一种沼泽小叶桦离体芽快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种沼泽小叶桦离体芽快繁方法。技术背景我国大陆沿海海岸线长18000km，拥有滩涂面积21709km2，且以每年300km2的速度继续淤长。滩涂生态系统受海陆系统的双重干扰，土壤发育时间短，盐分含量高，造成了滩涂自然生态新系统的脆弱性和不稳定性。加之台风、暴雨、冰雹、龙卷风等灾害性天气频繁，每年造成的经济损失达10.6亿元，当地生态安全和社会经济发展受到严重影响。目前，沿海滩涂造林树种缺乏，大面积的滩涂处于荒芜状态，选育和引进耐盐树种成为沿海滩涂造林绿化、合理开发和利用的关键。沼泽小叶桦为落叶小乔木，具有较强的耐盐和耐水能力，可在高盐、高水位环境下生长，在沿海和低湿地上具有应用的潜力。调查发现，我国约有500余种盐生植物，其中木本植物所占比例稀少，由于沼泽小叶桦在改造和利用盐渍土方面特性，将是优良的候选树种之一。在我国广阔的东部沿海滩涂地区，如果能将沼泽小叶桦引种到这些地区，将能丰富该地区的植被类型，改善生态环境。然而，沼泽小叶桦是极为稀有和濒临灭绝的温带落叶阔叶树种，为国家二级重点保护濒危植物，其嫩枝扦插极难生根，目前主要采用种子繁殖，不能规模化育苗，严重限制了沼泽小叶桦的引种移栽及深入研究。因此，需要采取其他方式来提高其繁殖能力。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术存在的外植体污染、褐化、玻璃化现象等阻碍植物组培工作的问题，提供一种繁殖速度快，生产周期短、增殖系数高且成活率高的沼泽小叶桦离体芽快繁方法，通过外植体选择及消毒、启动诱导培养、继代增殖培养、生根诱导培养、炼苗移栽等过程实现沼泽小叶桦离体快繁。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，包括以下步骤：1)挑选株高1～1.5m的未萌动的健壮植株，4～5月份采主枝顶芽、主枝侧芽、侧枝顶芽的新生芽作为外植体；2)在超净工作台上，先用70％的酒精处理外植体20s，再用0.1％升汞消毒5～20min，10％naclo消毒0～20min，用无菌水冲洗数次；3)将处理好的外植体在无菌的条件下接种到初代培养基上，初代培养基成分为：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.5～1.0g/lpvp，培养20d以上；4)将外植体转入增殖培养基，增殖培养基成分为：ms+0.4～0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，培养时间20d以上获得小苗；5)将小苗进行生根培养，生根培养基成分：ms+0.1～0.5mg/lnaa，或1/2ms+0～0.5mg/lnaa，培养20d以上；7)炼苗移栽：选择健壮的无菌苗，用多菌灵溶液浸泡清洗后，移栽到已消毒的蛭石+珍珠岩的基质中，先保湿培养一周，逐渐去掉盖子。步骤1)中，在新生芽萌动前，用50％的多菌灵可湿性粉剂喷洒植株，一周两次，直到植株吐芽、取材为止。步骤1)中，从健壮枝条上采回新生芽，用试管刷蘸洗衣粉轻轻刷洗，流水冲洗表面污物2～3h。步骤2)中，先用70％酒精处理20s，再配合0.1％升汞处理10min，后用无菌水冲洗4-5次。步骤3)中，初代培养基成分为：ms+0.8～1.0mg/l6-ba+1.0g/lpvp。步骤4)中，增殖培养基成分为：ms+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，或ms+0.4mg/l6-ba+0.02mg/lnaa。步骤5)中，生根培养基成分：ms或1/2ms+0.1或0.5mg/lnaa。有益效果：与现有的技术相比，本发明以沼泽小叶桦离体芽为外植体，建立了组培繁殖体系。通过酒精和升汞预处理母本材料，大大降低了外植体的污染率，使外植体成活率最高可达74.19％，污染率降为25.81％。初代培养基中添加pvp，使褐化现象消失，大大降低了组培风险，提高了成活率。本方法得到的组培苗具有增殖系数高，生根率高，栽植成活力高等特点。有利于沼泽小叶桦的保护与开发，具有广泛应用前景。附图说明图1是6-ba浓度过高时，初生代培养无菌苗图。图2是取材时间对污染率的影响结果图。