本发明涉及植物培育领域，具体而言，涉及一种无病毒栝楼的培养方法。
背景技术：
：栝楼，葫芦科栝楼属多年生草本植物，别名瓜蒌、吊瓜、野葫芦等。《中华医药》记载，其果实、根是常用的名贵中药，栝楼有解热止渴、利尿、镇咳祛痰等作用。种子含脂花肪油；果实含三萜皂苷、有机酸、树脂、糖类、色素；根含蛋白质、皂苷、酸类。栝楼是治疗肺热、肿痛的特效药，近些年发现其还有调节免疫、抗心肌缺血、抗癌抗衰老等医疗和保健作用。目前，栝楼的繁殖主要为无性繁殖方式，即采用块根小段无性繁殖；但栝楼在无性繁殖过程中，容易感染病毒，使优良品种退化。因此，为培育无病毒的栝楼优良种系，特提出本专利技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种无病毒栝楼的培养方法，该培养方法易于控制实施，可在较短的时间内繁殖得到大量的无病毒的优良种系，提高栝楼种苗的品质。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种无病毒栝楼的培养方法，其包括：取栝楼苗的茎尖分生组织，将带有1～2个叶原基的茎尖接种到第一培养基中进行培养，直至培养出含20～30个小芽的芽丛；将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1～2cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株并转入第三培养基中进行生根培养，得到组培苗。一种栝楼的脱毒培养方法，其包括：取栝楼苗的茎尖分生组织，将带有1～2个叶原基的茎尖接种到第一培养基中进行培养，直至培养出含20～30个小芽的芽丛；其中，第一培养基是由ms培养基与0.45～0.55mg/l的6-苄氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本公开内容提供的这种无病毒栝楼的培养方法，采用带有1～2个叶原基的茎尖进行愈伤组织培养，使其生长、分化形成无病毒的栝楼苗。该方法是基于病毒在植物体内分布不均匀的理论，即植物的茎尖分生组织一般不带病毒的，所以通常采用0.1毫米左右的茎尖分生组织，带1-2个叶原基，进行培养，即可得到无病毒种苗，故而无需进行病毒鉴定工作即可进行扩大繁殖。该培养方法易于控制实施，操作相对较简单，成苗时间短，可在较短的时间内繁殖得到大量的无病毒的优良种系，提高栝楼种苗的品质。通过这种培养方法培育的无病毒栝楼，具有生长健壮、不带病毒、品质优良的特性，从而大幅提高栝楼药材的质量和药效。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种无病毒栝楼的培养方法，其包括下述步骤：步骤s1初代培养：取栝楼苗的茎尖分生组织，将带有1～2个叶原基的茎尖接种到第一培养基中进行培养，直至培养出含20～30个小芽的芽丛。在本实施方式中，栝楼苗既可以为无菌苗，也可以为大田两年生的正常苗，都可以满足初代培养的植株取材需求。较为具体的，将栝楼苗在无菌条件和解剖显微镜下剥取茎尖分生组织，以带有1～2个叶原基的茎尖为度，茎尖分离后，迅速接入第一培养基中。值得强调的是，由于本实施方式提供的培养方法，选用的植物组织为茎尖分生组织，该分生组织一般不带病毒，所以采用0.1毫米左右的带1～2个叶原基的茎尖分生组织，进行培养，即可得到无病毒苗，故而无需进行病毒鉴定工作即可进行扩大繁殖。可选择的，培养茎尖的条件为：环境温度23～28℃、日照时间13～14h、光照强度1200～1300lx、相对湿度75～85％。进一步优选的，培养茎尖的条件为：环境温度24～27℃、日照时间13.4～13.7h、光照强度1230～1280lx、相对湿度78～82％；更为具体的培养条件为：环境温度25℃、日照时间13.5h、光照强度1250lx、相对湿度80％。在这些条件下，进行茎尖分生组织的培养，茎尖所处的环境适宜，生长和分化速度快，能够在相对较短的时间内长出小芽，形成芽丛，发芽率高、培养周期短。进一步的，第一培养基是由ms培养基与0.45～0.55mg/l的6-苄氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的；或者第一培养基是由ms培养基与0.5mg/l的6-苄氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。第一培养基采用ms培养基为基础培养基，其中，ms培养基具有无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基础培养基。ms培养基可以采用现有技术中的配方进行配置。当然，也可以用其他配比的ms培养基。在本发明较佳的实施例中，发明人经过多次实践探索之后，优选得到的ms培养基的重量百分比组分为：30-35％的硝酸铵、40-42％的硝酸钾、7-8％的硫酸镁、8-10％的二水氯化钙、3.5-4％的磷酸二氢钾、1.2-1.5％的铁盐、0.05-0.1％的微量元素，余量为有机物。其中，铁盐为乙二胺四乙酸二钠与硫酸亚铁的混合物，二者的质量比为10～11：9。微量元素由碘化钾、硼酸、一水硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴的一种或多种组成，有机物由肌醇、烟酸、vb6、vb1、甘氨酸的一种或多种组成。采用这种ms培养基为基础培养基，其所含的离子浓度更加适合瓜蒌子茎尖的生长、分化。6-苄氨基嘌呤，是一种人工合成的细胞分裂素，能够诱导芽的分化。萘乙酸，是一种光谱型的植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。发明人通过调节这两种激素的含量，得到一种能够促进茎尖诱导和分化的培养基，无需分步培养，且生长快，分化率高。步骤s2继代培养：将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1～2cm的丛生苗。可选择的，第二培养基是由ms培养基与0.09～0.11mg/l的6-苄氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。较为优选的，第二培养基是由ms培养基与0.10mg/l的6-苄氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。该培养基适合芽丛的诱导分化，发育成丛生苗。可选择的，该培养方法还包括：将丛生苗分成单株后再转入另一个第二培养基中进行扩大培养，得到大量的丛生苗。此为扩大繁殖步骤，由于一个芽尖分化得到的芽丛数量有限，为了避免反复取材进行初代培养，在本发明较佳的实施例中，将继代培养后得到的1～2cm的丛生苗分成单株，再重新接种至新的第二培养基中，进行分化培养，由此可得到大量的丛生苗，大幅提高培养效率，缩短培养时间以及降低培养成本。步骤s3生根培养：将丛生苗分成单株并转入第三培养基中进行生根培养，得到组培苗。可选择的，第三培养基是由ms培养基与0.18～0.22mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。较为优选的，第三培养基是由ms培养基与0.20mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。吲哚丁酸，使一种植物生长激素，能够促进植物生长，尤其是促进植物根系的生长发育。该培养基适合丛生苗的诱导分化，能够促进丛生苗根系的生长。进一步的，在本发明较佳的实施例中，还包括将组培苗进行驯化培养。通过驯化培养，筛选得到长势健壮、不带病毒、品系优良的栝楼植株。