检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法
【专利摘要】本发明“检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法”，涉及动物医学诊断领域。所述基因芯片的特征在于：在芯片基质上设置有鸡淋巴白血病病毒ALV的四个亚群A、C、D和J亚群、鸡传染性贫血病毒CAV、禽网状内皮增生症病毒REV的特异性探针序列；本发明还提供了检测鸡淋巴白血病病毒ALV的四个亚群A、C、D和J亚群、鸡传染性贫血病毒CAV、禽网状内皮增生症病毒REV的试剂盒；本发明的芯片和试剂盒及提供的检测方法能针对多种病原进行高通量、快速、准确的检测，能在较短的时间内对感染性疾病做出正确诊断，防止传染性疾病传播。
【专利说明】检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物医学诊断，特别是涉及一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片、试剂盒及方法
【背景技术】
[0002]近年来，我国养禽业的发展非常迅速，已成为我国畜牧业的支柱产业之一。可是随着养禽业的快速发展，各种内在及外在因素也正严重地威胁着养禽业的健康发展，其中疫病已成为威胁养禽业的头号大敌。虽然通过使用疫苗接种及药物控制等手段，使禽类主要传染病的防制取得了一定的成效，但在各地鸡场的生产实践中免疫接种过的鸡群仍会不断发生各种疾病，其中不容忽视的原因之一就是禽类免疫抑制病。禽免疫抑制病是由单一或多种致病因素共同作用，导致鸡只免疫系统受损、免疫功能降低的疾病的总称。引起家禽免疫抑制的病毒有鸡传染性贫血病病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、马立克氏病病毒(MDV)等。其中禽淋巴白血病(AL)、鸡传染性贫血病(CIA)以及网状内皮增生症(RE)是目前对我国养鸡业危害最为严重的免疫抑制病，与其他鸡病相比，它们具备垂直传播、亚临床感染的特性，传统方法诊断困难。在2007年由农业部科技司和兽医局立项的农业公益性科技研究专款项目“鸡白血病学的流行病学调查和防控示范性研究”实施过程中，崔治中老师进行的血清学调查结果显示JiAB亚群和J亚群ALV感染呈阳性的鸡群分别占47.9%和52.8%，个体感染率分别为3.4%和
5.7%。而据他2008年统计数据显示:我国白羽肉种鸡CIAV抗体阳性率达90%，REV抗体阳性率12.3%，黄羽肉种鸡抗体阳性率90%，REV抗体阳性率36.8%。并且在200份病料样品中，ALV、CAV、REV单独或协同感染的检出率达10%_6.5%。这一结果表明，上述三种免疫抑制病在我国鸡群中相当普遍。由于ALV、CIAV、REV及其制备物在灭活的同时其免疫原性会遭到不同程度的破坏，培育无致病性的弱毒株亦未取得重要进展，因此至今针对上述三种免疫抑制病仍未研制出临床上 有实用价值的疫苗，尤其对于ALV和REV来说，由于先天性感染的雏鸡具有的免疫耐受性以及这种感染的普遍性，也使的疫苗的应用前景十分暗淡，一旦种鸡感染整个鸡群便会同时感染，使养禽业损失惨重。但就目前来看更好的防控手段是及时对鸡群中ALV、CIAV、REV检测并净化，切断其垂直传播的途径，以避免该病的扩散。因此，加强便捷、快速、敏感的检测手段的研究迫在眉睫。
[0003]现有ALV、CIAV以及REV的检测手段也存在着各种缺陷，不能满足高特异性、大批量的样品检测，而基因芯片技术在高通量和准确性等方面具有得天独厚的优势。与传统检测方法相比，它可以在I张芯片同时对多个样品进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性和亚型；极高的灵敏度和可靠性；自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点可使兽医工作者在短时间内掌握大量的疾病诊断信息。应用基因芯片不仅可以提高疾病诊断的效率，而且可以诊断出疾病的具体类型、发病阶段、严重程度和愈后指示。
[0004]因此本课题拟研究开发检测ALV、CAV、REV的基因芯片，能达到同步检测上述三种鸡免疫抑制病、并可同步区分ALV E亚群和J亚群的检测方法，为我国鸡免疫抑制病的净化与控制提供技术支撑；为大批量样品的检测和大面积的流行病学调查提供快速、平行、灵敏的检测手段。
【发明内容】
[0005]本发明针对上述领域的空白和需要，提供一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片、试剂盒及方法，能够同时检测ALV、CAV、REV这三种病毒并可以同时区分ALV的A、C、D和J亚群，为正确防治疫病提高效率、节约时间。
