专利名称：野生茄子耐盐基因StNHX1及其抗除草剂植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及了 一个野生茄子 iTorvumVigor' (Solanum torvum Swartz)耐盐基因StNHXl基因及其抗除草剂植物表达载 体。
背景技术：
土壤盐渍化对农业生产的威胁是一个全球性的热点问题，也是当前我国农业经济 发展所面临的生态危机之一。盐对于植物的毒害作用主要是由于水分亏缺导致的渗透胁 迫以及过量的Na+对重要生化过程的毒害。植物克服盐胁迫的机制是Na+的外排和液泡 区室化。质膜Na+/H+反向转运蛋白利用质膜H+-ATPase产生的跨膜质子梯度将Na+排出 细胞，减少Na+向叶片中的长距离转运而保护光合组织免受盐的毒害。液泡膜Na+/H+反向 转运蛋白则利用液泡膜质子泵(H+-ATPase和H+-PPase)产生的跨膜质子梯度将Na+区室 化进入液泡，不仅减轻了过多Na+的累积对细胞质的毒害，而且可以利用NaCl作为溶质维 持渗透势以驱动水分进入细胞。因此，Na+/H+反向转运蛋白在植物耐盐性中发挥着重要作 用。利用Na+/H+反向转运蛋白耐盐机理，将NHXl基因构建成植物表达载体转化植物以提 高其耐盐性，至2009年止，已获得多种转NHXl基因植物，如水稻(①Zhao F, Guo S，Zhang H, Zhao Y. Expression of yeast S0D2 in transgenic rice results in increasedsalt tolerance. Plant Sci. 2006,170 :216_224 ；② Verma D, Singla-Pareek SL, Rajagopal D, Reddy MK, Sopory SK. Functional validation of a novel isoform ofNa./H+antiporter from Pennisetum glaucum for enhancing salinity tolerance in rice.JBiosci. 2007, 32 :621-628)、小麦(Xue ZY，Zhi DY，Xue GP，Zhao YX, Xia GM. Enhanced salt tolerance of transgenic wheat(Triticum aestivum L.)expressing avacuolar Na./H+antiporter gene with improved grain yield in saline soils in the fieldand a reduced level of IeafNa+. Plant Sci. 2004，167 :849_859)、番茄(Zhang HX, Blumwald Ε.Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but notin fruit. Nat Biotechnol. 2001，19 :765_768)、玉米(Yin XY, Yang AF, Zhang Kff, Zhang JR. Production and analysis of transgenic maize with improved salt toleranceby the introduction of AtNHXl gene. Acta Bot Sin. 2004，46 :854_861)等农作物，这些转基因 植株在耐盐性方面都有了很大的提高(Ashraf M,Akram NA. Improvingsalinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering Ananalytical comparison. Biotechnology Advances. 2009,27 :744_752)。bar 基因(bialaphos resistance gene)最早从 口及 7_K 链 β 菌 (Streptomycehygroscopicus)中分离得到的，其编码产物膦丝菌素N-乙酰 转移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)能使草丁膦有效成分 PPT(phosphinothricin)降解成乙酰化衍生物而失活。目前，已创制出一系列耐除草剂(如 草甘膦)作物，如大豆(Zhang Ζ,Xing A, Staswick P,Clemente Τ. The use of glufosinateas aselective agent in Agrobacterium—mediated transformation of soybean. Plant CellTissue Organ Culture, 1999，56 :37_46)、水稻(Toki S, Takamatsy S, Nojiri C. Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic riceplants. Plant Physiol. 1992，100 :1503_1507)、小麦(梁辉，唐顺学，张驰.提高小 麦基因枪法转化频率的研究.遗传学报.1999，26 :643-648)、甘薯(Yi G，Shin YM, Choe G, Shin B, Kim YS, Kim M. Production of herbicide-resistant sweetpotatoplants transformed with the bar gene. Biotechnol Lett. 2007, 29 :669_675)等。
发明内容
