除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
【专利摘要】本发明涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，除草剂抗性蛋白质包括：（a）具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有除草剂抗性活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明除草剂抗性蛋白质特别适合在植物中表达，对除草剂抗性广，尤其苯氧基生长素除草剂。
【专利说明】除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种对2，4-D具有抗性的蛋白质、其编码基因及用途。
【背景技术】
[0002]杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。目前有许多类型的除草剂用于控制杂草，一种特别流行的除草剂是草甘膦。已经开发了对草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麦和水稻等。因此可以对种植草甘膦抗性作物的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害作物。
[0003]草甘膦已经在全球广泛使用超过20年，由此导致对草甘膦和草甘膦耐性作物技术的过度依赖，并在野生杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦活性的植物施加了高选择压。已报道有少数杂草已发展出对草甘膦的抗性，包括阔叶杂草和禾本科杂草，如瑞士黑麦草、多花黑麦草、牛筋草、豚草、小飞蓬、野塘蒿和长叶车前。此外，在广泛使用草甘膦耐性作物之前并不是农业问题的杂草也逐渐盛行，并且难于用草甘膦耐性作物控制，这些杂草主要与(但不仅与)难于控制的阔叶杂草一起出现，如苋属、藜属、蒲公英属和鸭跖草科物种。
[0004]在草甘 膦抗性杂草或难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能控制遗漏杂草的其它除草剂来弥补草甘膦的弱点。在多数情况下控制阔叶杂草的一种流行且有效的罐混伴侣为2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。2，4-D已经在农业和非作物条件下用于广谱阔叶杂草控制超过65年，仍是全球最广泛使用的除草剂之一。对进一步使用2，4-D的限制在于它在双子叶植物(如大豆或棉花)中的选择性非常低，因此2，4-D—般不用于(且一般不靠近)敏感性双子叶作物。此外，2，4-D在禾本科作物中的用途在某种程度上受限于可能出现的作物损伤的性质。2，4-D和草甘膦的组合已经用于在种植免耕大豆和棉花之前提供更强的灭生处理，然而，由于这些双子叶物种对2，4-D的敏感性，这些灭生处理必须在种植前14-30天进行。
[0005]和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2，4-D丙酸一样，2，4-D是苯氧酸类除草剂。2，4-D用于在许多单子叶作物(如玉米、小麦和水稻)中选择性控制阔叶杂草而不严重损伤目的作物。2，4-D是合成的植物生长素衍生物，其作用为使正常的细胞激素内稳态失调，并阻碍平衡的受控生长。
[0006]2，4-D对某些植物具有不同水平的选择性(如双子叶植物比禾本科植物更敏感)。不同植物对2，4-D的不同代谢是不同水平选择性的一种解释。通常植物缓慢代谢2，4-D，因此靶位点的不同活性更可能解释植物对2，4-D不同的应答。2，4-D的植物代谢一般通过两
步代谢实现，一般是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合。
[0007]随着时间的发展，微生物种群已经发展出降解此特定外来物的有效的替代途径，所述途径引起2，4-D的完全矿化。对微生物连续应用除草剂可用来选择能利用除草剂作为碳源用于生长(从而使其在土壤中具有竞争优势)的微生物。因为这个原因，目前将2，4-D配制为具有相对短的土壤半衰期，并且对其后的作物没有遇到明显的遗留效应。这促进了2,4-D的除草剂应用。
[0008]已经广泛研究了其降解2，4-D能力的一种生物是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)。编码矿化途径中的第一个酶促步骤的基因为tfdA。TfdA通过α酮戍二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-D酸转化成二氯苯酚(DCP)。DCP与2，4-D相比几乎不具有除草剂活性。TfdA在转基因植物中用于向通常对2，4-D敏感的双子叶植物(如棉花和烟草)中输入2，4-D抗性。
[0009]已在环境中鉴定了大量编码能降解2，4-D的蛋白质的tfdA型基因。许多同系物与tfdA类似(氨基酸同一性>85%)并具有与tfdA相似的酶活性。然而，有大量同系物与tfdA具有显著更低的同一性(25-50%)，但却具有与α酮戊二酸依赖性双加氧酶Fe+2双加氧酶相关的特征残基。因此这些不同的双加氧酶的底物特异性是什么并不明确。与tfdA具有低同源性(氨基酸同一性28%)的独特实例是来自Sphingobium herbicidovorans的rdpA。已经显示此酶催化(R)-2，4-D丙酸(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2，4-D (苯氧乙酸)矿化的第一步。
[0010]随着草甘膦抗性杂草的出现和2，4-D除草剂的扩大应用，需要对2，4-D敏感的目的植物中输入2，4-D抗性。目前未发现AADM2除草剂抗性蛋白在植物中的表达水平和对除草剂的耐受性报道。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，本发明旨在提供一种新的AADM2基因，所述AADM2蛋白在植物中对除草剂具有较高的耐受性。
[0012]为实现上述目的，本发明提供了一种除草剂抗性蛋白质，包括:
[0013](a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0014](b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0015]为实现上述目的，本发明提供了一种除草剂抗性基因，包括:
[0016](a)编码所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或
[0017](b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或
[0018](c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0019]所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0.5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1 X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0020]为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述除草剂抗性基因。
