专利名称：含有分离的多角体病毒的生物防治剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以前未分离的和未鉴定的昆虫致病病毒毒株、含有该毒株的生物防治剂以及其复制和在虫害防治中的用途。
背景技术：
核型多角体病毒是杆状病毒科(Baculoviridae)昆虫特异性DNA病毒，其中有被膜的杆状病毒粒子咬合于已知为多角体的蛋白基质内，所述病毒粒子包含50～100M道尔顿的环状双链DNA基因组。按照每被膜内的病毒粒子数，NPVS可以分为单个包埋(Singly-embedded)或多个包埋(multiply embedded)(MNPV)的。由于这些病毒对农作物及森林的主要鳞翅害虫具有致病性，因此被广泛研究作为生物害虫防治剂。虽然用于此目的的防治剂已有销售，但这类产品的广泛使用受到其持久性差、杀灭速率缓慢及单位施用面积的成本高的局限。
发明概述本发明描述了一种新的单个包埋的谷实夜蛾(Heliothis Zea)核型多角体病毒毒株，它保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号为V93071301。高致病力是其特征，这比现有毒株更有优势。因此本发明的一个方面提供了一种分离的核型多角体病毒，它具有保藏于欧洲动物细胞培养保藏中心、保藏号为V93071301的样品的特征。
例如当将该病毒配制成农用喷雾剂时，它可用于防治害虫，如夜蛾(Heliothis)和Helicoverpa属的种。因此，本发明的另一方面是提供一种含有本发明病毒的生物防治剂和一种对抗栖息地处虫害的方法，该方法包括用本发明的生物防治剂治理昆虫或栖息地。
本发明还提供一种体外复制本发明病毒的方法，包括用该病毒感染在培养基中培养的昆虫细胞，并将该细胞培养一段时间直至在细胞核内检测到多角包含体，再从细胞和/或培养基中收获病毒。
发明详述分离该病毒最早在Pikeville，North Carolina，U.S.A发现的三只死Helicoverpazea幼虫上繁殖。通过将虫尸转移到盛有新制昆虫食物的塑料杯内，在食物表面碾碎虫尸并引入可喂食该污染食物的烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)或Helicoverpa zea的幼虫来繁殖该病毒。感染通常在20～25℃进行。繁殖以两周至一年间变化间隔进行。虫尸储存于室温的塑料食物杯中。
纯化如上述在烟蚜夜蛾中繁殖该病毒。症状与病毒感染的那些一致。感染的幼虫变得松软、发黑，并倾向于破裂和液化。通常用包含病虫组织的无菌塑料环在食物表面划线，进一步转移到食物中来产生接种病原体。将虫尸储存于-20℃。以这种方式得到50只感染的幼虫。
收集虫尸，在无菌蒸馏水中研碎并经两层平纹细布(muslin)滤过。滤液在1000rpm下进行重复离心5分钟除去昆虫碎片。然后上清液在4100rpm离心20分钟，洗后沉淀仍然保留。该沉淀重新悬浮于水并在显微镜下检测。观察到典型的核型多角体病毒(NPV)颗粒。每只幼虫得到的约5×107个多角包含体(IB)。
将该病毒样品保藏于PHLS，Salisbury，Wilts SP4 OJG，U.K.的欧洲动物细胞培养保藏中心，保藏号为V93071301。
生物鉴定为进行比较，将该病毒与棉铃虫(Heliothis armigera)核型多角体病毒的特征毒株，HaSNP A44EB一起进行生物鉴定，该毒株从前已显示出能感染烟蚜夜蛾，Helicoverpa zea，Helicoverpa armigera和Helicoverpa punctigera。该毒株由RobertTeakle博士在1974年。澳大利亚昆士兰的棉花上收集的感染的Helicoverpaarmigera的分离体克隆。
将直径约1mm的斑豆昆虫食物料块放入微量滴定皿的孔中。然后将1ul水中的各种浓度的多角体加在每个料块表面。将吃光食物料块的所有幼虫转移到盛有食物的塑料盆中。7天后检查这些昆虫。
下表I列出了结果。
证据表明至少是对烟蚜夜蛾和H.zea，HzNPV V93071301的致病性比HaSNPVA44EB至少强一个数量级。
虽然未将HzNPV V93071301与商品标准品进行直接比较，但一个相似的试验表明对烟蚜夜蛾HaSNPV A44EB比称作“Elcar”的HzSNPV商品毒株具有稍强的致病性，正如下表2列出的那样。“Elcar”是注册商标。
表IHzSNPV V93071301和HaSNPV A44EB的比较性生物鉴定数据
表IIHaSNPV A44EB和HzSNPV“Elcar”毒株对HeliothisVirescens的比较性生物鉴定数据