[0006]一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，其特征在于:在芯片基质上设置有鸡淋巴白血病病毒ALV的四个亚群A亚群、C亚群、D亚群和J亚群、鸡传染性贫血病毒CAV、禽网状内皮增生症病毒REV的特异性探针序列，所述特异性探针序列如下: [0007]鸡淋巴白血病病毒A 亚群(Al )，TTTTTTTGTCTCAGGGGGAGGCCACACGGTTTCTC ；
[0008]鸡淋巴白血病病毒A 亚群(A2)，TTTTGGTTGGTCTAGACAGGAGGCCACGCGGTTTC ；
[0009]鸡淋巴白血病病毒A 亚群(A3)，TTTTGGATGGACTAGACAGGAAGCCACACGGTTCC ；
[0010]鸡淋巴白血病病毒A 亚群(A4)，TTTTTGCTTTCAGATTGGTCCAGGCCGCAACTCAC ；
[0011]鸡淋巴白血病病毒C 亚群(Cl)，TTTTGGATGTGTATATTTCGCCCCAAGGGCCACTG ；
[0012]鸡淋巴白血病病毒D 亚群(Dl)，TTTTTTTTGGCCGGGAAGAGGTGACACACATCCTC ；
[0013]鸡淋巴白血病病毒C 亚群(J3 )，TTCTTAGTCTACAGTCAGCGACCTCGCCATTCCGC ；
[0014]鸡淋巴白血病病毒C 亚群(J4 )，CTTAGTCTACAGTCAGCTACCTCTCCCTTCCGCAC ；
[0015]鸡传染性贫血病病毒(CAV)，TTTTTTTTTGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG；
[0016]网状内皮增生症病毒(REV), TTTTTTTTTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACA。
[0017]一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片试剂盒，其特征在于包括如下组件:
[0018](I)上述基因芯片；
[0019](2)七条引物:
[0020]鸡淋巴白血病病毒ALV的A、C、D、J四个亚群通用上游引物J-U:
[0021]5， -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，；
[0022]J 亚群下游引物 J-L: 5 ’ -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
[0023]A、C 和 D 亚群通用下游引物 Tong: 5’ -CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
[0024]CAV 上游引物 C-U: 5 ’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，；
[0025]CAV 下游引物 C-L: 5 ’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
[0026]REV 上游引物 R-U: 5 ’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3，；
[0027]REV 下游引物 R-L: 5 ’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3 ’ ；
[0028]且J-L、Tong、C-L与R-L的5，端有Cy3荧光标记。
[0029]所述的基因芯片试剂盒，还包括除通用引物和DNA探针之外的PCR扩增所需试剂、杂交液、芯片洗液。
[0030]所述杂交液的成分为:3XSSC溶液，25%甲酰胺，0.2%SDS，5 XDenhardt溶液。
[0031]所述芯片洗液包括洗液A和洗液B ;洗液A的配方为2XSSC，0.2%SDS ;洗液B为0.2XSSC0
[0032]所述基因芯片试剂盒，还包括PCR阴性对照模板和阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水，所述阳性对照模板为CAV参考毒株CUX的质粒DNA。
[0033]上述任一所述的基因芯片试剂盒，所述七条引物混合存放在两个引物管中，；两个引物管中的引物及其混合浓度比例为:J-U: J-L: Tong=5:2:3 ； (C-U+C-L): (R-U+R-L) =1:3
[0034]一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片检测方法，包括如下步骤:
[0035](I)提取待测毒株的基因组DNA，
[0036](2)用如下引物对待测毒株的基因组DNA进行PCR扩增，
[0037]J-U:5，-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，；
[0038]J-L: 5，-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