本发明的目的是为解决提高农作物耐盐性的问题，提供一种新的野生茄子耐盐基 因 StNHXl。本发明的另一目的是为同时解决农作物耐盐性及抗除草剂的问题，提供该耐盐基 因StNHXl的抗除草剂植物表达载体及其构建方法。构建的野生茄子耐盐基因StNHXl抗除 草剂植物表达载体可直接用于农杆菌介导的盐敏感或除草剂敏感农作物遗传转化，创制耐 盐、抗除草剂新种质，提高盐敏感农作物的耐盐性、赋予除草剂敏感农作物抗除草剂特性， 可用于农作物品种改良。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决野生茄子耐盐基因StNHXl (Na+/H+反向转运蛋白基因)，该基因的序列为SEQ ID N0. 1。野生茄子耐盐基因StNHXl抗除草剂植物表达载体，由本发明所述的野生茄子耐 盐基因StNHXl与抗除草剂植物表达载体构成。其中，所述的抗除草剂植物表达载体优选中间载体PCAMBIA3301-121，该载体是通 过分别用 Hind III/EcoR I 双酶切 pBI121 和 pCAMBIA3301,回收 pBI121 中 3005bp 的小片 段与PCAMBIA3301中11251bp的大片段，连接所述两个片段得到的。野生茄子耐盐基因StNHXl及其抗除草剂植物表达载体的构建方法，包括如下步 骤1)野生茄子耐盐基因StNHXl的克隆选用野生茄子‘Torvum Vigor'作为试验材料，取幼嫩叶片，提取总RNA，取其2μ g 反转录cDNA，用RNase消化cDNA产物，根据NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) 耐盐基因NHXl序列信息设计特异引物，在合成的野生茄子叶片cDNA中扩增StNHXl，PCR产 物纯化后连接到PMD19-T载体上，命名为pMD19-StNHXl，BamH I/Sac I双酶切、测序验证；2)中间载体 pCAMBIA3301-121 的构建pBI121 和 pCAMBIA3301 分别 Hind III/EcoR I 双酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段与和PCAMBIA3301中11251bp的大片段(含有bar基因)，T4DNA连接酶连接，连接产 物转化DH5a感受态细胞，质粒用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒提取纯化，Hind III/EcoR I双酶切验证，得到构建成功的中间载体PCAMBIA3301-121 (含有bar基因)；3) StNHXl 植物表达载体 pCAMBIA3301_StNHXl 的构建pMD19-StNHXl 与中间载体 pCAMBIA3301_121 分别 BamH I/Sac I 双酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段与 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 连接酶连接，连接产物转化DH5A感受态细胞，质粒用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取纯化，分 别BamH I/Sac I双酶切、Hindlll/EcoR I双酶切、Xho I单酶切验证，得到构建成功的植物 表达载体pCAMBIA3301-StNHXl (含有bar基因)。有益效果1.本发明提供的野生茄子耐盐基因StNHXl是一种新的耐盐基因，该基因可提高 农作物耐盐性。2.本发明将野生茄子耐盐基因StNHXl克隆至含抗除草剂基因bar的中间载体 PCAMBIA3301-121中，构建的野生茄子耐盐基因SNHXl抗除草剂植物表达载体为茄子中首 次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感或除草剂敏感农作物遗传转化，使转基因农作物 具有抗除草剂特性并提高其耐盐性，创制农作物耐盐及耐除草剂新种质，对于进一步培育 耐盐新品系提供重要理论基础。野生茄子耐盐基因StNHXl抗除草剂植物表达载体的构建 方法在创制耐盐、耐除草剂作物方面具有广阔的应用前景。
图 lpMD19-StNHXl 质粒 BamH I/Sac I 双酶切检测，1 =DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 :pMD19-StNHXl 质粒，3 :pMD19-StNHXl/BamH I/Sac I。图 2pCAMBIA3301-121 中间载体 Hind III/EcoR I 双酶切检测，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)，3 :pCAMBIA3301 质粒，4、5 :pCAMBIA3301-121/Hind III/EcoR I，6 :pBI121/Hind III/EcoR I,7、pCAMBIA3301/Hind III/EcoR I，8 :1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)。图 3pCAMBIA3301-StNHXl 质粒 BamH I/Sac I 双酶切、Hind III/EcoR I 双酶切及 Xho I单酶切检测，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2、3、4、5 :pCAMBIA3301-StNHXl/BamH I/Sac I，6、7 :pCAMBIA3301-StNHXl/Xho I，8、9 :pCAMBIA3301-StNHXl/Hind III/EcoR I，10 =IKbp DNA Ladder Maker (TaKaRa)。图4pCAMBIA3301-StNHXl植物表达载体质粒图谱。
