3和R4是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基。
本发明的第3发明是关于一种药物，其特征是，该药物含有选自本发明的第1发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的化合物作为有效成分。
本发明的第4发明是关于一种药物，其特征是，该药物含有选自用本发明的第2发明的方法得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分。
在本发明的第3和第4发明中，优选的方案是，上述药物为抗癌药、细胞凋亡诱发剂、抗菌剂。
附图的简要说明
图1是表示二乙酰基环戊烯酮的质谱分析的图。
图2是表示二乙酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图3是表示二苯甲酰基环戊烯酮的质谱分析的图。
图4是表示二苯甲酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图5是表示二己酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图6是表示二肉豆蔻酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图7是表示二辛酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图8是表示二-3-辛烯酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图9是表示二丁酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图10是表示二癸酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图11是表示二戊酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图12是表示二丙酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图13是表示二-2-己烯酰基环戊烯酮的1H-NMR谱的图。
图14是表示(-)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-环戊烯酮的立体结构的图。
图15是表示(+)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-环戊烯酮的立体结构的图。
发明的实施方式下面具体地说明本发明。
本发明中使用的由[III]式表示的环戊烯酮，其4位和5位的羟基的立体构型包括顺式异构体和反式异构体两种情况。在本发明中，可以使用顺式环戊烯酮，反式环戊烯酮，或者顺式环戊烯酮与反式环戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它们的旋光物。
顺式环戊烯酮可以用化学合成法制备[参见(HelveticaChimica Acta)、第55卷、第2838-2844页(1972)]。反式环戊烯酮也可以用化学合成法制备[参见(Carbohybrate Res.)、第247卷、第217-222页(1993)]，另外，还可以通过对糖醛酸(例如葡糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡糖醛酸内酯)等进行加热处理而制备(参见PCT/JP97/03052说明书)。在本发明中，也可以使用含有环戊烯酮的上述加热处理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡糖醛酸，将其1％溶液在121℃下加热处理4小时，使加热处理物中生成环戊烯酮。用溶剂萃取该加热处理物中的环戊烯酮，浓缩萃取物。然后用硅胶柱色谱分离该浓缩物，浓缩溶出的环戊烯酮级分，用氯仿从浓缩物中提取环戊烯酮，对提取的浓缩物进行正相柱色谱分离，离析加热处理物中的环戊烯酮。
环戊烯酮的物性列出如下。环戊烯酮的质谱分析是采用DX302质谱仪(日本电子社制造)进行的。另外，使用重氯仿溶剂的NMR谱的测定是采用JNM-A500(日本电子社制造)。旋光率、UV吸收谱和红外吸收光谱(IR)分别是使用DIP-370型旋光计(日本分光社制造)、UV-2500分光光度计(岛津制作所制造)和FTIR-8000红外分光光度计(岛津制作所制造)。MSm/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化学位移值是以CHCl3的化学位移值为7.26ppm表示的。
旋光度[α]D200°(c1.3、水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收。
对离析的环戊烯酮进行光学离析，可以得到(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。当然，用合成方法得到的环戊烯酮也可以光学离析。
例如，将环戊烯酮溶解在乙醇中，向该乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)，制备环戊烯酮溶液。例如使用Chiral Pack As(ダイセル化学工业)柱，在柱温40℃、流动相己烷/乙醇(94/6)条件下对该试样溶液进行HPLC，可以将环戊烯酮光学离析。
离析的(-)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[以下简称(-)-环戊烯酮]的旋光度是[α]D20-105°(c0.30、乙醇)，(+)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[以下简称(+)-环戊烯酮]的旋光度是[α]D20-104°(c0.53、乙醇)。另外，旋光度是用上述DIP-370型旋光计(日本分光社制造)测定的。