[0039]Tong:5’-CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
[0040]C-U:5，-ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，；
[0041 ] C-L: 5，-AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
[0042]R-U:5’-CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’ ；
[0043]R-L:5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ；
[0044]所述J-L、Tong、C-L与R-L的5’端有Cy3荧光标记；
[0045]所述PCR扩增分为两组分别进行，
[0046]其中一组PCR扩增采用以下混合引物:其中引物浓度比J-U:J-L:Tong=5:2:3 ；
[0047]另一组PCR扩增采用以下混合引物:其引物浓度比为:C-U+C-L:R-U+R-L=1:3。
[0048](3)扩增产物与上述基因芯片杂交，
[0049](4)杂交后处理及扫描结果。
[0050]所述PCR扩增的体系为2 XPCR mix25 μ 1，模板DNA3 μ I，10 μ mol/L混合引物7~8 μ I,加无菌双蒸水至50 μ I ；
[0051]PCR 反应条件 95°C，5min ；95°C 50S，56°C 50S，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0
[0052]在步骤(2)前，先对所述基因芯片进行如下预处理:置于37°C湿盒内固定12h，用双蒸水清洗3次，在封闭液中封闭5分钟后离心甩干，4°C保存备用，所封闭液的配方为:0.75%PBS 溶液，25% 乙醇，0.2%NaBH4 ；
[0053]步骤(2)中以人工合成的ALV的A C D J亚群、REV的质粒DNA、CAV参考毒株CUX的质粒DNA做为阳性对照模板，以双蒸水做为阴性对照模板；
[0054]所述杂交指:向杂交盒内加入300 μ L双蒸水，将所述基因芯片放入杂交盒内；将PCR扩增产物与杂交液以体积比7:8混匀，95°C变性5min后马上冰浴5min，取15 μ I变性后的混合液转移至所述基因芯片反应区，基因芯片连同杂交盒置于42°C湿润条件下杂交过夜；
[0055]所述杂交后处理指:杂交后的基因芯片依次在洗液A:2XSSC、0.2%SDS中于42°C洗涤2min，重复洗片2次；洗液B:0.2 X SSC中于42 V洗潘2min，重复洗片3次。
[0056]本发明提供一种能够同时检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，包括该基因芯片的试剂盒，以及利用该试剂盒或者基因芯片检测鸡三种免疫抑制病的方法。
[0057](一)本发明的基因芯片制作过程及优点如下:从Genbank收集CAVREV ALV的A、C、D和J四个亚群各参考毒株的cDNA全基因或包含env高变异区域的基因序列共459条，分别对459条序列按CAV REV ALV三种病毒建库，选出每种病毒的代表序列各10条，用DNAStar软件的Clustal W程序对所选的序列进行比对，找出它们的保守区和变异区。截取所需的目的序列，送上海生工生物公司合成目的序列，经测序结果无误。利用Oiigoe软件，在变异区对每种病毒的序列数据库设计各自的种特异性探针，共设计了针对上述三种病毒的10条特异性探针；借助Primer Premier5.0软件在设计出上述10条候选探针序列的高变异区域外侧的保守区设计了 7条引物，即扩增ALV A、C、D、J的一条通用上游引物，一条J亚群下游引物，一条A、C、D和J亚群通用下游引物；扩增CAV的上下游引物；扩增REV的上下游引物，上述引物均能够对所扩增病毒进行特异性地扩增。引物序列见表3。
[0058]利用上述引物对三种病毒的参考毒株的目的DNA序列的合成质粒进行PCR扩增，然后将PCR产物分别与杂交液混匀后与点有10条特异性探针的基因芯片杂交、扫描及结果分析。探针序列见表2。对扫描结果进行取值，对含有非特异性荧光信号的探针进行阈值设定，结合阈值来判定荧光信号是否为特异性杂交信号。
[0059]本发明选取的特异性探针能特异地检测出属于同一亚群的菌株，如表1中没有带星号的菌株也能被这些特异性探针捕获出来，本发明的基因芯片可检测的范围包括CAV、REV以及ALVA、C、D、J四个亚群下的任一菌株，集实用性与高效性于一身，可用于高通量地检测ALV、CAV、REV感染情况，为高效率检测或鉴别疫情提供了最关键的方法。