[0021]为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的
重组载体。
[0022]为实现上述目的，本发明还提供了一种产生除草剂抗性蛋白质的方法，包括: [0023]获得包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转基因宿主生物的细胞；
[0024]在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；[0025]回收所述除草剂抗性蛋白质。
[0026]进一步地，所述转基因宿主生物包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。
[0027]优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0028]为实现上述目的，本发明还提供了一种用于增加除草剂靶范围的方法，包括:将所述除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于所述除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二种核苷酸一起表达。
[0029]进一步地，所述第二种核苷酸可以编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。
[0030]在本发明中，AADM2除早剂抗性蛋白质在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦抗性蛋白质的表达。这种超过一种的除草剂抗性蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第I亲本)可以通过遗传工程操作表达AADM2除草剂抗性蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦抗性蛋白质。通过第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0031]为实现上述目的，本发明还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括:用所述除草剂抗性基因或所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂为苯氧基生长素。
[0032]为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括:对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体。
[0033]优选地，所述除草剂为苯氧基生长素。
[0034]为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括:将所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受除草剂损害量的除草剂抗性蛋白质。
[0035]优选地，所述除草剂为苯氧基生长素或芳氧基苯氧链烷酸酯。所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0036]为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，包括:对种植草甘膦耐性植物的大田施用有效剂量的除草剂，所述草甘膦耐性植物包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体。
[0037]优选地，所述除草剂为苯氧基生长素。所述草甘膦耐性植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0038]为实现上述目的，本发明还提供了一种赋予作物2，4-D除草剂抗性的方法，包括:将所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。
[0039]优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0040]将所述的除草剂抗性基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0041]本发明所述的2，4-D抗性基因及其后的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)阔叶杂草物种的优良选择。2，4-D是广谱、相对便宜且强力的阔叶除草剂，如果在双子叶和单子叶中同样能提供更强的作物耐受性，则可为种植者提供优良的效用。2，4-D耐性转基因双子叶植物还可在应用时间和用量上具有更高的灵活性。2，4-D除草剂耐性性状的另一用途是它可用于预防2，4-D漂移、挥发、转化(或其它远距离的移动现象)、误用、破坏等对正常敏感性作物的损害。已经广泛使用不同苯氧基生长素组合的多种混合物来处理不同地区特定的杂草谱和环境条件。在植物中使用AADM2基因可以提供对更光谱的苯氧基生长素除草剂的防护，从而提高灵活性和可控制的杂草谱，提供对全范围市售苯氧基生长素的漂移或其它远距离苯氧基除草剂损伤的防护。
[0042]对于苯氧基生长素除草剂通常制成活性酸，但也有一些商品化配制为多种相应酯制剂之一，由于一般的植物酯酶在植物中将这些酯转换成活性酸，因此这些也同样认为是在植物中AADM2酶的底物。类似的还可以是相应酸的相应有机或无机盐。当表示手性丙酸、丙酸盐或丙酸酯除草剂时，即使不同的CAS号可能对应于光学纯的化合物，在命名这些除草剂时仍认为外消旋(R，S)或光学纯化的(R或S)对映体是同一除草剂。可能的用量范围可以是作物或非作物用途中单独处理或与其他除草剂组合。[0043]现已鉴定了 AADM2基因在遗传改造用于植物表达后具有允许在植物中使用苯氧基生长素除草剂的特性，所述植物中固有耐性不存在或不足以允许使用这些除草剂。此外，AADM2基因可以在天然耐性不足以允许选择性时在植物中提供对苯氧基生长素除草剂的防护。现在可以连续或罐混地与一种、两种或若干苯氧基生长素除草剂的组合处理仅含AADM2基因的植物。用于控制广谱双子叶杂草的每种苯氧基生长素除草剂的用量范围从25至4000g ae/ha,更通常从100至2000g ae/ha。在同一大田里(连续或罐混组合地)组合这些不同化学类别和具有不同作用模式和范围的除草剂可以提供对大多数需要除草剂控制的潜在杂草的控制。
[0044]草甘膦被广泛地使用，因为它控制非常广谱的阔叶和禾本科杂草物种。然而，在草甘膦耐性作物和非作物应用中重复使用草甘膦已经(而且仍将继续)选择使杂草演替为天然更具有耐性的物种或草甘膦抗性生物型。多数除草剂抗性管理策略建议使用有效用量的罐混除草剂伴侣作为延缓出现抗性杂草的方法，所述除草剂伴侣提供对同一物种的控制，但具有不同的作用模式。将AADM2基因与草甘膦耐性性状(和/或其他除草剂耐性性状)叠加可通过允许对同一作物选择性使用草甘膦和苯氧基生长素(如2，4-D)而实现对草甘膦耐性作物中草甘膦抗性杂草物种(被一种或多种苯氧基生长素控制的阔叶杂草物种)的控制。这些除草剂的应用可以是在含有不同作用模式的两种或更多除草剂的罐混合物中同时使用、在连续使用(如种植前、出苗前或出苗后)中单个除草剂组合物的单独使用(使用的间隔时间范围从2小时到3个月)，或者备选地，可以在任何时间(从种植作物7个月内到收获作物时(或对于单个除草剂为收获前间隔，取最短者))使用代表可应用每种化合类别的任意数目除草剂的组合。