随后，按上面所述的方法，采用质谱分析、核磁共振(NMR)对(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮分别进行结构分析，测定UV吸收光谱和红外吸收光谱。结果，这两种旋光物显示出与光学离析前的环戊烯酮相同的结果。
设经过光学离析的(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮分别为对二甲氨基苯甲酰基衍生物，使用J-720型圆二色性分散计(日本分光社制造)，测定圆二色性光谱(CD)，将所得结果用于二苯甲酸酯手性规则[参见J.Am.Chem.Soc.、第91卷、第3989-3991页(1969)]，确定其立体构型。
图14中示出(-)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-环戊烯酮的立体结构。图中，纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构用[IV]式表示如下
图15中示出(+)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-环戊烯酮的立体结构。图中，纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构用[V]式表示如下
如同图14、15和[IV]式、[V]式所示，(-)-环戊烯酮是(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮，(+)-环戊烯酮是(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
以上使用的环戊烯酮或其旋光物可以用任一方法制造，可以用说明书中所述的方法制造，也可以用化学合成方法合成，在本发明中也可以使用环戊烯酮的反式体、顺式体、它们的混合物以及它们的旋光物。
将环戊烯酮和/或其旋光物与具有直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳酯族基的羧酸和/或其反应性衍生物同时或顺次反应，在反应液中生成本发明的由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物。
具有烷基的羧酸可以使用具有直链或支链的烷基的羧酸，烷基链的链长可以根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当选择。
具有直链烷基的羧酸例如可以使用乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、三十烷酸等。
具有支链烷基的羧酸例如可以使用异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、三甲基乙酸、4-甲基戊酸、1，2-二甲基戊酸等。
具有链烯基的羧酸可以使用具有直链或支链的链烯基的羧酸，链烯基的链长、不饱和度以及不饱和键的位置可以根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当选择。
具有直链链烯基的羧酸例如可以使用丙烯酸、乙烯基乙酸、丁烯酸、异丁烯酸、烯丙基乙酸、2-己烯酸、3-己烯酸、3-辛烯酸、4-癸烯酸、10-十一碳烯酸、9-十六碳烯酸、6-十八碳烯酸、反式9-十八碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、桐酸、二十碳三烯酸、花生油烯酸、二十碳五烯酸、巴西烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、西门木烯酸、21-三十烯酸等。
具有支链链烯基的羧酸例如可以使用甲基丙烯酸、惕各酸、当归酸、α-乙基丁烯酸等。
具有芳基的羧酸例如可以使用苯甲酸、甲苯酸、氯苯甲酸、溴苯甲酸、硝基苯甲酸、苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、水杨酸、乙酰水杨酸、乙酰水杨基水杨酸、氨基水杨酸、对羟基苯甲酸、氨基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、乙酰胺基苯甲酸、香草酸、苔色酸、萘甲酸、吡啶二羧酸、黄尿烯酸、奎尼酸、犬尿烯酸等，可以根据生成的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择所使用的具有芳基的羧酸。
具有芳脂族基的羧酸例如可以使用苯基乙酸、苯基丙酸、苯基乳酸、苯丙酮酸、肉桂酸、阿托酸、萘乙酸等，可以根据生成的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择所使用的具有芳烷基的羧酸。
本发明中使用的羧酸的反应性衍生物例如可以举出酰基卤、酸酐、酸性酯、盐等，可以根据要达到的目的制备所使用的羧酸的反应性衍生物。
羧酸或其反应性衍生物与环戊烯酮的反应，可以按照环戊烯酮衍生物中的R3和R4相同的方式进行，也可以按照R3与R4不同的方式进行。即，可以使R3与R4不同的羧酸同时与环戊烯酮反应，也可以使R3与R4不同的羧酸顺次与环戊烯酮进行反应。此时，通过保护环戊烯酮中的一个羟基，可以高效率地制备R3与R4不同的环戊烯酮衍生物。
环戊烯酮或其旋光物与羧酸反应生成的环戊烯酮衍生物或其旋光物具有很强的癌细胞增殖抑制活性，可以以该活性作为指标从反应液中提纯、分离环戊烯酮或其旋光物。提纯、分离的方法可以采用化学方法或物理方法等公知的纯化方法，可以将凝胶过滤法、利用分子量分级薄膜的分级法、溶剂萃取法、分馏法、使用离子交换树脂的各种色谱法等以往公知的纯化方法组合使用，提纯和离析反应生成物中的环戊烯酮衍生物或其旋光物。
例如，将环戊烯酮或其旋光物、4-二甲氨基吡啶和羧酸溶解在二氯甲烷中，在冰冷却下添加N，N-二环己基碳化二亚胺使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。用硅胶柱色谱提纯生成物，可以离析出目的物环戊烯酮衍生物。
另外，也可以使环戊烯酮或其旋光物与醋酸酐在无水吡啶中反应，从反应物中提纯、分离出二乙酰环戊烯酮。