[0060](二)本发明还提供一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的试剂盒，该试剂盒的特征在于包含有本发明提供的上述基因芯片和引物。该试剂盒在具备芯片扫描仪的分子生物学实验室条件下，可方便快捷地检测待测鸡群的CAV、REV以及ALV A、C、D、J亚群的感染状况，作为优选，在试剂盒中还可以包括除芯片和引物之外的PCR试剂和杂交液，使得该试剂盒更便于使用。试剂盒中还包括三种病中的任意一种病毒的含有目的基因的载体质粒DNA作为PCR阳性对照模板，用于排除假阴性；双蒸水为阴性模板，用于排除污染造成的假阳性。[0061](三)本发明还提供了检测鸡三种免疫抑制病病毒的检测方法，该方法主要特征在于采用本发明提供的基因芯片及引物。7条引物将待测毒株模板进行扩大若干倍，从而提高了毒株的检出灵敏度，同时本研究中还采取了多重PCR体系对上述三种病毒进行同时扩增，检测过程既简便又灵敏。
[0062]本发明提供的优化方案是:分别对所有引物对中的下游引物的5’端进行荧光标记，引物浓度比为J-U:J-L:Tong=5:2:3 ；C-U+C-L:R-U+R-L=l: 3 ;上述引物以多重PCR体系对待测模板进行扩增，多重PCR的目的是通过在一个体系中加入多条引物，从而能同时扩增出不同病毒的目的序列，为在临床检测中对ALV、CEV、REV的检测以及对ALV的分型提高效率。
[0063]为了提高芯片杂交的准确性，排除假阳性或假阴性，芯片上点有阳性对照探针、阴性对照探针。
[0064]综上所述本发明提供了一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，同时提供了试剂盒与优化的检测方法，能针对多种病原进行高通量、快速、准确的检测，适合于突发传染病病原检验，提供的试剂盒使检测方法简便高效，使兽医实验室工作人员能在较短的时间内对感染性疾病做出正确诊断，防止传染性疾病传播，提高我国对动物感染性疾病的控制能力，降低养殖风险。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1:基因芯片对三种病毒检测的有效性评价结果。[0066]I:CAV毒株；2:REV毒株；3:ALV A亚群毒株；4:ALV C亚群毒株；5:ALV D亚群毒株；6:ALV J亚群毒株。
[0067]图2:基因芯片对多重PCR产物的检测评价结果。
[0068]I:ALV C+J毒株DNA模板等体积混合；2:ALV A+D毒株DNA模板等体积混合；3:REV PCR产物与ALV A+DPCR产物等体积混合；4:REV+CAV质粒DNA模板等体积混合。图3:基因芯片敏感性检测评价结果。
[0069]4-1:M:Marker, 1-5:ALV A亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2~10-6倍稀释；4_2:M:Marker, 1-6:ALV C亚群毒株DNA模板起始浓度的ICT2~ICT7倍稀释;4_3:M:Marker,1-3:ALV D亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2~10-4倍稀释；4_4:M:Marker, 1-6:ALV J亚群毒株DNA模板起始浓度的Kr2~1(Τ倍稀释。4-5:M:Marker, 1-7:REV毒株DNA模板起始浓度的10_2~10_8倍稀释；4-6:M:Marker, 1-4:CAV毒株模板起始浓度的10_2~10_5倍稀释。
[0070]图4:琼脂糖凝胶电泳敏感性检测评价结果。
[0071]A1-A5:ALV A亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2~10-6倍稀释；C1_C6:ALV C亚群毒株DNA模板起始浓度的10_2~10_7倍稀释；D1-D3:ALV D亚群毒株DNA模板起始浓度的10_2~10_4倍稀释；J1-J6:ALV J亚群毒株DNA模板起始浓度的10_2~10_7倍稀释；R1_R7:REV毒株DNA模板起始浓度的10_2~10_8倍稀释；CA1_CA4:CAV毒株模板起始浓度的10_2~10_5倍稀释。 [0072]图5:基因芯片特异性检测评价结果。
[0073]I:REV PCR产物与ALV A+DPCR产物等体积混合；2:传染性法氏囊病病毒(IBDV)；3:鸡马立克氏病病毒(MDV) ；4:鸡胚成纤维细胞；5 =DF-1细胞。
【具体实施方式】
[0074]主要试剂
[0075]DNA及RNA提取试剂盒均购自QIAGEN公司。
[0076]质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司产品。
[0077]PCR Mix 购自 GenStar 公司。
[0078]琼脂糖凝胶染料Goldview购自北京赛百盛基因技术有限公司。
[0079]醛基片购自博奥生物科技有限公司。
[0080]甲酰胺、SDS、硼氢化钠、50XDenhardt均购自北京希尔诚兴业科技有限公司。
[0081]主要仪器设备
