本发明所属植物组织培养研究领域，本发明涉及一种黑松无菌快速繁殖方法。
背景技术：
黑松(pinusthunbergii)原产日本，于上世纪20年代引种中国，因具有耐干旱瘠薄、抗海风海煞、抗松干蚧和松毛虫等病虫害、树型优美等特点，成为了我国东部沿海沿防林建设中不可取代的优势种，北起大连、旅顺南至台湾沿海地区及内陆部分地区均有栽培。初引种之时，黑松具有生长速度较快、抗病虫能力强的特点，但是近些年的调查数据表明，黑松在生活力、生长速度、抗逆性、林木品质、观赏价值上都有不同程度的下降，特别是抗病性严重下降，容易感染黑松枝枯病和线虫病。目前黑松苗木的培育以种子繁殖为主，种子市场管理混乱，导致黑松种子纯度严重下降和品质的退化，所以市场上的黑松苗木品质也在逐年退化。因此，筛选野生优良个体，并对其进行保种繁殖成为了黑松育种的一个重要方法，组织培养工作者试图对个别抗病植株进行室内无菌繁殖方法研究，以期在室内短期内获取无毒无菌幼苗。目前黑松再生苗有成功诱导都以合子胚为外植体，由合子胚直接诱导不定芽的产生或诱导胚性愈伤组织再形成体细胞胚，进而发育形成无菌苗，未见有通过愈伤组织增殖再经茎芽分化形成再生苗的技术报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种黑松无菌快速繁殖方法，采用黑松针叶为外植体有效地获得愈伤组织，并在短时间内使愈伤组织大量增殖，后进一步分化形成无菌苗，炼苗、移栽实现快速繁殖。本发明的具体步骤如下：
1)外植体的选取：于春季采集树龄在7年以下幼年黑松顶端的幼嫩松枝，将其上的松针连鞘拔下，清洗后在超净工作台内进行消毒处理，得到无菌的松针；
2)愈伤组织的诱导培养：在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段，接种于诱导培养基中，于25℃、黑暗条件下进行培养。其中，所述诱导培养基配方如下：以ms培养基为基本培养基，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、6-ba2mg/l+naa0.05mg/l。培养15d后针叶基片段部开始产生愈伤组织，3周后诱导率为47.2％；
3)愈伤组织的增殖：将诱导出的愈伤组织转接于增殖培养基上，于25℃、光照强度为1500lux条件下进行培养，使愈伤组织活力增强并大量增殖。其中，所述增殖培养基是以1/2ms为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l、naa0.05mg/l+psk0.001mg/l。愈伤组织可2周扩增1倍；
4)不定芽的分化培养：将增殖后的愈伤组织转接于分化培养基上，于25℃、光照强度为2500lux条件下进行培养，促使愈伤组织分化为不定芽。所述分化培养基是以1/4ms为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l。4周分化率为88.2％；
5)生根培养：将芽高大于1.5cm的不定芽切下，转入生根培养基，于25℃、光照强度为2500lux条件下进行培养，诱导不定芽生根。所述分化培养基是以1/2ms培养基为基本培养基，ph＝6.4，并添加蔗糖30g/l、naa0.25mg/l+iba0.25mg/l时，30天生根率为71.8％。
6)炼苗和移栽：当种苗扩繁到一定数量后，选取2.5cm以上的小植株进行炼苗移栽，60天后小植株成活率可达到90％以上。
本发明的优点在于：提供了一套完整的黑松无菌快速繁殖技术，从针叶诱导出活力强的愈伤组织、在短时间内可将愈伤组织大量增殖(两周倍增)，再由愈伤组织分化成绿苗，经炼苗和移栽后成为种苗。从愈伤组织诱导至成苗仅需4个月，由于愈伤组织可实现两周倍增，因此该技术大大加快了黑松育苗速度。本发明为黑松优良个体的保种和扩繁提供了一条新的可行方法，可为黑松进一步人工规模化繁殖和栽培黑松提供优质种苗。
具体实施方式
一种黑松的无菌快速繁殖方法，通过以下步骤来进行：
1、外植体的选取
于春季采集树龄在7年以下的黑松顶端幼嫩松枝，将其上的松针拔下，流水冲洗后在超净工作台内进行消毒处理，75％酒精消毒30秒，无菌水洗涤2-3次，再用20％过氧化氢消毒17-18分钟，期间不时进行摇晃，无菌水洗涤2-3次，得到无菌的松针；
2、愈伤组织的诱导培养
在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段，接种于诱导培养基中，于25℃、黑暗条件下进行培养。采用两因素设计法对诱导培养基进行激素用量的筛选：以ms培养基为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l和不同浓度配比的激素组合，其中，生长素选用naa，其浓度为0mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l，细胞分裂素选用6-ba，其浓度为0mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l，两种激素浓度两两组合，共16个处理，每个处理接种30个松针片断，重复3次，筛选确定影响黑松愈伤组织诱导率和愈伤组织质量的激素最佳浓度配比。3周后统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的接种松针数/未污染的接种松针数×100％；
表1不同激素组合条件下愈伤组织的诱导率(％)