由本发明得到的环戊烯酮衍生物的旋光物，可以通过消旋混合物的机械分离进行离析，优先选用结晶法离析，作为非对映立体异构物盐或包合物结晶而离析，采用酶·微生物的动力学离析，以及采用色谱进行离析。
采用色谱进行离析，可以使用气相色谱、液相色谱或薄层色谱等，可以使用与它们相适应的手性固定相。
采用液相色谱进行光学离析，可以采用使用手性固定相的方法、使用手性洗提液的方法以及作为非对映立体异构物的分离等方法。
手性固定相可以使用酰胺系固定相、尿素系固定相、配位基交换型固定相、多糖·多糖衍生物固定相、蛋白质固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
洗提液可以使用己烷系、醇系、水(缓冲液)系等，与上述固定相组合适当使用。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物的盐，有些是可以用作药物的盐，可以采用公知的方法转换。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，对于下列癌细胞具有细胞增殖抑制作用人前骨髓性白血病细胞HL-60、人的急性淋巴芽球性白血病细胞MOLT-3、肺癌细胞A-549、SV40形质转换肺细胞WI-38VA13、肝癌细胞Hep G2、结肠癌细胞HCT 116、人的结肠癌细胞SW480、人的结肠癌细胞WiDr、胃癌细胞AGS、骨髓瘤细胞等癌细胞，含有选自本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分的药品，例如可以以选自本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分，将其与公知的药用载体组合形成制剂，制成抗癌药。本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的癌细胞增殖抑制作用对本发明没有任何限制作用，例如，本发明还包含对于癌细胞的细胞凋亡诱发作用。
抗癌药一般可以按下述方法制造，即，将选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物与药学上允许的液体或固体的载体配合，必要时添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固形制剂或通常液剂、悬浮剂、乳剂等溶液剂。另外，还可以制成干燥制品，在使用之前添加适当的载体，形成液状。
药用载体可以根据上述给药方式和剂型加以选择，对于经口给药的制剂来说，例如可以使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，在制备经口给药的制剂时，还可以配入粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，对于非经口给药的制剂来说，将本发明的有效成分即选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物溶解或悬浮于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理食盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，必要时添加杀菌剂、稳定剂、等张化剂、镇痛剂等，制成制剂。
本发明的抗癌药可以采用与制剂形态相应的适当给药途径给药。给药方法没有特别的限制，可以内用、外用或注射。注射剂例如可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射给药，外用剂也包括栓剂等。
抗癌药的给药量可以根据制剂形式、给药方法、使用目的以及患者的年龄、体重、症状等适当设定，不是一成不变的，一般地说，制剂中所含的、选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物的量为成人每日0.2μg～200mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变化，有的时候比上述给药量少，也有的时候比上述给药量多。本发明的药剂除了直接经口给药外，还可以添加到日常的任何食品饮料中摄入。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐具有细胞凋亡诱发活性，可以从这些化合物中选择至少一种化合物作为有效成分，制成细胞凋亡诱发剂。细胞凋亡诱发剂可以按照上述抗癌药中所述的方法制成制剂，并按抗癌药中所述的方法给药。
细胞凋亡诱发剂的给药量可以根据制剂形式、给药方法、使用目的以及患者的年龄、体重、症状等适当设定，不是一成不变的，一般地说，制剂中所含的、选自环戊烯酮衍生物和/或其旋光物的量为成人每日0.1μg～100mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变化，有的时候比上述给药量少，也有的时候超过上述给药量范围。本发明的药剂除了直接经口给药外，还可以添加到日常的任何食品饮料中摄入。
一般认为，细胞凋亡作用与病理学上所说的细胞死亡即坏死不同，是从一开始就编入细胞本身的基因中的死亡。即，任何外部或内部的因素都可能诱发编程细胞凋亡作用的基因活化，基于该基因而生物合成编程性细胞死亡基因蛋白质，由于生成的编程性细胞死亡蛋白质的作用使细胞本身分解，导致死亡。
本发明的细胞凋亡诱发剂可以在所希望的组织和细胞中诱发这种细胞凋亡作用，以自然的形式从生物体中排除不需要的细胞或病源细胞，因而是极其有用的。
本发明的细胞凋亡诱发剂可以在细胞凋亡作用诱发方法中使用。即，使用环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐作为有效成分，可以诱发细胞凋亡作用，该方法对于弄清细胞凋亡诱发基理以及筛选细胞凋亡诱发剂和细胞凋亡诱发抑制剂等十分有用。