[0082]PCR仪、Power-PAC200电泳仪和Gel Doc2000凝胶成像系统均为BioRad公司产
品O
[0083]制冰机为Grant公司产品。
[0084]5415D台式离心机和5804R台式冷冻离心机均为Eppendorf公司产品。
[0085]芯片点样仪Personal Arrayerl6为博奥生物有限公司产品。
[0086]芯片杂交仪Bio Mixer II为博奥生物有限公司产品。
[0087]芯片洗干仪Slide Washer8为博奥生物有限公司产品。
[0088]微阵列芯片扫描仪Lux ScanlOK-A为博奥生物有限公司产品。[0089]生物材料的来源或记载出处:
[0090]NX0101毒株的来源:为已知毒株，记载在申请日之前的文献中。本发明所用的由山东农大崔治中老师惠赠。
[0091]RAV-1毒株购自中国兽医药品监察所:
[0092]鸡传染性贫血病毒(CIAV)、网状内皮增生病病毒(REV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)均为已知毒株，记载在申请日之前的文献中，本实验室有保存。
[0093]引物设计所依据的序列的选取
[0094]REV以及ALV的A、C、D、J四个亚群共11个参考毒株的cDNA全序列均由美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库下载(见表1)，截取目的序列，由上海生工生物公司合成。
[0095]J亚群NX0101毒株接种于DF-1细胞上，用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提取cDNA。
[0096]CAV组织毒由本试验保存，用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提取DNA。
[0097](表1)。
[0098]表1.本试验使用的参考毒株
[0099]
【权利要求】
1.一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，其特征在于:在芯片基质上设置有鸡淋巴白血病病毒ALV的四个亚群A亚群、C亚群、D亚群和J亚群、鸡传染性贫血病毒CAV、禽网状内皮增生症病毒REV的特异性探针序列，所述特异性探针序列如下: 鸡淋巴白血病病毒 A 亚群(Al)，TTTTTTTGTCTCAGGGGGAGGCCACACGGTTTCTC ； 鸡淋巴白血病病毒 A 亚群(A2)，TTTTGGTTGGTCTAGACAGGAGGCCACGCGGTTTC ； 鸡淋巴白血病病毒 A 亚群(A3)，TTTTGGATGGACTAGACAGGAAGCCACACGGTTCC ； 鸡淋巴白血病病毒 A 亚群(A4)，TTTTTGCTTTCAGATTGGTCCAGGCCGCAACTCAC ； 鸡淋巴白血病病毒 C 亚群(Cl)，TTTTGGATGTGTATATTTCGCCCCAAGGGCCACTG ； 鸡淋巴白血病病毒 D 亚群(Dl)，TTTTTTTTGGCCGGGAAGAGGTGACACACATCCTC ； 鸡淋巴白血病病毒 C 亚群(J3)，TTCTTAGTCTACAGTCAGCGACCTCGCCATTCCGC ； 鸡淋巴白血病病毒 C 亚群(J4)，CTTAGTCTACAGTCAGCTACCTCTCCCTTCCGCAC ； 鸡传染性贫血病病毒(CAV)，TTTTTTTTTGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG ； 网状内皮增生症病毒(REV), TTTTTTTTTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACA。
2.一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片试剂盒，其特征在于包括如下组件: (1)权利要求1所述的基因芯片； (2)七条引物: 鸡淋巴白血病病毒ALV的A、C、D、J四个亚群通用上游引物J-U:
5， -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3，； J 亚群下游引物 J-L:5’ -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ； A、C 和 D 亚群通用下游引物 Tong: 5’ -CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
CAV 上游引物 C-U: 5 ’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3，； CAV 下游引物 C-L:5’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3，；