[0045]在控制阔叶杂草中具有灵活性是很重要的，即使用时间、单个除草剂用量和控制顽固或抗性杂草的能力。作物中与草甘膦抗性基因/AADM2基因叠加的草甘膦应用范围可以从250至2500g ae/ha ;苯氧基生长素除草剂(一种或多种)可按照从25_4000g ae/ha。这些应用的时间的最佳组合取决于具体的条件、物种和环境。
[0046]除草剂制剂(如酯、酸或盐配方或可溶浓缩剂、乳化浓缩剂或可溶液体)和罐混添加剂(如佐剂或相容剂)可显著影响给定的除草剂或一种或多种除草剂的组合的杂草控制。任意前述除草剂的任意化学组合均在本发明的范围内。
[0047]本领域技术人员所熟知的，两种或更多作用模式的组合在提高受控杂草谱和/或天然更具耐性物种或抗性杂草物种上的益处还可扩展到通过人工(转基因或非转基因)在作物中产生除草甘膦耐性作物外的除草剂耐性的化学品。事实上，可以单独或以多重组合叠加编码以下抗性的性状以提供有效控制或防止杂草演替对任意前述类别的除草剂的抗性的能力:草甘膦抗性(如抗性植物或细菌EPSPS、GOX、GAT)、草铵膦抗性(如PAT、Bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其它化学品抗性基因如AHAS、Csrl, SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、对HPTO (4-羟苯基丙酮酸双加氧酶)酶抑制剂的抗性、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的抗性、对光系统II抑制性除草剂的抗性(如psbA)、对光系统I抑制性除草剂的抗性、对原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草剂抗性(如PP0-1)、对苯脲除草剂的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0048]关于其他除草剂，一些其它优选的ALS抑制剂包括三唑嘧啶磺苯胺(氯酯磺草胺、双氯磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和嘧啶并三唑类磺胺)、嘧啶硫代苯甲酸和氟唑磺隆。一些优选的HPro抑制剂包括甲基磺草酮、异恶唑草酮和磺草酮。一些优选的PPO抑制剂包括丙炔氟草胺、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵和乙氧氟草醚)。
[0049]此外，可以将AADM2基因单独或与其它除草剂耐受作物特征叠加后再与一种或多种其它输入(如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐性等)或输出(如提高的产量、改进的油量、提高的纤维品质等)性状叠加。因此，本发明可用于提供以灵活且经济地控制任何数目的农学害虫的能力和提闻作物品质的完整农学解决方案。
`[0050]本发明AADM2基因能降解2，4_D，是重要的除草剂耐受作物和选择标记物特征可能性的基础。
[0051]本发明可进行转基因表达，可以控制几乎所有阔叶杂草的除草剂组合。AADM2基因可作为优秀的除草剂耐受作物性状与例如其它除草剂耐受作物性状(如草甘膦抗性、草铵膦抗性、ALS抑制剂(如咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂抗性等)和昆虫抗性性状(CrylAb、CrylF、Vip3、其它苏云金芽孢杆菌蛋白质或非芽孢杆菌属来源的昆虫抗性蛋白等)叠加。此外，AADM2基因可作为选择标记物辅助选择用另一个基因或基因群遗传改造的植物的原代转化体。
[0052]苯氧基链烷酸酯基团可用于将稳定的酸官能团引入除草剂。酸性基团可通过“酸捕获”输入韧皮部活性(除草剂作用所需的属性)，从而可以为了活性目的而整合进新除草剂。存在很多可能为AADM2底物的市售和实验性除草剂。因此，使用本发明基因还可以得到对其它除草剂的耐性。
[0053]本发明的除草剂耐性作物性状可用在与其它除草剂耐性作物性状(包括但不限于草甘膦耐性)的新组合中。由于对除草剂(如草甘膦)的新获得的抗性或固有的耐性，这些性状组合产生控制杂草物种的新方法。因此，除了除草剂耐性作物性状，本发明的范围包括使用除草剂控制杂草的新方法，其中通过转基因作物中的所述酶产生对所述除草剂的耐性。
[0054]本发明可应用于多种植物中，如拟南芥、烟草、大豆、棉花、稻、玉米和芸薹。本发明还可用于多种其它单子叶(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和双子叶作物(如苜蓿、三叶草、乔木物种等)。类似的，2，4-D (或其它AADM2底物)可更积极地用于耐性适中的禾本科作物中，由此性状得到的提高的耐性将为种植者提供能以更有效的用量和更广的施用时间来使用这些除草剂而无作物损伤风险的可能性。
[0055]本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
[0056]本发明中所述“抗性”是可遗传的，并允许植物在除草剂对给定植物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域技术人员所认可的，即使植物受到除草剂处理的一定损伤程度明显，植物仍可被认为“抗性”。本发明中术语“耐性”比术语“抗性”更广泛，并包括“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草剂诱导的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的除草剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物损伤。
[0057]本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本 领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。
[0058]本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了 DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0059]本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明除草剂抗性基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明除草剂抗性基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0060]本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45°C条件下用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50°C条件下用