***：表示愈伤组织颜色活力最强，**：表示愈伤组织颜色活力强，**：表示愈伤组织颜色活力弱
培养15d后针叶基部开始产生愈伤组织，3周后，不同激素组合愈伤组织诱导率如表1所示。虽然黑松基部切段诱导率在6-ba2mg/l+naa0.1mg/l时最高，为60.7％，但愈伤组织易于褐化，而6-ba2mg/l+naa0.05mg/l激素组合诱导出的愈伤组织颜色鲜绿，松散，活力最强，且愈伤组织诱导率也较高(47.2％)，因此采用该愈伤组织作为增殖对象；
3、愈伤组织的增殖
将活力最佳的愈伤组织转接于增殖培养基上，于25℃、光照强度为1500lux条件下进行培养，使愈伤组织活力增强并大量增殖。采用单因素设计法对增殖培养基进行以下三方面的筛选：基本培养基、水解酪蛋白浓度和激素浓度。每个处理接种5瓶，每瓶接愈伤组织1g左右，以确定最佳增殖培养基配方。接种3周后测愈伤组织生长量并记录其颜色状态，统计其增殖率，增殖率＝(21天时愈伤组织的质量-初始接种质量)/初始接种质量×100％；
3.1基本培养基筛选
选用四种基本培养基：ms、1/2ms、gd、b5培养基无机元素+1/2ms培养基有机物，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、naa0.05mg/l+6-ba2mg/l。21天后增殖率最大者为1/2ms(94.5％)，因此，以下增殖实验均采用1/2ms为基本培养基；
3.2水解酪蛋白筛选
以1/2ms为基本培养基，选用水解酪蛋白四个梯度：0mg/l、100mg/l、500mg/l、1000mg/l，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、naa0.05mg/l+6-ba2mg/l；21天后增殖率最大者为1000mg/l者(113.7％)，因此，以下增殖实验均添加水解酪蛋白1000mg/l；
3.3激素筛选
以1/2ms为基本培养基，选用激素五个组合梯度：naa0.05mg/l+psk0.001mg/l、naa0.05mg/l+psk0.002mg/l、naa0.05mg/l+psk0.003mg/l、naa0.05mg/l+psk0.004mg/l和naa0.05mg/l+psk0.005mg/l，ph＝6.4，并以naa0.05mg/l+6-ba2mg/l为对照，培养基中还添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l。21天后增殖率最大者为naa0.05mg/l+psk0.001mg/l者(153.4％)，且结果与其它组具有显著性差异；
因此，最佳增殖培养基配方为：以1/2ms为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l、naa0.05mg/l+psk0.001mg/l，此时愈伤组织2周增殖1倍；
4、不定芽的分化培养
将增殖后的愈伤组织挑取颜色鲜绿、生长旺盛者，转接于分化培养基上，于25℃、光照强度为2500lux条件下进行培养，促使愈伤组织分化为不定芽。分别采用单因素设计法和两因素设计法对增殖培养基进行以下两方面的筛选：基本培养基和激素浓度。每个处理接10瓶，每瓶中接黄豆粒大的愈伤组织5块，4周后统计不定芽分化率，不定芽分化率＝分化的不定芽数/接种的愈伤组织块数×100％；
4.1激素的筛选
以1/2ms培养基为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、水解酪蛋白500mg/l、琼脂6.5g/l，选用激素naa(0mg/l和0.01mg/l)和psk(0.001mg/l、0.002mg/l、0.005mg/l)，两种激素浓度两两组合，共形成6个处理。4周后不定芽分化率最高者为naa0.01mg/l+psk0.002mg/l，分化率为68.3％；
4.2基本培养基筛选
选用四种基本培养基：ms、1/2ms、gd、1/4ms，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l。4周后分化率最大者为1/4ms(88.2％)，因此，最佳分化培养基配方为：以1/4ms为基本培养基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、琼脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l；
5、生根培养
将芽高大于1.5cm的不定芽从基部切下，转入生根培养基，于25℃、光照强度为2500lux条件下进行培养，诱导不定芽生根。所述分化培养基是以1/2ms培养基为基本培养基，ph＝6.4，并添加蔗糖30g/l、激素设九个梯度：naa0.5mg/l、naa1.0mg/l、naa2.0mg/l、iba0.5mg/l、iba1.0mg/l、iba2.0mg/l、naa0.25mg/l+iba0.25mg/l、naa0.5mg/l+iba0.5mg/l、naa1.0mg/l+iba1.0mg/l，30天后统计生根率，生根率＝生根的不定芽数/转接的不定芽数×100％；统计结果显示，培养基中激素为naa0.25mg/l+iba0.25mg/l时，生根率最高，为71.8％。
6、炼苗和移栽
将生根的小绿苗继续培养20天，当根长至1.5cm以上时，进行炼苗移栽。先将培养瓶打开，在培养室适应2天后转移到温室中炼苗，轻轻地将小苗取出，用清水洗掉残留培养基，移栽至穴盘中，穴盘内装有育苗基质，其配方为：1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土，基质用0.3-0.5％kmno4消毒。期间要保持温室内湿度70％、光照为自然光的70％，温度为25±2℃，20天后进行常规管理，60天后成活率为大于90％。