专利名称：一种刺参球形病毒的分离方法
技术领域：
本发明属于病毒分离纯化领域，具体涉及一种刺参球形病毒的分离方法。
背景技术：
近年来，刺参消费需求迅速扩大，我国北方大力发展刺参养殖业，养殖面积达百万 亩，年产值超过100亿元，成为沿海地区重要的经济养殖品种。然而，养殖的过速发展和不 规范操作、养殖技术水平的参差不齐等导致了病害问题的日趋突出。自2003年起，养殖刺 参频发溃疡病，症状为体壁肌肉溃疡、围口部肿胀，刺参自溶死亡等流行病，造成了惨重的 经济损失，严重制约了该产业的持续发展。随着刺参疾病的频繁发生，国内外研究者开始关 注刺参养殖过程中导致皮肤溃烂、肿嘴流行病的病原问题。研究表明病毒SUPTSV可引起刺 参皮肤溃烂、围口部肿胀等流行性病害的发生。病毒的分离提取是病原鉴定、早期诊断技术 和疾病预防的基础，一般情况下分离病毒最常用、最好的方法是用细胞扩增繁殖，但至今未 有成熟的软体动物细胞系。
发明内容
本发明的目的是提供一种刺参球形病毒的分离方法，以快速简便的分离刺参球形 病毒，以克服现有技术的不足。本发明利用差速和密度梯度离心相结合的方法，并考虑到尽量减小污染和保证无 菌操作条件来分离刺参球形病毒，具体步骤如下1)刺参球形病毒粗提液的制备首先将携带有刺参球形病毒的组织用无菌生理盐水洗净后，在低温下将组织剪 碎、用组织研磨器研磨，再将研磨物用含抗生素的灭菌过滤海水冲洗，将冲洗液收集到灭 菌离心管中，600 800g、4°C离心30min后，弃沉淀，取上清液在4°C、1500 1800g离心 30min,弃沉淀取上清液后，在4°C、8500 9500g离心30min，弃沉淀取上清液，并将上清液 悬浮于过滤灭菌海水配制的g/ml为25%的蔗糖垫中，4°C、15000 16000rpm离心60min 弃上清液，将沉淀悬浮于过滤灭菌的海水中制得刺参球形病毒粗提液。2)高纯度的刺参球形病毒溶液制备将g/ml为10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液各取1. 35ml，用无菌注射器按 g/ml为50 %、40 %、30 %、20 %、10 %的顺序依次将各蔗糖溶液由下到上铺在IOcm的超速离 心管中，并静置重层，将刺参球形病毒粗提液900 1000 μ L经磁力搅拌器低温搅拌30分 钟后，注入离心管的重层的蔗糖溶液上方，4°C、24000 26000rpm离心120min，收集从离心 管由上到下数为第二层、第三层的条带，将收集的条带在15000 16000rpm4°C离心45min， 弃上清液，缓冲液溶解刺参球形病毒沉淀，即得到高纯度的刺参球形病毒溶液。步骤1)中的含抗生素的灭菌过滤海水，其特征是灭菌过滤海水中含有终浓度为 100IU/ml的青霉素及100 μ g/ml的链霉素。上述的缓冲液为TNE液或PBS液。
本发明建立了从患病刺参组织中利用差速和密度梯度离心分离提取刺参球形病 毒的方法。本发明的方法过程简单、成本低，可大量获得刺参球形病毒SUPTSV材料，能够满 足刺参疾病的早期诊断、预防和治疗的病毒材料的需求。
具体实施方式
实施例11)刺参球形病毒粗提液的制备患病毒病成参表面状况初期触手活力下降、围口部肿胀，后期口部腐烂、同时伴 随背部棘刺溃烂，尤其是至少四个以上棘刺同时出现溃烂，且棘刺基端(即靠近皮肤的部 位)表皮无损伤症状。2009年2月选取山东省海阳市某刺参养殖场触手活力下降、围口部肿胀、皮肤溃 烂的刺参肠组织20克，用无菌生理盐水多次洗净，在冰水浴上用灭菌剪刀将组织剪碎，并 在低温下用组织研磨器研碎，用含100IU/ml的青霉素及ΙΟΟμ g/ml的链霉素的灭菌过滤的 海水冲洗，将冲洗液收集到50ml的灭菌离心管中，600g、4°C离心30min后，弃沉淀，取上清 液在4°C、1500g离心30min，弃沉淀取上清后，在4°C、8500g离心30min，弃沉淀取上清，并 悬浮于过滤灭菌海水配制的g/ml为25%的蔗糖垫中，4°C、15000rpm离心60min弃上清， 留沉淀，沉淀悬浮于过滤灭菌的海水中，即制得病毒粗提液.病毒粗提液的另一部分存放 于-70°C保存备用。2)高纯度的刺参球形病毒溶液制备将配制好的g/ml为10 %、20 %、30 %、40 %、50 %的蔗糖溶液各取1. 35ml，用2. 5cm 的无菌注射器小心地按g/ml为50%、40%、30%、20%、10%的顺序由下到上铺在IOcm的 超速离心专用离心管中，并静置重层，将上述差速离心得到的980 μ L病毒粗提液经磁力搅 拌器低温搅拌30分钟后，小心的注入离心管的重层的蔗糖溶液上方，4°C、24000rpm离心 120min，收集从离心管由上到下数为第二层、第三层的乳黄色条带，15000rpm 4°C超速离心 45min，弃上清，用TNE溶解沉淀，即得到高纯度的刺参球形病毒溶液。