一种适于多种类型植物快速繁殖的方法与流程

本发明属于植物组培技术领域，涉及一种适于多种类型植物快繁的核心技术。

背景技术：

金银花(lonicerajaponicathund.)又名忍冬、双花、银花、二宝花，是忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物，为临床常用中草药，为我国特有的名贵中药材。金银花有清热解毒、消炎退肿、延缓衰老的功效，能有效预防“sars”、禽流感和甲型h1n1流感等病毒，还具有抗癌、抗艾滋病的作用。另外，金银花还含有多种抗氧化活性成分，可降血脂，用于预防治疗心脑血管疾病。随着绿色革命的发展，人类逐渐回归自然，天然药物因具有作用平稳、毒副作用小等特点，越来越多受到现代人的关注和重视，其用途也拓展到饮食、保健、化妆品、绿色农药等人类生活的各个方面，以金银花为原料，采用高科技技术研制各种保健饮料与食品，对于防治常见病、多发病，保障人们身体健康，将发挥出积极作用，具有巨大的市场空间，发展前景广阔。生产上繁殖金银花以扦插繁殖为主，但生根比较慢且生根率不高，其繁殖系数和繁殖速度都有限，难以满足市场上对金银花优良品种数和量的需求，不利于其推广种植。

鱼腥草(herbahouttuyniae)又名折耳根，属双子叶植物三白草科蕺菜属，因其根、茎、叶有鱼腥味，故名鱼腥草。茎叶、肥嫩的根茎可食用，其味道鲜美，具有清热解毒、利尿消肿、化食顺气、镇痛、止咳、驱风健胃等功效。同时，鱼腥草又能预防流感、肺炎、湿疹等多种疾病，是药食兼用的保健蔬菜。已经被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的资源之一。传统生产中，鱼腥草一般采用分株，插枝和根茎繁殖的育苗方式，但是长年进行无性繁殖易造成鱼腥草种茎的退化，主要是因为繁殖过程中会产生较多的病虫害，目前鱼腥草发生的白絹病、轮斑病还没有很好的防治病害产生的措施或药物，是鱼腥草的产业化生产的瓶颈。

鸭儿芹(umbelliferae)又名三叶、野蜀葵，伞型花科。中医学认为，鸭儿芹全株可入药，对身体虚弱，尿闭及肿毒等症有疗效。近年来，鸭儿芹已经作为主要蔬菜走上人们的餐桌上。随着人们生活水平的提高，对生活质量的追求越来越大，像鸭儿芹一类的美味、营养的野菜，其市场需求也越来越大发展前景十分广阔。鸭儿芹主要依靠种子繁殖，但其步骤繁琐、出苗周期较长、繁殖率低、且繁殖成本高，无法在短时间内提供大量优质种苗用于生产。

四数九里香(murrayatetramera)为芸香科九里香属植物，落叶小乔木，叶有浓郁香气。以根、叶入药，辛、微苦、性微温，可鲜用或阴干备用，具祛风解表、行气止痛、活血散淤、抗炎、镇痛、解热之功效，用于治疗感冒发热、支气管炎、哮喘、胃痛、风湿痹痛、跌打淤肿、皮肤搔痒、毒蛇咬伤、湿疹、疟疾等症。近年来其栖息环境遭人为或自然的破坏，导致资源萎缩、物种濒危，甚至呈灭绝趋势。

基于上述原因，有必要开展金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香组织培养的系统研究。组织培养方法不仅繁殖速度快、繁殖系数高，还可很好地保持母株的优良品质；而且对特有珍稀药用植物进行组培快繁，不仅可达到良种保存的目的，且可确保药源的供应量，对促进其产业的快速发展及遗传改良等方面的深入研究具有非常重大的意义。

组培快繁是近些年来在种苗繁殖过程中应用得最为广泛的一门新兴实用技术。目前，世界上已有几千种植物通过组织培养获得成功。每个组培研究中心，研究对象都不会是单一品种，一般是两种或两种以上的主研产品，但每种植物的适宜外植体、组培繁殖方法都不相同，需花费大量的时间和精力去探索每种植物的高效稳定的组培繁殖方法，这样大大增加了投入的人力和物力，直接影响工厂化生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术不足，提供一种适于多种类型植物包括：金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香等的组织培养的快速繁殖方法，以达到室内大规模繁殖种苗，为规模化发展及时提供多种植物大批量优质种苗。本发明的目的可以通过以下技术实现：

一种适于多种类型植物快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：选择金银花，鱼腥草，鸭儿芹、四数九里香的组织为外植体，消毒后进行培养；

(2)初代培养：将步骤(1)消毒后的茎段、根状茎、顶芽或种子接种在er+6-ba0.6～2.5mg/l+kt0.2～1.5mg/l，以及添加有蔗糖和琼脂的固体培养基上培养20～30天，诱导出芽；出苗率达92％以上，大部分外植体分化芽，仅四数九里香少量种子未发新芽；尤其是鱼腥草培养10d左右，萌发新芽，30d左右逐步分化出丛生芽；

(3)增殖继代：将步骤(2)获得的无菌苗或茎段接种在er+kt0.01～3.0mg/l+多效唑0.2～3.0mg/l，以及添加有蔗糖和琼脂的固体培养基中培养,培养30天后，100％同步获得芽和根。