本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐具有抗菌活性，可以从这些化合物中选择至少一种化合物作为有效成分制成抗菌剂。抗菌剂可以按上述抗癌药的方法制成制剂，采用与制剂形式相应的适当给药途径给药。给药方法没有特别的限制，可以内用、外用或注射。注射剂例如可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射或皮内注射等给药，外用剂也包括栓剂等。
抗菌剂的给药量可以根据制剂形式、给药方法、使用目的以及患者的年龄、体重、症状等适当设定，不是一成不变的，一般地说，制剂中所含的、选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的量为成人每日10μg～20mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变化，有的时候比上述给药量少，也有的时候超过上述给药量范围。本发明的药剂除了直接经口给药外，还可以添加到日常的任何食品饮料中摄入。
本发明的抗菌剂也可以作为防腐剂，用来提高食品或饮料的保存性。另外，还可以用于将环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐添加到食品或饮料中，防止食品或饮料腐败的方法中。
本发明的抗菌剂对于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有效。另外，本发明的抗菌剂对于龋齿病菌和牙周病菌也具有抗菌活性，可以制成含有本发明的抗菌剂的口腔内用药。口腔内用药的形态可以是液体状或膏状等公知的形态。口腔内用药的例子可以举出牙膏。使用本发明的抗菌剂，还可以提供抗菌性化妆品。另外，使用本发明的抗菌剂还可以提供浴用剂。
本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，可以由环戊烯酮和任意的羧酸或其反应性衍生物高效率地制备。
含有本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐作为有效成分的食品或饮料的制造方法没有特别的限制，可以采用烹饪、加工以及常用的食品或饮料的制造方法制造，只要制得的食品或饮料中含有有效量的选自具有生理作用的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物即可。
本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，将其以生理活性的有效量给药时没有发现毒性。例如，在经口给药的场合，以300mg/kg的剂量将二丙酰基环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二-2-己烯酰基环戊烯酮或其旋光物或者它们的盐中的任一种给小鼠一次性经口给药时，没有发现死亡例。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐可以简便地制造，由于具有各种生理作用，在医药、食品等领域中具有广泛的应用前景。
实施例下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。另外，实施例中的％表示重量％。
实施例1(1)将10g D-葡糖醛酸(シグマ公司制造G5269)溶解在1升的水中，在121℃下加热4小时，然后减压浓缩至10ml左右。向其中添加醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上层40ml，混合后离心分离，在减压下将所得上清液浓缩至约10ml。
将上述提取液加到柱色谱用硅胶BW-300SP(2×28cm，富士シリシア化学社制造)上，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上层作为洗提液，用空气压缩机加压至0.2kg/cm2，以每分钟5ml的流速进行分离。按照每1级分10ml进行分级分离，每1级分取一部分，用薄层色谱分析，从第61至80级分中含有高纯度的环戊烯酮。将这些级分汇集到一起，减压下浓缩，然后用40ml的氯仿萃取，在减压下浓缩萃取液，得到100mg的环戊烯酮。
采用使用Palpack型S柱的正相HPLC分离该级分，用215nm的紫外线吸收进行检测，结果纯度为98％。
将113.9mg上述环戊烯酮溶解在2.85ml乙醇中，再向该乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)3.85ml，制成17mg/ml的环戊烯酮溶液。用0.5μm的过滤器过滤该溶液，将其作为光学离析HPLC试样溶液。
按以下条件对该试样溶液进行光学离析HPLC，分别收集前峰的(-)-环戊烯酮和后峰的(+)-环戊烯酮的级分，减压干固，分别得到(-)-环戊烯酮43.2 mg和(+)-环戊烯酮43.0mg。
光学离析HPLC条件柱Chiral Pack AS(ダイセル化学工业)2.0cm×25.0cm柱温度40℃移动相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/分检测UV210nm试样注入量150μl(2.55mg)按上述条件再次进行光学离析，以使所得到的(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮两者总共含有约1％的对映体。结果，从前峰的(-)-环戊烯酮30.0mg中得到19.7mg不含对映体的(-)-环戊烯酮，从后峰的(+)-环戊烯酮37.4mg中得到27.7mg的不含对映体的(+)-环戊烯酮。另外，(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮的光学离析HPLC的溶出时间分别为33分钟和40分钟。
(2)在按实施例1-(1)所述方法得到的29.6mg环戊烯酮中添加1ml无水吡啶(295-26，ナカライテスク公司制造)和0.1ml醋酸酐(002-26，ナカライテスク公司制造)，在室温下搅拌3小时。用氯仿萃取反应液，得到36mg二乙酰基环戊烯酮。