图3是不同植物调节剂对沼泽小叶桦无菌苗生根的影响图(a.ms无添加剂的生根；b.0.1mg/lnaa生根；c.少量多效唑生根；d.多量多效唑生根)。具体实施方式以下结合实例对本发明进一步详细说明。以下实施例中，所使用的材料和试剂如下：材料：挑选株高1～1.5m左右的未萌动的健壮植株，3～7月间采健壮枝条上的新生芽作为试材。在新生芽萌动前，用50％的多菌灵可湿性粉剂喷洒植株，一周两次，直到植株吐芽、取材为止。从健壮枝条上采回新生芽，用试管刷蘸洗衣粉轻轻刷洗，流水冲洗表面污物2～3h，在无菌条件下，用70％酒精进行表面消毒，再用消毒剂溶液处理。消毒后切除芽体基部与药液接触的部分，接种于无菌培养基上。ms培养基：琼脂粉7.0g/l，蔗糖30g/l，用1mol/l的hcl和naoh将培养基ph调到6.0，煮沸，待琼脂彻底融化后，分装到广口培养瓶中，用透气性无菌塑料封口膜包扎培养瓶，在121℃下，高压灭菌20min，后取出，放于培养室内，冷却凝固后待用。若无特殊说明，所有培养条件均为：日光灯照明，培养温度为(25±2)℃，空气相对湿度50～60％，光照时间12～13h/d，光强为1500～2000lx。数据统计与分析方法：用excel进行数据处理和作图，spss软件进行数据分析。污染率(％)＝污染的外植体数/接种外植体总数×100％；死亡率(％)＝未污染外植体的死亡数/接种外植体总数×100％；萌芽率(％)＝未污染外植体芽萌动个数/接种外植体总数×100％；增殖系数＝增殖周期结束时苗高大于1.0cm的芽苗总数/增殖周期起始时的芽苗数平均株高(cm)＝培养周期结束时幼苗株高之和/接种时幼苗总数；生根率(％)＝生根的苗数/培养的苗数×100％；平均根数(条)＝根总数/生根株数；平均根长(cm)＝生根苗根总长/生根苗总数。实施例1沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，以沼泽小叶桦的新生芽为外植体，在超净工作台上，先用70％的酒精处理20s，后用0.1％的hgcl2或10％的naclo消毒剂采用不同的消毒时间(表1)消毒后，用无菌水冲洗5次。经消毒后的外植体放到铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干材料表面的水分，用手术刀切掉基部与药液接触的部分，将芽鳞和未展开的托叶切除，接种到ms+6-ba1.0mg/l生长培养基上，每个处理接12瓶，每瓶接3个外植体，定期观察记录，接种25d后统计污染率、死亡率及萌芽率。表1不同消毒剂和消毒时间的设计处理号70％酒精(s)0.1％hgcl2(min)10％naclo(min)120002205032010042015052020062005720010820015920020外植体消经毒处理后接种到培养基中培养，2～3d后部分外植体基部接触培养基的部分周围有水浸状物质产生，呈无色或透明乳白色。随着时间的延长，部分该物质逐渐消失。5d左右，部分培养基表面变得粗糙，有细菌污染的现象，菌落点点状或带水状，颜色红色或黄色等。一周左右开始有霉菌污染，主要分布在芽的表面或芽鳞片的伤口处，菌丝有白色或黑色，并且呈逐渐扩大的趋势。部分芽无污染，不启动，褐变死亡。在只用70％酒精处理20s时，污染很严重，成活率极低，虽然存活下来的外植体生长良好，也不能将其作为消毒的最佳方式(表2)。而当70％酒精和0.1％hgcl2或10％naclo搭配使用时，外植体消毒效果明显改善，污染率降低，且成活率显著提高。0.1％的hgcl2处理时，最佳消毒时间为10min，成活率最高达74.19％，并且外植体长势良好，叶片深绿。10％naclo处理的最佳时间为10min，成活率最高可达72.22％，叶片浅绿色，长势良好。当两种消毒剂处理20min时，污染率虽降低，但由于时间过长，外植体成活率明显下降，生长状况不理想，长势不佳。表2不同消毒处理的影响处理号接种总数污染率成活率生长状况13683.00％10.10％叶片深绿，长势良好23635.00％65.00％叶片深绿，长势良好33625.81％74.19％叶片深绿，长势良好43620.57％71.43％叶片深绿，长势一般53617.89％42.11％萌动较慢63638.89％61.11％叶片浅绿，长势良好73627.78％72.22％叶片浅绿，长势良好83622.22％66.67％叶片浅绿，长势良好93616.67％47.78％叶片浅绿，茎秆细弱实施例2一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，包括以下步骤：1)外植体的建立：挑选株高1～1.5m左右的未萌动的健壮植株，4～5月份采主枝顶芽、侧芽以及侧枝顶芽等新生芽作为植体材料。