2.0 X SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0XSSC、50°C到高度严格条件的约0.2XSSC、50°C。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下与SEQ ID NO:1发生特异性杂交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0061]因此，具有除草剂耐受性活性并在严格条件下与本发明序列I杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0062]本发明提供功能蛋白质。“功能活性”(或“活性”)在本发明中指本发明用途的蛋白质/酶(单独或与其它蛋白质组合)具有降解或减弱除草剂活性的能力。产生本发明蛋白质的植物优选产生“有效量”的蛋白质，从而在用除草剂处理植物时，蛋白质表达的水平足以给予植物对除草剂(若无特别说明则为一般用量)完全或部分的抗性或耐性。可以以通常杀死靶植物的用量、正常的大田用量和浓度使用除草剂。优选地，本发明的植物细胞和植物被保护免受除草剂处理引起的生长抑制或损伤。本发明的转化植物和植物细胞优选具有2，4-D除草剂的抗性或耐性，即转化的植物和植物细胞能在有效量的2，4-D除草剂存在下生长。
[0063]本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的除草剂抗性活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有除草剂抗性活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的除草剂耐受性的生物活性的蛋白。
[0064]本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端的缺失，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为除草剂抗性蛋白质。在一些情况下(特别是植物中的表达)，使用编码截短蛋白质的截短基因可能是有利的。优选的截短基因一般编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0065]由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响除草剂抗性活性的序列，亦包括保留除草剂抗性活性的片段。
[0066]本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为:小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。
[0067]保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代:碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它们相反的互换。
[0068]对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244:1081_1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的除草剂抗性活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899_904 ；fflodaver 等，1992，FEBS Letters309:59_64)。
[0069]因此，与序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大 于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或类似性。
[0070]本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述AADM2基因的调节序列。
[0071]所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。[0072]所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0073]所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV (玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4);烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
[0074]所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。
[0075]对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。
[0076]所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。`
[0077]本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示:启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
[0078]本发明可赋予植物新除草剂抗性性状，并且未观察到对表型包括产量的不良影响。本发明中植物能耐受住如至少一种受试除草剂2X、3X、4X或5X —般应用水平。这些耐性水平的提高在本发明的范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的优化和进一步发展，以增加给定基因的表达。
[0079]本发明中，所述除草剂抗性蛋白质为AADM2氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:2所示。所述除草剂抗性基因为AADM2核苷酸序列,如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述除草剂抗性基因为用于植物，除了包含由AADM2核苷酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予昆虫抗性的蛋白质的编码区。
[0080]本发明中AADM2除草剂抗性蛋白质对大多数苯氧基生长素除草剂具有耐性。本发明中的植物，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含AADM2核苷酸序列，通过表达有效量的该蛋白而保护其免受除草剂的威胁。有效量是指未损伤的或轻微损伤的剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。
[0081]植物材料中除草剂抗性蛋白质的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码除草剂抗性蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的除草剂抗性蛋白质的量。