使用DX302质谱分析仪(日本电子公司制造)对所得到的二乙酰基环戊烯酮进行质谱分析。另外，将其溶解在CDCl3中，用NMR分析其结构。核磁共振装置使用JNM-A500(日本电子公司制造)。测定结果列在下面，其中，1H-NMR的化学位移值是以氯仿的化学位移值为7.24ppm表示。MSm/z 199(M+H)+1H-NMRδ2.12(3H，S，-OCOCH3)，2.16(3H，S，-OCOCH3)，5.16(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，5.89(1H，m，H-4)，6.40(1H，d-d，J＝1.5，6.5Hz，H-2)，7.43(1H，d-d，J＝2.5，6.5Hz，H-3)图1中示出二乙酰基环戊烯酮的质谱，图2中示出其1H-NMR谱。图1中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。另外，在图2中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号的强度。
(3)使用按实施例1-(1)中所述的方法得到15.9mg(-)-环戊烯酮，进行与实施例1-(2)同样的反应，得到15.1mg二乙酰基(-)-环戊烯酮。与上述实施例1-(2)同样利用质谱分析和核磁共振进行结构分析，得到与上述实施例1-(2)同样的结果。
(4)使用按实施例1-(1)中所述的方法得到16.7mg(+)-环戊烯酮，进行与实施例1-(2)同样的反应，得到18.8mg二乙酰基(+)-环戊烯酮。与上述实施例1-(2)同样利用质谱分析和核磁共振进行结构分析，得到与上述实施例1-(2)同样的结果。
(5)13.8mg环戊烯酮中添加44.3mg苯甲酸(041-20，ナカラィテスク公司制造)7.5mg二甲氨基吡啶(DMAP东京化成工业公司制造D1450)和51.0mgN，N’-二环己基碳二亚胺(DCCペフチド研究所制造1001)，添加5ml氯仿，在冰冷却下搅拌4小时。过滤反应液，将所得滤液加到硅胶柱(75ml)上，用氯仿溶出，得到含有二苯甲酰基环戊烯酮的级分。减压除去该级分中的溶剂，将残渣溶解在乙醇中，然后采用以氯仿/甲醇＝99∶1的混合液作为展开溶剂的硅胶薄层色谱进行分离。从薄层中除去Rf＝0.45-0.55部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二苯甲酰基环戊烯酮3.2mg。
与上述实施例1-(2)同样，采用质谱分析和核磁共振对所得到的二苯甲酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。
MS m/z 323(M+H)+1H-NMRδ5.56(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，6.30(1H，m，H-4)，6.54(1H，d-d，J＝T.5，6.5Hz，H-2)，7.44(4H，m，芳香环的H)，7.58(2H，m，芳香环的H)，7.64(1H，d-d，J＝2.0，6.5Hz，H-3)，8.06(4H，m，芳香环的图3中示出二苯甲酰基环戊烯酮的质谱，图4中示出其1H-NMR谱。图3中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度(％)。另外，在图4中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号的强度。
(6)使用22.1mg(-)-环戊烯酮、71.9mg苯甲酸、12.1mg DMAP和80.3mg DCC，进行与上述实施例1-(5)同样的反应，得到19.2mg二苯甲酰基(-)-环戊烯酮。与上述实施例1-(5)同样采用质谱分析和核磁共振进行结构分析，得到与上述实施例1-(5)同样的结果。
(7)使用20.4mg(+)-环戊烯酮、65.6mg苯甲酸、11.0mg DMAP和74.3mg DCC，进行与上述实施例1-(5)同样的反应，得到21.4mg二苯甲酰基(+)-环戊烯酮。与上述实施例1-(5)同样采用质谱分析和核磁共振进行结构分析，得到与上述实施例1-(5)同样的结果。
(8)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和153mg己酸(ナカライテスク公司制造070-26)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mg DCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离、提纯反应液。从薄层中除去Rf＝0.3-0.4部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二己酰基环戊烯酮11mg。
将所得到的二己酰基环戊烯酮溶解在CDCl3，用核磁共振法(NMR)确认。核磁共振装置使用JNM-EX270 FT NMR系统(日本电子公司制造)。另外，1H-NMR的化学位移值是以四甲基硅烷的化学位移值为0ppm表示的。
结果给出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.98Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.76Hz)，1.65(4H，m)，1.26(8H，m)，0.88(6H，t)图5中示出二己酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图5中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(9)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和301mg肉豆蔻酸(东京化学工业公司制造M0476)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mg DCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离反应液。从薄层中除去Rf＝0.45-0.55部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二肉豆蔻酰基环戊烯酮53mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对秘得到的二肉豆蔻基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝5.94Hz，J3-4＝2.31Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝5.31Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.63(4H，m)，1.26(32H，m)，0.88(6H，t)