实施例21)刺参球形病毒粗提液的制备2009年2月选取山东省海阳市某刺参养殖场触手活力下降、围口部肿胀、皮肤溃 烂的刺参触手组织20克，用无菌生理盐水多次洗净，在冰水浴上用灭菌剪刀将组织剪碎， 并在低温下用组织研磨器研碎，用含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的链霉素的灭菌过滤 的海水冲洗，将冲洗液收集到50ml的灭菌离心管中，800g、4°C离心30min后，弃沉淀，取上 清液在4°C、1800g离心30min，弃沉淀取上清后，在4°C、9500g离心30min，弃沉淀取上清， 并悬浮于过滤灭菌海水配制的g/ml为25%的蔗糖垫中，4°C、16000rpm离心60min弃上清， 留沉淀，沉淀悬浮于过滤灭菌的海水中，即制得病毒粗提液.病毒粗提液的另一部分存放 于-70°C保存备用。2)高纯度的刺参球形病毒溶液制备将配制好的g/ml为10 %、20 %、30 %、40 %、50 %的蔗糖溶液各取1. 35ml，用2. 5cm 的无菌注射器小心地按g/ml为50%、40%、30%、20%、10%的顺序由下到上铺在IOcm的 超速离心专用离心管中，并静置重层，将上述差速离心得到的1000 μ L病毒粗提液经磁力搅拌器低温搅拌30分钟后，小心的注入离心管的重层的蔗糖溶液上方，4°C、26000rpm离心 120min，收集从离心管由上到下数为第二层、第三层的乳黄色条带，16000rpm4°C超速离心 45min，弃上清，用PBS溶解沉淀，即得到高纯度的刺参球形病毒溶液。制备的高纯 度的刺参球形病毒检测吸取20μ L高纯度的刺参球形病毒溶液，用于电镜负染观察，将病毒粗提液滴一 小滴于腊盘上，取铜网使有支持膜的表面与病毒粗提液表面接触，静置3 Smin取出，取出 铜网，用滤纸条吸除多余的液滴，稍晾干。取3%磷钨酸溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有病 毒粗提液样品的铜网放置于染液表面使样品与染液接触，静置3 Smin。取出铜网，用滤纸 条吸除多余的液滴，白炽灯下晾干。电镜观察有100-250nm的病毒粒子的存在。
权利要求
种刺参球形病毒的分离方法，其特征在于，包括如下步骤1)刺参球形病毒粗提液的制备首先将携带有刺参球形病毒的组织用无菌生理盐水洗净后，在低温下将组织剪碎、用组织研磨器研磨，再将研磨物用含抗生素的灭菌过滤海水冲洗，将冲洗液收集到灭菌离心管中，在600～800g、4℃离心30min后，弃沉淀，取上清液在4℃、1500～1800g离心30min，弃沉淀取上清液后，在4℃、8500～9500g离心30min，取上清液，并将上清液悬浮于过滤灭菌海水配制的g/ml为25％的蔗糖垫中，4℃、15000～16000rpm离心60min，弃上清液，将沉淀悬浮于过滤灭菌的海水中制得刺参球形病毒粗提液；2)高纯度的刺参球形病毒溶液制备将g/ml为10％、20％、30％、40％、50％的蔗糖溶液各取1.35ml，用无菌注射器按g/ml为50％、40％、30％、20％、10％的顺序依次将各蔗糖溶液由下到上铺在10cm的超速离心管中，并静置重层；将刺参球形病毒粗提液900～1000μL经磁力搅拌器低温搅拌30分钟后，注入离心管的重层的蔗糖溶液上方，在4℃、24000～26000rpm离心120min，收集从离心管由上到下数为第二层、第三层的条带，将收集的条带在15000～16000rpm 4℃离心45min，弃上清液，将刺参球形病毒沉淀用缓冲液溶解，即得到高纯度的刺参球形病毒溶液。
2.如权利要求1所述的刺参球形病毒的分离方法，其特征在于上述的含抗生素的灭菌 过滤海水是灭菌过滤海水中含有终浓度为100IU/ml的青霉素及100 μ g/ml的链霉素。
3.如权利要求1所述的刺参球形病毒的分离方法，其特征在于上述的缓冲液为TNE液 或PBS液。
全文摘要
本发明涉及一种刺参球形病毒的分离方法。其特征在于包括刺参球形病毒粗提液的制备和高纯度的刺参球形病毒溶液制备两个步骤刺参球形病毒粗提液的制备步骤是将携带刺参球形病毒的组织低温下研磨，用含抗生素的灭菌过滤海水冲洗后差速离心制得粗提液；高纯度的刺参球形病毒溶液制备步骤是将制得的粗提液用密度梯度离心方法分离得到病毒沉淀，将沉淀用TNE或PBS缓冲液溶解后制得高纯度的刺参球形病毒溶液。本发明的方法将差速和密度梯度离心结合了起来，并尽量减小污染和无菌操作。本发明的特点是过程简单、成本低，可大量获得刺参球形病毒材料，以满足刺参疾病的早期诊断、预防和治疗的病毒材料的需求。
文档编号C12N7/00GK101948813SQ20101027396
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月4日 优先权日2010年9月4日
发明者刘洪展, 孙修勤, 张进兴, 李继业, 郑风荣 申请人:国家海洋局第一海洋研究所