[0082]本发明提供了一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，具有以下优点:
[0083]1、对除草剂抗性强。本发明除草剂抗性蛋白质AADM2对除草剂的抗性强，尤其是针对苯氧基生长素除草剂， 特别是2，4-D。
[0084]2、对除草剂抗性广。本发明除草剂抗性蛋白质AADM2蛋白可以对多种苯氧基植物生长素除草剂表现出较高的抗性，因此在植物上应用前景广阔。
[0085]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0086]图1为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有AADM2核苷酸序列的重组克隆载体DBNOl-T构建流程图；
[0087]图2为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有AADM2核苷酸序列的重组表达载体DBN100288构建流程图；
[0088]图3为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有对照序列的重组表达载体DBN100288N构建流程图；
[0089]图4为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的转基因拟南芥T1植株除草剂抗性效果图；
[0090]图5为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有AADM2核苷酸序列的重组表达载体DBN100761构建流程图；
[0091]图6为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有对照序列的重组表达载体DBN100761N构建流程图。
【具体实施方式】
[0092]下面通过具体实施例进一步说明本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的技术方案。
[0093]第一实施例、AADM2基因序列的获得和合成[0094]1、获得AADM2基因序列
[0095]AADM2除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列(292个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；依据植物偏好性密码子获得编码相应于所述AADM2除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列(292个氨基酸)的核苷酸序列(879个核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0096]2、合成上述AADM2核苷酸序列
[0097]所述AADM2核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述AADM2核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的5’端还连接有SpeI酶切位点，所述AADM2核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的3’端还连接有KasI酶切位点。
[0098]第二实施例、拟南芥重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0099]1、构建含有AADM2核苷酸序列的拟南芥重组克隆载体DBNOl-T
[0100]将合成的AADM2核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT:A3600 )上，操作步骤按Promega公司产品pGEM_T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；fl表示噬菌体f I的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；AADM2为AADM2核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；MCS为多克隆位点)。
[0101]然后将重组 克隆载体DBNOl-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其热激条件为:50 μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒:将菌液在12000rpm转速下离心Imin,去上清液,沉淀菌体用100 μ I冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min ;于温度4V、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度_20°C保存备用。
[0102]提取的质粒经SpeI和KasI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述AADM2核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即AADM2核苷酸序列正确插入。
[0103]2、构建含有AADM2核苷酸序列的拟南芥重组表达载体DBN100288
[0104]用限制性内切酶SpeI和KasI分别酶切重组克隆载体DBNO1-T和表达载体DBNBC-01(载体骨架:pCAMBIA230KCAMBIA机构可以提供))，将切下的AADM2核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的SpeI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100288，其构建流程如图2所示(Spec:壮观霉素基因；RB:右边界；AtUbilO:拟南芥Ubiquitin (泛素)10基因启动子(SEQ ID NO: 3)；AADM2:AADM2核苷酸序列(SEQ ID NO: l);Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID N0:4)；prCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO: 5) ；PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(SEQID NO:6) ；tCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:7) ；LB:左边界)。