五具体实施例方式实施例1野生茄子耐盐基因StNHXl的克隆选用野生茄子‘Torvum Vigor，(Solanum torvum Swartz ；日本砧木品种，购自日 本Takii种苗株式会社)作为试验材料，幼苗长至八片真叶时，IOOmmol · L^lNaCl胁迫处理3天，取幼嫩叶片，按照Total RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明提取总RNA，取2 μ g总RNA 反转录cDNA(ReverTra Ace-a-TMcDNA合成试剂盒，东洋纺(上海)生物技术有限公司)； 根据 NCBI 上公布的番茄 NHXl 的序列信息(Access NO. :AJ306630. 1 ；Venema K, Belver A, Marin-Manzano MC, Rodriguez-Rosales MP, Donaire JP.A novel intracellular K+/ H+antiporter related toNa./H+antiporters is important for K+ionhomeostasis in plants. J Biol Chem. 2003，278 :22453_22459)，用 01igo6. O 引物设计软件(德国 Merck 公 司)设计特异引物，上游引物(F)序列为SEQ ID NO. 2，下游引物(R)序列为SEQ ID NO. 3， 进行PCR反应，在野生茄子叶片cDNA中扩增StNHXl基因①利用上、下游引物(F、R)以野生茄子cDNA为模板进行PCR反应，反应体系 (20 μ L) :ddH20 10. 2 μ L, 5 X Buffer 4μ L, dNTP (2. 5mmol · L-1) 1· 6 μ L，F (SEQID Ν0· 2)、 R(SEQ ID NO. 3)弓丨物(20 μ mol · L-1)各 1 μ L，cDNA( < 1 μ g) 1 μ L，DNA STAR 1 μ L ；PCR 扩增程序95°C预变性4min，93°C变性30s, 56. 8°C退火30s，72°C延伸100s，30个循环，再 72°C延伸 IOmin ；②PCR产物产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，爱思进生物技术(杭州)有限公 司)纯化后连接到PMD19-T载体(TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司)上，连接体系 (IOyL) :pMD19-T 载体 lyL，PCR产物 4yL，Solution I 5 μ L ;4°C过夜连接；连接产物(命 名为pMD19-StNHXl)转化DH5 α感受态细胞(南京天为生物科技有限公司)，进行BamH I/ Sac I双酶切验证(图1)和序列测定，序列如SEQ ID NO. 1所示，后续试验中备用；实施例21)野生茄子耐盐基因StNHXl的克隆同实施例1。2)中间载体 pCAMBIA3301-121 的构建pBI121 (Promega，普洛麦格(北京)生物技术有限公司)和pCAMBIA3301 (CAMBIA, 澳大利亚)分别Hind III/EcoR I双酶切，回收pBI121中的小片段(3005bp)与 PCAMBIA3301中的大片段(11251bp)，按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接，命名 为PCAMBIA3301-121，连接产物转化DH5a感受态细胞，提取质粒进行Hind III/EcoR I双 酶切验证，具体步骤如下①取pBI121 和 pCAMBIA3301 质粒各 10μ L，分别用 Hind III/EcoR I 双酶切， 酶切反应体系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0· 5 μ L，ρΒΙ121 或 PCAMBIA3301 plasmid 10 μ L，Hind III(Promega)1. 5 μ L, EcoR I(Promega)1. 5 μ L ;37°C, 反应2h;酶切产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pBI121中的小片段(3005bp)与 PCAMBIA3301 中的大片段(Il25Ibp)。②回收得到的pBI121中的小片段(3005bp)与pCAMBIA3301中的大片段 (11251bp)按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接，连接体系(IOyL) :ddH20 3 μ L， ρΒΙ121 中的小片段(3005bp)4y L, pCAMBIA3301 中的大片段(11251bp) 1 μ L, IOXBuffer luL, T4连接酶IyL ;4°C，过夜连接；连接产物(命名为pCAMBIA3301_121)转化DH5 α感 受态细胞，提取质粒后，Hind III/EcoR I双酶切验证(图2)，得到构建成功的中间载体ρ PCAMBIA3301-121。3)植物表达载体 pCAMBIA3301-SNHXl 的构建pMD19-StNHXl 与中间载体 pCAMBIA3301_121 分别 BamH I/Sac I 双酶切，回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)与 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)，按 4 1的比例用T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，提取质粒后进行酶切验证①取质粒pMD19-StNHXl 与中间载体 pCAMBIA3301_121 各 10 μ L，分别用 BamH I/Sac I 双酶切，酶切反应体系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0·5 μ L，pMD19-StNHXl 或 pCAMBIA3301_121 plasmid 10 μ L, BamH I/(Promega)1· 5 μ L， Sac I (Promega) 1. 