在新生芽萌动前，用50％的多菌灵可湿性粉剂喷洒植株，一周两次，直到植株吐芽、取材为止。为减少材料污染，从健壮枝条上采回新生芽，用试管刷蘸洗衣粉轻轻刷洗，流水冲洗表面污物2～3h。2)外植体的消毒：用步骤1)得到的外植体，在超净工作台上，先用70％的酒精处理20s，再用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗5次。3)初代培养：将处理好的外植体在无菌的条件下接种到初代培养基上，成分为：ms+1.0mg/l6-ba+0～1.0g/lpvp，培养温度：25±2℃，空气相对湿度50～60％，光照时间：12～13h/d，光强：1500～2000lx，培养时间：25d。初代培养处理好的外植体需放到铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干材料表面的水分，用手术刀切掉基部与药液接触的部分，将芽鳞和未展开的托叶切除。5)增殖培养：将外植体转入增殖培养基，成分为：ms+1.0g/lpvp+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，培养时间25d。6)生根培养：将小苗进行生根培养，生根培养基成分：ms+1.0g/lpvp+0.1～0.5mg/lnaa，培养至25d。7)炼苗移栽：选择健壮的无菌苗，用多菌灵溶液浸泡清洗后，移栽到已消毒的蛭石+珍珠岩(体积比1:1)的基质中，先保湿培养一周，逐渐去掉盖子。采用pvp防治外植体的褐化，向培养基中添加不同浓度的pvp(表3)，接种处理好的外植体，每处理10瓶，每瓶3个，定期观察记录，25d后统计褐化率、褐斑直径大小。表3不同浓度的pvp防褐化处理从表3可以看出，防治外植体褐化的最佳处理为3号处理，即在培养基中添加1.0g/l的pvp，可以有效降低褐化率，达到较好的防治效果，后续实施例君采用此操作。未添加pvp的1号处理，接种当天外植体基部即出现浅色褐斑，3～4天时褐斑颜色最深，褐斑直径最大可达1.2cm。随时间延长，褐斑有变浅消失的迹象，但外植体长势不佳，基部切口处有长约0.2cm变的干枯、褐色，植株吸收营养受限制，生长受到抑制，严重时褐变死亡，如1号、2号处理。4号处理虽无褐化现象发生，但由于pvp浓度偏高，外植体叶尖有干黄现象发生。实施例3一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，同实施例2，其中在初生代培养时，以ms为基本培养基，在培养基中添加1.0g/l的pvp和不同浓度的6-ba(表4)，每个处理10瓶，每瓶3个外植体，25d后统计萌芽率。表4表明，外植体的萌芽率随着6-ba浓度的增加而升高。未添加6-ba时，萌芽率最低，为16.67％，无愈伤形成，但生长较为缓慢；添加量大于0.8mg/l时萌芽率可达90％以上，虽基部有半球状愈伤形成，但植株长势良好；添加量为1.5mg/l时，萌芽率最高为96.67％，此时茎秆细长，基部愈伤呈球状(图1a)，较大较硬，叶片较薄，颜色发黄，长势不佳(图1b)。表4外植体萌芽率结果实施例4一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，同实施例2，其中分别于2013年3～7月份取当年生新芽，经70％酒精处理20s，再用0.1％hgcl2处理10min后，接种于ms+6-ba1.0mg/l+1.0g/lpvp。每个处理15瓶，每瓶3个外植体，接种25d后统计污染率、死亡率及启动率。由图2可以看出外植体的污染率呈先降低后升高的趋势，在4月份取最低值为30％，到7月份污染率最高为66.67％；成活率曲线先升高后缓慢降低，4月份的成活率为70％，5月份成活率为73.33％，然后缓慢下降，7月份虽有66.67％，但明显高出3月的成活率很多。外植体的死亡率在3月份最高，5月份最低，6、7月份稍有增加，但仍明显低于3月份。