[0105]将重组表达载体DBN100288用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件为:50μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA (重组表达载体DBN100288)，42 °C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L壮观霉素(Spectinomycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，壮观霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SpeI和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100288在SpeI和KasI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即AADM2核苷酸序列。
[0106]3、构建含有对照序列的拟南芥重组表达载体DBN100288N
[0107]按照本发明第二实施例中I所述的构建含有AADM2核苷酸序列的重组克隆载体DBNOl-T的方法，利用对照序列(SEQ ID N0:8)构建含有对照序列的重组克隆载体DBNOlR-T0对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBNOlR-T中插入的天然序列为序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
[0108]按照本发明第二实施例中2所述的构建含有AADM2核苷酸序列的重组表达载体DBN100288的方法，利用天然序列构建含有天然序列的重组表达载体DBN100288N，其构建流程如图3所示(载体骨架:p CAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供)；Spec:壮观霉素基因；RB:右边界；AtUbilO:拟南芥Ubiquitin (泛素)10基因启动子(SEQ ID NO:3) ；mN:对照序列(SEQ ID N0:8) ;Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID N0:4) ;prCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID N0:5);PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:6)；tCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID N0:7);LB:左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100288N中插入的对照序列为序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
[0109]4、拟南芥重组表达载体转化农杆菌
[0110]对己经构建正确的重组表达载体DBN100288和DBN100288N (对照序列)用液氮法转化到农杆菌GV3101中，其转化条件为:100μL农杆菌GV3101、3μL质粒DNA (重组表达载体);置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌GV3101接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的壮观霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶StyI和EcoRV酶切DBN100288后进行酶切验证，用限制性内切酶StyI和BglI酶切DBN100288N (对照序列)后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100288和DBN100288N (天然序列)结构完全正确。
[0111]第三实施例、转入AADM2核苷酸序列的拟南芥植株的获得
[0112]将野生型拟南芥种子悬浮于0.1%琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4°C下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，使土壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖7天。使种子萌发并在恒温(22°C)恒湿(40-50%)光强度为120-150 μ mol/m2秒的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下在温室中培养植物。开始用霍格兰营养液灌溉植物，接着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。
[0113]使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的农杆菌菌落接种一份或多份15_30ml含壮观霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培养液的预培养物。以220rpm将培养物在28°C恒速摇动孵育过夜。每个预培养物用于接种两份500ml含壮观霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培养液的培养物并将培养物在28°C持续摇动孵育过夜。室温以约8700Xg离心10分钟沉淀细胞,弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于500ml渗透培养基中，所述渗透培养基含有1/2 XMS盐/B5维生素、10% (w/v)蔗糖、0.044 μ M苄氨基嘌呤(10 μ I/升(lmg/ml DMSO中的原液))和300 μ I/升Silvet L-77。将约I月龄的植物在培养基中浸泡15秒，确保浸没最新的花序。接着将植物侧面放倒并覆盖(透明或不透明)24小时，接着用水洗涤并竖直放置。在22°C以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养植物。浸泡约4周后收获种子。
[0114]将新收获的(AADM2核苷酸序列和天然序列)T1种子在室温干燥7天。将种子种在26.5 X 51cm萌发盘中，每盘接受ZOOmgT1种子(约10000个种子),所述种子事先已悬浮于40ml0.1%琼脂糖溶液并在4°C下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。
[0115]用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，利用重力排水。用移液管将预处理后的种子(每个40ml)均匀地种在土壤混合物上，并用保湿罩覆盖4-5天。在使用出苗后喷洒草铵膦(选择共转化的PAT 基因)进行最初转化体选择前I天移去罩。