5 μ L ;37 °C，反应2h ；酶切产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)与 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)。②回收得到的pMD19-StNHXl中的小片段(1605bp)与pCAMBIA3301_121中的 大片段(12445bp)按4 1的比例用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接，连接体系(IOyL) ddH20 3 μ L, pMD19-StNHXl 中的小片段(1604bp)4y L, pCAMBIA3301_121 中的大片段 (12445bp)lyL,10XBuffer IyL, T4连接酶1 μ L ;4 °C，过夜连接；连接产物(命名为 PCAMBIA3301-StNHXl)转化DH5 α感受态细胞，提取质粒后，分别BamH I/Sac I双酶 切、Hind III/EcoR I双酶切、Xho I单酶切验证(图3)，得到构建成功的植物表达载体 pCAMBIAl301-StNHXl (图 4)。综上所述，本发明构建的野生茄子耐盐基因StNHXl基因及该基因的抗除草剂植 物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl为茄子中首次报道，可直接用于农杆菌介导的盐敏感或 除草剂农敏感作物遗传转化，提高盐敏感农作物耐盐性和赋予除草剂敏感农作物抗除草剂 特性，消除盐碱地逆境和除草剂对农作物的危害，可进行农作物品种改良。
权利要求
野生茄子耐盐基因StNHX1，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO.1。
2.野生茄子耐盐基因StNHXl抗除草剂植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的 野生茄子耐盐基因StNHXl与抗除草剂植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的野生茄子耐盐基因StNHXl抗除草剂植物表达载体，其特 征在于所述的抗除草剂植物表达载体为分别用Hind III/EcoR I双酶切质粒pBI121和 PCAMBIA3301,回收pBI121中的3005bp的小片段与pCAMBIA3301中的11251bp的大片段， 连接所述的两个片段得到的中间载体PCAMBIA3301-121。
4.权利要求3所述的野生茄子耐盐基因SNHXl抗除草剂植物表达载体的构建方法，其 特征在于包括如下步骤1)野生茄子‘TorvumVigor’耐盐基因StNHXl的克隆选用野生茄子‘Torvum Vigor’作为试验材料，取叶片，提取总RNA，反转录得到cDNA， 用RNase消化cDNA产物，根据NCBI上公布的番茄耐盐基因NHXl序列信息设计特异引物， 在合成的野生茄子叶片cDNA中扩增StNHXl，PCR产物纯化后连接到pMD19_T载体上，命名 为 pMD19-StNHXl，BamH I/SacI 双酶切、测序验证；2)中间载体pCAMBIA3301-121的构建PBI121 和 pCAMBIA3301 分别 Hind III/EcoR I 双酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段和PCAMBIA3301中11251bp的大片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感 受态细胞，质粒经提取纯化后，Hind III/EcoR I双酶切验证，得到构建成功的中间载体 PCAMBIA3301-121 ；3)StNHXl植物表达载体pCAMBIA3301-StNHXl的构建pMD19-StNHXl 与中间载体 pCAMBIA3301_121 分别 BamH I/Sac I 双酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段与 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，质粒经提取纯化后，分别BamH I/Sac I 双酶切、Hind III/EcoR I双酶切、Xho I单酶切验证，得到构建成功的植物表达载体 PCAMBIA3301-StNHXl ο
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了野生茄子耐盐基因StNHX1及其抗除草剂植物表达载体。本发明所述的野生茄子耐盐基因StNHX1序列为SEQIDNO.1。该基因的抗除草剂植物表达载体是将StNHX1基因插入到中间载体pCAMBIA3301-121的BamHI/SacI酶切位点间得到的。该植物表达载体转化农作物后将会使其具有抗除草剂特性并可提高其耐盐性，对提高我国农作物分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。
文档编号C12N15/66GK101974538SQ20101052257
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者朱月林, 杨立飞, 盖钧镒, 陈国户 申请人:南京农业大学