细胞培养通过从感染昆虫提取血淋巴到Helicoverpa zea的静态培养物中来建立HzNPV V93071301的细胞培养。该病毒成功地感染细菌，在核内形成多角体并且可在细胞培养物中被繁殖。当暴露于非闭合形式的HzNPV V93071301时，在汇合的H.zea细胞层上形成空斑。
鉴定在感染的昆虫在1％十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中研磨。调校多角体悬浮液至每份样品约5×109PIB，过滤、离心并如前面所述进行洗涤，除去SDS。而后将多角体溶于pH10的Na2CO3缓冲溶液中。悬浮液于5000rpm离心5分钟以除去碎片，上清液于14000rpm离心45分钟。将病毒粒子重悬浮于pH8的200ul TE(10mM的Tris HCl，1mM的EDTA)。蛋白通过加到病毒制品的200ul提取缓冲液(0.2％w/v KCl，0.2％肌氨酸(scarcosyl)的TE)，再加入终浓度为0.1mg/ml蛋白激酶K进行消化。该消化液在65℃和温和搅拌下孵育3～4小时，与400ul苯酚/氯仿/异戊醇(50∶48∶2)混合并于13000rpm下离心5分钟。该提取进行两次。透析约12小时除去过量盐、洗涤剂、苯酚和氯仿。然后分别用核酸限制性内切酶EcoRI、EcoRV、HindIII和BamHI消化DNA制品5～6小时。通过琼脂糖凝胶电泳(0.7～0.8％琼脂糖)分析DNA制品。
HzNPV V93071301、HaSNPV A44EB和HaSNPV“Elcar”样品同时进行电泳。观察到的每种病毒的总谱带数，以及观察到的两对病毒间的相同谱带数列于表3。
表III根据琼脂糖凝胶电泳鉴定病毒毒株
由于这些病毒间有充分的同源性，将HzNPV V93071301划分为单个包埋的谷实夜蛾核型多角体病毒(HzSNPV)是显然的，根据DNA图谱，毒株V93071301与其它任一试验毒株显著不同。
本发明毒株新颖性的其它证据可从
图1看出，
图1显示了本发明病毒的多角体切片的电子显微照片。为获得该电子显微照片，于4℃将样品固定于含3％戊二醛的0.05M磷酸缓冲液中，用含1％锇酸的0.05M磷酸缓冲液后固定放在琼脂糖凝胶上，脱水并渗透。然后将该样品固定于Spurr’s树脂。超薄切片用含0.2％柠檬酸铅的0.1N氢氧化钠染色5分钟。用Philips PW 6002透射电子显微镜检测切片。
制剂及用途本发明的新病毒毒株适于用生物防治剂，以防治虫害，特别是农作物，例如棉花、蔬菜、水果、大豆、谷类等的幼鳞蝶虫。其中用病毒对抗和防治的害虫是夜蛾属和Helicoverpa属，如H.zea，烟蚜夜蛾，棉铃虫，H.Puncitigera等。
该病毒以组合物形式应用于害虫或害虫栖息地(如生长的作物)，组合物中病毒与适宜的固体或液体稀释剂或载体混合，可以存在或不存在其它组份如表面活性剂、润湿剂、分散剂，以及旨在保护病毒存活的组份如紫外吸收剂和抗氧化剂等。优选的制剂包括可润湿粉、油悬浮液和病毒的微胶囊悬浮液(如其中囊衣通过coascervation技术或原位交联形成聚脲或聚酰胺壳得到)。D.J Rhodes在D GJones编辑的1993年出版(Chapmant & Hall，London)的“Exploitation ofMicroorganisms”第411～439页的“Formulation of Biological Control Agents”更全面地公开了作为生物防治剂制剂的核型多角体病毒配制技术，该文献引入本文供参考。
权利要求
1.一种分离的核型多角体病毒毒株，它具有保藏于欧洲动物细胞培养保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，保藏号为V93071301的样品的特征。
2.一种生物防治剂，包含与固体或液体稀释剂或载体结合的权利要求1的病毒。
3.一种防治栖息地处虫害的方法，它包括用权利要求2的生物防治剂治理害虫或其栖息地。
4.根据权利要求3的方法，其中虫害是夜蛾(Heliothis)或Helicoverpa属昆虫。
5.根据权利要求4的方法，其中虫害是H.zea，烟蚜夜蛾(H.virescens)，棉铃虫(H.armigera)或H.punctigera。
6.一种体外复制权利要求1的病毒的方法，它包括用病毒感染培养基中培养的昆虫细胞，并培养细胞一段时间直至在细胞核内检测到多角包含体，再从细胞和/或培养基中收获该病毒。
全文摘要
一种分离的核型多角体病毒毒株，它具有保藏于欧洲动物细胞培养保藏养中心，保藏号为V93071301的样品的特征。
文档编号A01N63/00GK1141648SQ94194809
公开日1997年1月29日 申请日期1994年11月7日 优先权日1993年11月15日
发明者D·J·罗迪斯, P·J·居斯特, R·G·布伦克 申请人:曾尼卡有限公司