图6中示出二肉豆蔻酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图6中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(10)将30mg环戊烯酮、10mgDMAP和190mg辛酸(ナカライテスク公司制造071-11)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mg DCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离反应液。从薄层中除去Rf＝0.25-0.35部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二辛酰基环戊烯酮27mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二辛酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝2.16Hz，H-3)，6.41(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝1.48Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H-，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.59Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.29(16H，m)，0.88(6H，t)图7中示出二辛酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图7中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(11)将30mg环戊烯酮、10mg DMAP和190mg辛烯酸(东京化成工业公司制造00070)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mgDCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离反应液。从薄层中除去Rf＝0.25-0.35部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二-3-辛酰基环戊烯酮25mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二-3-辛烯酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.32Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz.H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.55(4H，m)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，3.12(4H，dd，J＝12.85Hz，J＝6.59Hz)，2.04(4H，m)，1.33(8H，m)，0.89(6H，t)图8中示出二-3-辛烯酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图8中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(12)将30mg环戊烯酮、10mgDMAP和115mg正丁酸酸(东京化成工业公司制造B0754)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mg DCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离反应液。从薄层中除去Rf＝0.20-0.30部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二丁酰基环戊烯酮16mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二丁烯酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.13Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.65Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)图9中示出二丁烯酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图9中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(13)将30mg环戊烯酮、10mgDMAP和226mg正癸酸酸(东京化成工业公司制造D0017)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下添加108mg DCC。反应1小时后，用以氯仿作为展开溶剂的硅胶薄层色谱分离反应液。