REV 上游引物 R-U: 5 ’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3，；
REV 下游引物 R-L:5’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ； 且J-L、Tong、C-L与R-L的5，端有Cy3荧光标记。
3.根据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，还包括除通用引物和DNA探针之外的PCR扩增所需试剂、杂交液、芯片洗液。
4.根据权利要求3所述的基因芯片试剂盒，所述杂交液的成分为:3XSSC溶液，25%甲酰胺，0.2%SDS，5 X Denhardt 溶液。
5.根据权利要求3所述的基因芯片试剂盒，所述芯片洗液包括洗液A和洗液B;洗液A的配方为 2 X SSC, 0.2%SDS ;洗液 B 为 0.2 X SSC0
6.根据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，还包括PCR阴性对照模板和阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水，所述阳性对照模板为CAV参考毒株CUX的质粒DNA。
7.根据权利要求2~6任一所述的基因芯片试剂盒，所述七条引物混合存放在两个引物管中，；两个引物管中的引物及其混合浓度比例为J-U:J-L:Tong=5:2:3 ;(C-U+C-L):(R-U+R-L) =1:3。
8.一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片检测方法，包括如下步骤: (1)提取待测毒株的基因组DNA， (2)用如下引物对待测毒株的基因组DNA进行PCR扩增，J-U:5’ -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’ ；
J-L:5， -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ；
Tong:5’-CTGTAGCCATATGCACC-3’ ；
C-U:5’ -ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3’ ；
C-L:5’ -AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3’ ；
R-U:5’ -CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’ ；
R-L:5’ -CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’ ； 所述J-L、Tong、C-L与R-L的5’端有Cy3荧光标记； 所述PCR扩增分为两组分别进行， 其中一组PCR扩增采用以下混合引物:其中引物浓度比J-U:J-L:Tong=5:2:3 ； 另一组PCR扩增采用以下混合引物:其引物浓度比为:C-U+C-L:R-U+R-L=1:3。 (3)扩增产物与权利要求1所述的基因芯片杂交， (4)杂交后处理及扫描结果。
9.根据权利要求8所述的方法，所述PCR扩增的体系为2XPCRπ?Χ25μ1，模板DNA3 μ 1,10 μ mol/L混 合引物7~8 μ I,加无菌双蒸水至50 μ I ; PCR 反应条件 95°C，5min ;95°C 50S，56°C 50S，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0
10.根据权利要求8或9所述的方法，在步骤(2)前，先对所述基因芯片进行如下预处理:置于37°C湿盒内固定12h，用双蒸水清洗3次，在封闭液中封闭5分钟后离心甩干，4°C保存备用，所封闭液的配方为:0.75%PBS溶液，25%乙醇，0.2%NaBH4 ； 步骤(2)中以人工合成的ALV的A C D J亚群、REV的质粒DNA、CAV参考毒株CUX的质粒DNA做为阳性对照模板，以双蒸水做为阴性对照模板；所述杂交指:向杂交盒内加入300 μ L双蒸水，将所述基因芯片放入杂交盒内；将PCR扩增产物与杂交液以体积比7:8混匀，95°C变性5min后马上冰浴5min，取15 μ I变性后的混合液转移至所述基因芯片反应区，基因芯片连同杂交盒置于42°C湿润条件下杂交过夜；所述杂交后处理指:杂交后的基因芯片依次在洗液A:2XSSC、0.2%SDS中于42°C洗涤2min，重复洗片2次；洗液B:0.2 X SSC中于42V洗潘2min，重复洗片3次。
【文档编号】C12R1/93GK103667538SQ201310728530
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】杨兵, 苏霞, 陈小玲, 徐福州, 周宏专, 王金洛, 朱瑞豪, 杨丽聪 申请人:北京市农林科学院