综合3条曲线来看，外植体的最佳取材时间为4月底至5月底。实施例5一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，同实施例3，其中于4月下旬取主枝和侧枝的顶芽和侧芽，经70％酒精处理20s，在用0.1％hgcl2处理10min后，接种于ms+6-ba1.0mg/l+1.0g/lpvp。每处理15瓶，每瓶3个外植体，接种后25d统计污染率、死亡率、启动率及外植体生长状况。对比不同取材部位外植体萌动情况如表5，结果表明主枝顶芽的萌芽率最高达83.33％，与主枝侧芽、侧枝顶芽的萌芽率没有显著差异，而与侧枝侧芽的萌芽率50％差异显著，并且其萌动快、叶色绿、苗健壮，是最佳的取材部位。由于顶芽的顶端优势，使得侧枝顶芽的萌芽率73.33％与主枝上营养较为充足的侧芽萌芽率76.67％间差异不显著，外植体生长状况较好，可以作为摘取外植体的选择部位。因此，此试验应选取主枝顶芽、主枝侧芽、侧枝顶芽为外植体，三者平均萌芽率为77.77％。表5不同取材部位外植体萌动情况比较不同部位萌芽率(％)苗高生长状况主枝顶芽83.33±14.14a3.5cm萌动快，后期苗高生长快，健壮主枝侧芽76.67±4.72a2.8cm萌动慢，长势较均匀，苗高较低侧枝顶芽73.33±9.42ab3.2cm萌动较快，苗高生长较快，较健壮侧枝侧芽50.00±4.71b2.5cm萌动慢，长势较弱，苗高较低实施例6一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，同实施例2，其中在增殖培养阶段，以ms为基本培养基，添加6-ba、naa，浓度及组合配比如(表6)，每处理10瓶，每瓶3个外植体，定期观察芽的长势，培养25d后，统计增殖芽的数目，并计算增殖系数。不同浓度的6-ba和naa对继代苗增殖的影响如表6所示，4号处理组合即ms+0.6mg/l6-ba+0.02mg/lnaa的增殖系数最高，增殖系数达3.70，显著高于其他处理组合；其次是8号处理，增殖系数为3.40；再次优选处理组合为3号，即ms+0.4mg/l6-ba+0.02mg/lnaa，增殖系数为2.80；增殖系数最小的是13号组合ms+0.05mg/l6-ba+1.5mg/lnaa，增殖系数仅为1.07。试验过程中，继代苗的生长状态相差很大。1～4号处理中继代苗基部无愈伤产生，形成腋芽及丛生芽，且长势良好；13～16号处理中，继代苗基部肿大，有愈伤组织形成，愈伤组织上产生大量的不定根，并且下部叶片的切口和叶脉处也形成了大量的不定根，不定根较短，外披绒毛，植株叶片发黄，长势不佳，可以看出此类不定根的吸收功能较差。表6植物生长调节剂对继代苗增殖的影响编号6-banaa增殖系数10.10mg/l0.02mg/l1.53±0.12defg20.20mg/l0.02mg/l1.80±0.36d30.40mg/l0.02mg/l2.80±0.18c40.60mg/l0.02mg/l3.70±0.14a50.10mg/l0.05mg/l1.20±0.09ij60.20mg/l0.05mg/l1.50±0.17efg70.40mg/l0.05mg/l1.70±0.50edf80.60mg/l0.05mg/l3.40±0.18b90.10mg/l0.10mg/l1.27±0.13ij100.20mg/l0.10mg/l1.53±0.13defg110.40mg/l0.10mg/l1.67±0.07edf120.60mg/l0.10mg/l1.77±0.12de130.05mg/l1.50mg/l1.07±0.06j140.10mg/l1.50mg/l1.17±0.06ij150.15mg/l1.50mg/l1.43±0.09fgh160.20mg/l1.50mg/l1.17±0.08ij实施例7一种沼泽小叶桦的离体芽快繁方法，同实施例2，其中在生根培养阶段，选用材料为1.5～2.0cm，较健壮、长势一致的无根苗。选用1/3ms培养基、1/2ms培养基和ms培养基作为不同处理，相互对照。每个处理20瓶，每瓶3株无根苗，进行生根培养。25d后统计每个处理的生根率、平均生根条数、平均根长和植株生长状况。待小苗长至2.0～3.0cm，接种到生根培养基中进行生根培养。一周左右在无菌苗的基部产生白色点状突起，随着时间的延长，这些点状突起继续伸长，长出白色的根。