(4)移栽管理：将步骤(3)获得的健壮生根苗，打开瓶盖炼苗至少3d，取出清洗根部培养基，随后将幼苗直接移栽至大田，成活达到90％以上。

上述方法中步骤(1)选择金银花茎段，鱼腥草根状茎，鸭儿芹顶芽、四数九里香种子为外植体。

上述方法中步骤(1)切取金银花一年生枝条的茎段为外植体进行培养，茎段切成1.0～2.0cm备用；鱼腥草根状茎先清洗干净后，放置清水中培养10d左右，再将根状茎切成1.0～2.0cm后备用；鸭儿芹选择较小植株，去掉根、叶柄和叶，保留基部2cm左右高，剥取外围几层苞片后备用；剥取四数九里香种子的外皮备用；将准备好的外植体用75％酒精浸泡30～60s，再用0.1％升汞消毒12～15min，然后用无菌水清洗5～6次后备用；

上述方法中步骤(2)将消毒后的金银花茎段和鱼腥草根状茎直接接种到初代培养基(er+6-ba0.6～2.5mg/l+kt0.2～1.5mg/l)上；将消毒后的鸭儿芹的外植体再剥取外层苞片，取出顶芽接种到初代培养基(同上)上；将消毒后的四数九里香种子切成两半接种到初代培养基(同上)上。每瓶培养基接种3～7个外植体进行培养。

上述方法中步骤(3)将步骤(2)获得的无菌苗基部或茎段接种在er+kt0.01～3.0mg/l+多效唑0.2～3.0mg/l。每瓶培养基接种5～20个外植体进行培养。

上述方法中初代培养和增殖继代培养条件：接种后移到培养室培养，培养室温度为24～26℃，培养室相对湿度为30～50％，每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx。初代培养和增殖继代培养所用的培养基中添加3～5％蔗糖和0.75％琼脂。

本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的方法不仅适用于草本植物鱼腥草和鸭儿芹，以及藤本植物金银花进行快速繁殖，还适用于小乔木植物四数九里香进行快速繁殖。

2、本发明的方法选择不同植物不同外植体，相同组培繁殖方法，4种植物都能获得高效稳定的培养体系，这样大大减少了投入的人力和物力，直接降低工厂化生产成本。

4、选择er为基本培养基，适用于草本、藤本和乔木植物的植株再生；利用本发明进行多种植物不同外植体，均诱导出新芽，诱导率达92％以上。

6、外植体继代培养基上能同步产生芽和根，尤其是金银花和鱼腥草，同步形成丛生芽；本发明将增殖与生根培养程序简化为一步完成。

附图说明

图1为金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香继代培养无菌苗和茎段同步诱导芽或丛生芽和根的芽生长情况；

图2为金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香继代培养无菌苗和茎段同步诱导芽或丛生芽和根的根生长情况。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、组织培养快速繁殖金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香

一、培养基配制和灭菌

初代培养基：er+6-ba1.2mg/l+kt0.5mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。

增殖培养基：er+kt2.0mg/l+多效唑1.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

二、初代培养

上述方法中步骤(1)选用金银花一年生枝条的茎段为外植体进行培养，茎段切成1.0～2.0cm备用；鱼腥草根状茎先清洗干净后，放置清水中培养10d左右，再将根状茎切成1.0～2.0cm后备用；鸭儿芹选择较小植株，去掉根、叶柄和叶，保留基部2cm左右高，剥取外围几层苞片后备用；剥取四数九里香种子的外皮备用；将准备好的外植体用75％酒精浸泡30～60s，再用0.1％升汞消毒12～15min，然后用无菌水清洗5～6次后备用；然后将消毒后的金银花茎段和鱼腥草根状茎直接接种到初代培养基上；将消毒后的鸭儿芹的外植体再剥取外层苞片，取出顶芽接种到初代培养基上；将消毒后的四数九里香种子切成两半接种到初代培养基上。每瓶培养基接种3～7个外植体进行培养；培养室温度为24～26℃，培养室相对湿度为30～50％，每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx。培养20～30天，出苗率达92％以上，大部分外植体分化芽，仅四数九里香少量种子未发新芽；尤其是鱼腥草培养10d左右，萌发新芽，30d左右逐步分化出丛生芽；一共获得127个株系。

三、继代培养

取上述127个株系进行继代繁殖，具体方法如下：将步骤二金银花、鱼腥草、四数九里香获得的无菌苗带芽茎段切成1.0～2.0cm，转入增殖培养基上，培养30天左右，100％同步获得芽和根；将步骤二鸭儿芹获得的无菌苗去掉根、叶柄和叶，保留基部2cm左右高，转入增殖培养基上，培养30天左右，100％同步获得芽和根；每隔25～30d继代一次，每瓶培养基接种5～20个外植体进行培养。同步诱导芽或丛生芽和根生长情况如图1-2所示；培养条件同步骤二。

四、移栽管理

选择金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香3-6cm高的生根苗，打开瓶盖炼苗3d，取出清洗根部培养基，随后将幼苗直接移栽至大田，成活达到90％以上。

本发明所提供的金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香组织培养繁殖方法，根据不同植物的特性，选择茎段、根状茎、顶芽和种子为外植体，取材容易，数量大，遗传稳定性高。在初代培养过程中，不同植株不同外植体在相同培养基上均诱导出新芽。继代培养阶段，采用芽或丛生芽和根的方法，创造出一步成苗的方法，不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，提高了生产效率。

实施例2、组织培养快速繁殖金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香

一、培养基配制和灭菌

初代培养基：er+6-ba1.5mg/l+kt0.5mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。

增殖培养基：er+kt2.5mg/l+多效唑1.5mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

取组织培养快速繁殖金银花、鱼腥草、鸭儿芹、四数九里香的不同外植体，基本操作方法同实施例1一致；效果与实施例1相差不大，只是四数九里香茎基部分化较多的褐色物质，但不影响其生长。