[0116]在7个种植天数后(DAP)并于IlDAP再次使用DeVilbiss压缩空气喷嘴以IOml/盘(703L/ha)的喷洒体积用Liberty除草剂(200g ai/L的草铵膦)的0.2%溶液喷洒T1植物(分别为子叶期和2-4叶期)，以提供每次应用280g ai/ha有效量的草铵膦。在最后喷洒后4-7天鉴定存活株(生长活跃的植物)，并分别移植到用马粪土和蛭石制备的7cmX7cm的方盆中(每盘3-5棵)。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于22°C培养室中或直接移入温室。接着移去罩并在测试AADM2基因提供苯氧基生长素除草剂抗性的能力之前至少I天将植物栽种到温室(22±5°C，50±30%RH，14小时光照:10小时黑暗，最小500 μ EAi2S1天然+补充光)。
[0117]第四实施例、转基因拟南芥植株的除草剂抗性效果检测
[0118]用AADM2基因进行首次拟南芥转化。首先使用草铵膦选择方案从未转化种子背景中选择T1转化体。筛选了约20000个T1种子中并鉴定了 180株T1代阳性转化子(PAT基因)，约0.9%的转化效率。将转入AADM2核苷酸序列的拟南芥T1植株、转入对照序列的拟南芥T1植株和野生型拟南芥植株(播种后18天)分别对2，4-D 二甲铵盐和二甲四氯进行除草剂抗性效果检测。
[0119]分别将转入AADM2核苷酸序列的拟南芥T1植株、转入对照序列的拟南芥T1植株和野生型拟南芥植株分别用2，4-D 二甲铵盐(560g ae/ha，l倍大田浓度)、二甲四氯(560gae/ha, I倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷洒。喷施7天和14天后统计植株抗性情况-J天后生长状况和空白溶剂(水)一致的划为高抗植株，7天后有莲座叶卷曲的划为中抗植株，14天后仍不能抽苔的划为低抗植株，14天后死亡的划为不抗植株。由于每株拟南芥T1植株是独立的转化事件，可以预计在给定剂量内个体T1应答的显著差异。结果如表1和图4所示。
[0120]表1、转基因拟南芥T1植株除草剂抗性实验结果
[0121]
【权利要求】
1.一种除草剂抗性蛋白质，其特征在于，包括: (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种除草剂抗性基因，其特征在于，包括: Ca)编码权利要求1所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或 (b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或 (c)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.—种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述除草剂抗性基因。
4.一种包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的重组载体。
5.一种产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，包括: 获得包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的转基因宿主生物的细胞； 在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；` 回收所述除草剂抗性蛋白质。
6.根据权利要求5所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述转基因宿主生物包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。
7.根据权利要求6所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
8.一种用于增加除草剂靶范围的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所述除草剂抗性蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1所述除草剂抗性蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二种核苷酸一起表达。
9.根据权利要求8所述用于增加除草剂靶范围的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸可以编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。
10.一种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括:用权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂为苯氧基生长素。
11.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括:对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体。
12.根据权利要求11所述控制杂草的方法，其特征在于，所述除草剂为苯氧基生长素。
13.一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括:将权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受除草剂损害量的除草剂抗性蛋白质。
14.根据权利要求13所述用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，所述除草剂为苯氧基生长素。
15.根据权利要求13或14所述用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
16.一种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特征在于，包括:对种植草甘膦耐性植物的大田施用有效剂量的除草剂，所述草甘膦耐性植物包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体。
17.根据权利要求16所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特征在于，所述除草剂为苯氧基生长素。
18.根据权利要求16或17所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特征在于，所述草甘膦耐性植物为单子叶植物或双子叶植物。
19.一种赋予作物2，4-D除草剂抗性的方法，其特征在于，包括:将权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体导入植物。
20.根据权利要求19所述赋予作物2，4-D除草剂抗性的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或`甘蔗。
【文档编号】C12N9/02GK103725653SQ201310728302
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】陶青, 吴业春, 谢香庭, 牛晓广, 庞洁, 焦国伟 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心