表7中可以看出，1/3ms培养基生根较早，生根率为86.67％，但平均生根条数和根的长度均较1/2ms和ms培养基的少和短，并且由于大量元素的不足，无菌苗茎秆细长叶片发黄，植株长势不佳。1/2ms培养基的生根率最高，为90.0％，但平均生根条数低于ms培养基，且没有侧根形成。ms培养基的生根率较低，但无菌苗植株健壮，根较粗有侧根形成，长势良好。表7不同培养基对生根的影响以1/2ms培养基和ms培养基以及不同浓度的naa组合成10个处理(表8)，每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体，25d后统计各处理的生根率、平均生根数、平均根长以及植株生长状况。表8生根培养基中naa浓度添加量处理号1/2ms(mg/l)ms(mg/l)10.1-20.5-31.0-41.5-52.0-6-0.17-0.58-1.09-1.510-2.0不同浓度的naa对生根的影响如表9和图3a、图3b所示，以1/2ms为基本培养基时，随着naa浓度的增加，无菌苗的生根率逐渐降低，最高94.44％，最低为61.11％；平均生根数逐渐升高，最低3.12，最高9.45；根长下降趋势明显，最长为4.0～4.5cm，最短1.5～2.0cm；以ms为基本培养基时，除生根率先升高后降低外，平均生根数、根长范围的变化规律均与1/2ms培养基一致。结果表明，naa在调节沼泽小叶桦无菌苗生根过程中起着重要的促进所用，，但浓度高于1.0mg/l时，无菌苗基部愈伤较大，分化出大量的根，这些根呈短粗的锥形，土黄色或浅红色，根尖红色，暴露在培养基外部的根有绒毛，上部植株矮小，叶片枯黄，发育不良。控制naa浓度在0.1～0.5mg/l时促进单株生根，促进根长生长。表9不同浓度naa对生根的影响以ms为基本培养基，添加不同浓度的多效唑(表10)，研究多效唑对生根的影响。每个处理接种8瓶，每瓶3株无根苗，25d后统计各处理的生根率、平均生根条数、平均根长及植株生长状况。多效唑对无菌苗生根的作用见表10和图3c、图3d，相对于零添加的ms培养基，0.25mg/l的多效唑对无菌苗生根具有促进作用，可使生根率达83.33％，平均生根数为3.40，根长稍短缩，为2.5～3.0cm。多效唑浓度增加，生根率呈逐渐降低至33.33％，根伸长减短至1.0cm以下，而已生根的无菌苗平均生根数变化规律不明显。多效唑的应用，使得无菌苗植株节间短缩，株高生长不明显，苗高在1.5～2.5cm间；每株3～6片叶不等，叶片生长受到抑制，较小较厚，叶色深绿；基部无愈伤组织形成，根较短较粗，呈均匀短棒形，随时间的延长由米白色渐变为褐色或黑色，发生老化。表10不同浓度多效唑多生根的影响将优选的基本培养基和添加naa、多效唑的优选生根培养基进行差异显著性分析如表11，添加naa的2、3、5、6号培养基的生根率与其他培养基差异显著，生根率最高为97.30％；就平均生根比较，3、5、6、8号培养基明显优于其他生根方法，平均生根最多的为8号处理，3.93，其次是6号处理平均生根3.83；多效唑的添加明显抑制了根的伸长生长，最佳处理为添加naa的2、3、5、6号培养基。对比分析，得出最佳生根培养方法是6号处理，即ms+0.5mg/lnaa，获得无菌苗植株健壮，株高5.0～6.0cm，叶片绿色，根星状分布，白色，细长，部分有侧根形成。表11优选生根培养基的对比分析编号生根方法生根率/％生根数(条)根长(cm)11/2ms90.00±2.36b2.78±0.65d3.75±0.54a21/2ms+0.1mg/lnaa94.44±2.21a3.12±0.11cd4.25±0.26a31/2ms+0.5mg/lnaa94.44±0.85a3.59±0.12abc4.25±0.42a4ms81.66±1.75c2.90±0.22d3.75±0.21a5ms+0.1mg/lnaa94.44±3.56a3.71±0.15ab4.25±0.39a6ms+0.5mg/lnaa97.30±1.46a3.83±0.14ab4.25±0.23a7ms+0.25mg/l多效唑83.33±3.00c3.40±0.64bc2.75±0.22b8ms+0.5mg/l多效唑77.78±1.04d3.93±0.13a1.25±0.23c当前第1页12