从薄层中除去Rf＝0.35-0.45部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二癸酰基环戊烯酮35mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二癸酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.97Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.3Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.15(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.24Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.26(24H，m)，0.88(6H，t)图10中示出二癸酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图10中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(14)将30mg环戊烯酮、16mgDMAP、66mg三乙胺(东京化成工业公司制造T0424)和122mg正戊酸酐(东京化成工业公司制造V0006)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下反应1小时后，使用以氯仿∶甲醇＝200∶1作为展开溶剂的硅胶薄层色谱展开该反应液，从薄层中除去Rf＝0.7-0.8部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二戊酰基环戊烯酮39mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二戊酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-3)、6.42(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-2)、5.91(1H，m，H-4)、5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)、2.43(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)、2.39(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)、1.65(4H，m)、1.38(4H，m)、0.93(6H，dd，J＝7.26，7.26Hz)图11中示出二戊酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图11中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(15)将30mg环戊烯酮、16m DMAP、66mg三乙胺和86mg丙酸酐(东京化成工业公司制造P0513)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷却下反应1小时，使用以氯仿∶甲醇＝200∶1作为展开溶剂的硅胶薄层色谱展开该反应液，从薄层中除去Rf＝0.5-0.6部分的硅胶，用氯仿萃取，得到二丙酰基环戊烯酮31mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二丙酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.15Hz，H-3)、6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)、5.91(1H，m，H-4)、5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)、2.46(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)、2.42(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)、1.18(6H-，dd，J＝7.59，7.59Hz)图12中示出二丙酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图12中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
(16)将2g环戊烯酮、733mg DMAP、4.1ml反式-2-己烯酸(东京化成工业公司制造H0383)和5.57g DCC溶解在200ml的二氯甲烷中，室温下反应2小时。使用以己烷∶乙酸乙酯＝8∶1作为溶剂的硅胶柱色谱分离该反应液，得到在硅胶薄色谱上显示单一斑点的级分。减压浓缩该级分，得到油状的二-2-己烯酰基环戊烯酮约900mg。
与实施例1-(8)同样，利用核磁共振对所得到的二-2-己烯酰基环戊烯酮进行结构分析，结果给出如下。1H-NMRδ0.92(6H，m，11-H+11’-H)、1.48(4H，m，10-H+10’-H)、2.18(4H，m，9-H，9’-H)、5.22(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)、5.85(2H，m，7-H+7’-H)、5.98(1H，m，4-H)、6.41(1H，dd，J＝1.0，6.0Hz，2-H)、7.04(2H，m，8-H+8’-H)、7.47(1Hdd，J＝2.0，6.0Hz，3-H)另外，将在环戊烯酮的5位上键合的2-己烯酰基的碳原子规定为从羰基起顺序为6位～11位，将在环戊烯酮的4位上键合的2-己烯酰基的碳原子规定为从羰基起顺序为6’位～11’位。
图13中示出二-2-己烯酰基环戊烯酮的1H-NMR谱。在图13中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵横表示信号的强度。