可选择的，驯化培养包括：将组培苗根部的培养基清洗后晾置0.5～1.5h，再将组培苗插入基质中进行培养；其中基质为经消毒处理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。进一步的，为了提高根系的成活率，将组培苗根部的培养基清洗后，于温度为18～22℃、湿度为78～82％的环境下晾置0.5～1.5h，优选的，将组培苗根部的培养基清洗后，于温度为20℃、湿度为80％的环境下晾置1h，进行移栽。更为具体的，将组培苗插入基质中，压实组培苗基本周围的基质，浇透水，以利幼苗基部和基质紧密接合，直至根系生出，逐渐降低湿度和土壤含水量。通过上述培养方法培育得到的栝楼，具有生长健壮、不带病毒、品质优良的特性，从而能够大幅提高栝楼药材的质量和药效。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：实施例1本实施例提供一种无病毒栝楼的培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有1个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出30个小芽的芽丛。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.45mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.09mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.22mg/l)。实施例2本实施例提供一种无病毒栝楼的培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有1个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出25个小芽的芽丛。培养条件为：白天温度为28℃，夜间温度为25℃、日照时间14h、光照强度1200lx、相对湿度85％。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1.5cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。实施例3本实施例提供一种无病毒栝楼的培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有2个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出20个小芽的芽丛。培养条件为：白天温度为26℃，夜间温度为23℃、日照时间13h、光照强度1300lx、相对湿度75％。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.55mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出2cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.11mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.18mg/l)。实施例4本实施例提供一种无病毒栝楼的培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有1个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出25个小芽的芽丛。培养条件为：白天温度为27℃，夜间温度为24℃、日照时间13.5h、光照强度1250lx、相对湿度80％。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1.5cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，再转入另一个所述第二培养基中进行扩大培养，得到大量的丛生苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。实施例5本实施例提供一种无病毒栝楼的培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有1个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出25个小芽的芽丛。培养条件为：白天温度为27℃，夜间温度为24℃、日照时间13.5h、光照强度1250lx、相对湿度80％。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1.5cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，再转入另一个所述第二培养基中进行扩大培养，得到大量的丛生苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。e.将组培苗根部的培养基清洗后晾置1h，再将组培苗插入基质中进行培养；其中基质为经消毒处理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。对比例1本对比例提供一种栝楼种苗，其培育方法，其包括：a.按常规方法配制ms培养基。b.取栝楼的无菌苗在无菌条件和解剖显微镜下，解剖剥取茎尖分生组织(20个)，以带有1个叶原基的茎尖为度,茎尖分离后，迅速接入第一培养基中进行培养，直至培养出20个小芽的芽丛。培养条件为：白天温度为30℃，夜间温度为25℃、日照时间12h、光照强度1500lx、相对湿度75％。其中，第一培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.1mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.将芽丛转入第二培养基中，培养至长出1cm的丛生苗后，将丛生苗分成单株，并转入第三培养基中进行生根培养，得到无病无的栝楼组培苗。其中，第二培养基包括：ms培养基+6-苄氨基嘌呤(0.12mg/l)+萘乙酸(0.07mg/l)。第三培养基包括：ms培养基+吲哚丁酸(0.27mg/l)。观察实施例1～5以及对比例1在在培养过程中的分化情况，并记算出芽数、分化率、出苗总数和出苗率，结果如表1所示：表1.实施例1～5以及对比例1的培养结果分化出芽的芽尖数(个)分化率(％)出苗总数(株)出苗率(％)实施例11470％1890％实施例21575％20100％实施例31680％24120％实施例41680％67335％实施例51785％70350％对比例1735％1575％由表1可知，本发明实施例1～5所提供的培养方法，用20个植物分生组织进行培养，分化出芽的芽尖数在14个以上，分化率(分化出芽的芽尖数/接入的芽尖数×100％)在70％以上，远大于对比例1提供的培养方法(分化出芽的芽尖数为7个，分化率为35％)，由此可见，本发明实施例1～5所提供的培养方法，在芽尖分化培养阶段，分化率高、且分化出芽生长快；进一步培养后的，实施例1～5中，由于培养基营养好，培养条件适宜，芽生长快，植物健壮，因此出苗率(出苗数/接入的芽尖数×100％)高达90％以上。值得注意的是，实施例4～5的出苗率高达330％以上，这主要是因为在培养得到丛生苗之后，还将其分成单株后，进行扩大培养，得到大量的丛生苗，从而大幅提高丛生苗的数量。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12