实施例2将二乙酰基环戊烯酮、二乙酰基(-)-环戊烯酮、二乙酰基(+)-环戊烯酮、二苯甲酰基环戊烯酮、二苯甲酰基(-)-环戊烯酮、二苯甲酰基(+)-环戊烯酮、二己酰基环戊烯酮、二肉豆蔻酰基环戊烯酮、二辛酰基环戊烯酮、二-3-辛烯酰基环戊烯酮、二辛酰基环戊烯酮、辛烯酰基环戊烯酮、二丁酰基环戊烯酮、二癸酰基环戊烯酮、二戊酰基环戊烯酮、二丙酰基环戊烯酮和二-2-己烯酰基环戊烯酮各自和1mM乙醇溶液用70％乙醇水溶液稀释。
将各稀释液5μl装入96孔微量滴定板的加样孔中，风干后，在各加样孔中添加含有5000各HL-60细胞(ATCC CCL-240)的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基100μl，在5％二氧化碳存在下37℃培养48小时。用光学显微镜观察细胞的形态，添加5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)磷酸缓冲食盐水溶液10μl，继续培养4小时，然后用显微镜观察细胞的发育状况。另外，添加含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分搅拌，测定590nm的吸光度，用以作为细胞增殖度。以观察不到活细胞的、加样孔的培养基中所含有的最小的环戊烯酮衍生物浓度作为细胞增殖抑制浓度。
结果示于表1中。
表1
在各细胞增殖抑制浓度下，细胞中形成细胞凋亡小体。另外，这些化合物的旋光物也显示出同样的癌细胞增殖抑制活性和细胞凋亡诱发作用。
实施例3将Staphylococcus aureus 3A(NCTC 8319、被检验菌①)、Bacillus subtilis IFO3021(被检验菌②)和Pseu DOMO NAS aeruginosa IFO3081(被检验菌③)用敏感性肉汤培养基(ニッスイ公司制造)培养1夜(种培养)。测定600nm的吸光度，根据预先对各菌株制成的、表示活菌数与600nm的吸光度关系的校正曲线计算出活菌数。用新鲜的敏感性肉汤培养基将培养液稀释成1×106个/ml，在96孔微量滴定板的各孔中分别注入180μl。在各孔中分别加入20μl实施例1-(8)得到的二己酰基环戊烯酮的2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml水溶液或水，在37℃下静置培养一夜(正式培养)。另外，将种培养液的一部分用灭菌水稀释，涂布在敏感性肉汤琼脂平板培养基上，在37℃下培养一夜后，计算菌落数，测定实际的活菌数。
将正式培养后各加样孔中的培养液用灭菌水稀释，涂布在敏感性内汤琼脂平板培养基上，在37℃下培养一夜后，计算菌落数，测定实际的活菌数。
与添加水的加样孔进行比较，以活菌数达到最少的最小浓度作为增殖抑制浓度，以活菌数比正式培养开始时减少的最小浓度作为杀菌浓度。结果示于表2中。
表2中的数值是二己酰基环戊烯酮对于被检验菌①-③显示出增殖抑制作用和杀菌作用的培养液浓度，单位是μg/ml。
表2
由以上所述可以看出，二己酰基环戊烯酮具有很强的抗菌活性，另外，实施例1中制备的其它化合物以及它们的旋光物也显示出与二己酰基环戊烯酮同样的抗菌活性。
实施例4注射剂
(1)在生理食盐水(与上述相同)中添加1％浓度的二乙酰基环戊烯酮或二己酰基环戊烯酮，制成注射剂。
(2)在生理食盐水(与上述相同)中分别以0.5％和0.1％的浓度添加二苯甲酰基环戊烯酮或者二丁酰基环戊烯酮和甘草酸，制成注射剂。
实施例5片剂(1)制备含有100mg二苯甲酰基环戊烯酮和适量微结晶性纤维素的片剂，包上糖衣，制成片剂。
(2)制备含有0.1mg二乙酰基(-)-环戊烯酮、10mg甘草酸二钾和适量微结晶性纤维素的片剂，包上糖衣，制成片剂。
发明的效果本发明提供了具有抗癌作用、癌细胞增殖抑制活性、细胞凋亡诱发作用和抗菌作用等生理活性的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐以及它们的制造方法。使用本发明得到的化合物作为有效成分的药物可以维持生物体的正常状态，是非常有用的药品。
权利要求
1.由下列通式[I]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，
式中，R1和R2是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基，但不包括R1＝R2＝-CH3的情况。
2.药物，其特征是，含有选自权利要求1所述的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分。
3.权利要求2所述的药物，其中，所述的药物是抗癌药。
4.权利要求2所述的药物，其中，所述的药物是细胞凋亡诱发剂。
5.权利要求2所述的药物，其中，所述的药物是抗菌剂。
6.由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物与相当于由下列通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的R3和R4的羧酸和/或其反应性衍生物同时或顺次反应，
式中，R3和R4是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基。
7.药物，其特征是，含有选自用权利要求6所述方法得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分。
8.权利要求7所述的药物，其中，所述的药物是抗癌药。
9.权利要求7所述的药物，其中，所述的药物是细胞凋亡诱发剂。
10.权利要求7所述的药物，其中，所述的药物是抗菌剂。
全文摘要
5－(R
文档编号C07C69/013GK1247528SQ98802459
公开日2000年3月15日 申请日期1998年2月26日 优先权日1997年3月11日
发明者小山信人, 猪饲胜重, 小林英二, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社