专利名称：一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，以及含有该重组标准质粒的试剂盒。背景技术：
自首例转基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美国批准商业化生产以来，随着转基因技术迅速发展，许多有价值的外源基因导入了植物中，越来越多的转基因作物被批准在不同国家和地区商业化种植。对水稻而言，目前有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功，转基因水稻品系:KF6、TT51和KMDl为我国拥有自主知识产权的抗虫Bt水稻，其中转基因抗虫水稻华恢I号(TT51)在2009年，我国农业部颁发了其在湖北省生产应用的安全证书。
为保障在农产品进出口贸易中的利益，各国相继建立转基因标识制度，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，目前对转基因作物及其产品的检测主要有蛋白质水平检测和核酸水平检测，而由于核酸的提取、保存及稳定性等方面的优势，使得基于核酸检测的转基因检测技术得到快速发展，其中以聚合酶链式反应(PCR)技术发展得最快，转基因作物PCR检测方法又分为4个层次，分别为筛查检测、基因检测、构建特异性检测和转化体特异性检测，在日常的检测工作中，由于转基因样品量较大，转基因的筛查工作显得尤为重要，而阳性标准品的缺乏无法满足转基因安全监管中筛查工作的需求，因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用质粒标准分子具有重要的意义。
阳性质粒分子的概念由日本科学家Kuribara H等于2002年提出，它是指一种含有转基因作物检测的目的外源基因和内标准基因的特异性扩增片段的线性化的重组质粒分子。阳性质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，且操作容易，同一个阳性质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，质粒DNA提取容易且纯度较高。转基因作物阳性质粒分子是转基因标准物质的一种。开发阳性质粒分子可以有效的解决检测工作中缺乏有证标准物质和阳性材料的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种为转基因水稻筛查检测用重组标准质粒及其应用，满足转基因水稻安全监管筛查检测工作中的需求。
本发明采用 的技术方案是:
一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得:利用重叠PCR技术将SEQ ID N0.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID N0.2所示的SPS基因、SEQ ID N0.3所示的Bt 基因、SEQ ID N0.4 所示的 NPT II 基因、SEQ ID N0.5 所示的 Htp 基因、SEQ ID N0.6 所示的Bar基因和SEQ IDN0.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再利用分子克隆技术将所得融合片段克隆到载体PUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。
CaMV35S 基因序列如下(195bp):
GctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatcSPS基因序列如下(290bp):Atctgtttactcgtcaagtgtcatctcctgaagtggactggagctatggggagcctactgaaatgttaacctccgg ttccactgacggagagggaagcggtgagagtgctggtgcgtacattgtgcgcattccgtgcggtccaagggacaagtacttccgtaaagaggccctgtggccttacctccaagagtttgtcgacggagctctcgcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggggaacaggttagcaatgggaagctggtcttgccatatgtaatcctaggcBt基因序列如下(301bp):Gaaggtttg agcaatctctaccaaatctatgcagagagcttcagagagtgggaagccgatcctactaacccagctctccgcgaggaaatgcgtattcaattcaacgacatgaacagcgccttgaccacagctatcccattgttcgcagtccagaactaccaagttcctctcttgtccgtgtacgttcaagcagctaatcttcacctcagcgtgcttcgagacgttagcgtgtttgggcaaaggtggggattcgatgctgcaaccatcaatagccgttacaacgaccttactaggctgatcgNPT II基因序列如下(325bp):ActgggcacaacagacaatcgttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcagctgctctgatgccgcygtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcgggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcHtp基因序列如下(472bp):GaagtgcttgacattggggagttcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatctBar基因序列如下(430bp):AccatcgtcaaccactacatcgagacaagcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcatgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgetgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagcNOS基因序列如下(180bp):Gaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataa
本发明根据目前转基因水稻中常用的外源元件:CaMV35S，Bt, NPT II，Htp, Bar,NOS及水稻内标基因SPS的序列，设计相应的引物，利用重叠PCR技术将七个序列片段融合在一起，再利用分子克隆技术将融合片段克隆到PUC19载体中，获得重组标准质粒pUC-RS。
具体的，所述融合片段核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示(2193bp):
gctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatcatctgtttactcgtcaagtgtcatctcctgaagtggactggagctatggggagcctactgaaatgttaacctccggttccactgacggagagggaagcggtgagagtgctggtgcgtacattgtgcgcattccgtgcggtccaagggacaagtacttccgtaaagaggccctgtggccttacctccaagagtttgtcgacggagctctcgcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggggaacaggttagcaatgggaagctggtcttgccatatgtaatcctaggcgaaggtttgagcaatctctaccaaatctatg cagagagcttcagagagtgggaagccgatcctactaacccagctctccgcgaggaaatgcgtattcaattcaacgacatgaacagcgccttgaccacagctatcccattgttcgcagtccagaactaccaagttcctctcttgtccgtgtacgttcaagcagctaatcttcacctcagcgtgcttcgagacgttagcgtgtttgggcaaaggtggggattcgatgctgcaaccatcaatagccgttacaacgaccttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcgttactaggctgatcgactgggcacaacagacaatcagctgctctgatgccgcygtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcgggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcgaagtgcttgacattggggagttcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgetgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatctaccatcgtcaaccactacatcgagacaagcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcatgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagcgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataa。
本发明所述重组标准质粒pUC-RS具体可按如下方法构建:
(I)利用GenBank数据库和相关文献 检索,犾得水稻内标准基因SPS及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S, Bt, NPT II，Htp，Bar, NOS的序列。
所述的水稻内标准基因SPS，是指蔗糖磷酸合酶基因(GeneBankN0.U33175)，在水稻基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数等特点。
所述的转基因水稻中常用到的外源元件是指以下基因中的部分序列:CaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子；Bt =CrylAb基因、CrylAc基因、CrylAb/CrylAc融合基因的同源序列；NPT I1:新霉素磷酸转移酶基因；Htp:潮霉素磷酸转移酶基因；Bar:抗除草剂基因；NOS:胭脂碱合酶终止子。(2)根据SPS基因序列及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S，Bt, NPT II，Htp，Bar, NOS的序列，设计重叠PCR引物。所述的重叠PCR引物，是指SPS基因序列及转基因水稻中常用到的外源元件；CaMV35S，Bt, NPT II, Htp, Bar, NOS的序列完全相同或者互补的引物，使各目的片段达到无
缝连接。所述的重叠PCR引物序列如下:35S-F:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC35S-R-add:gacgagtaaacagatGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCSPS-F-add:acaatcccactatcATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTCSPS-R-add:gctcaaaccttcGCCTAGGATTACATATGGCAAGABt-F-add:atgtaatcctaggcGAAGGTTTGAGCAATCTCTACBt-R-add:tgttgtgcccagtCGATCAGCCTAGTAAGGTCGTNpt-F-add:ctaggctgatcgACTGGGCACAACAGACAATCGNpt-R-add:aatgtcaagcacttcGCATCAGCCATGATGGATACTTTHpt-F-add:tcatggctgatgcGAAGTGCTTGACATTGGGGAGT
Hpt-R-add:tggttgacgatggtAGATGTTGGCGACCTCGTATTBar-F-add:tcgccaacatctACCATCGTCAACCACTACATCGBar-R-add:ggcaacaggattcGCTGCCAGAAACCCACGTCATNos-F-add:ggtttctggcagcGAATCCTGTTGCCGGTCTTGNos-R:TTATCCTAGTTTGCGCGCTA。(3)新的重组DNA片段的质粒分子克隆。所述的分子克隆，指的是将上述得到的重组特异性DNA片段连接到质粒载体PUC19上，获得转基因标准阳性质粒分子pUC-RS，获得的质粒分子的外源全序列见图2。(4)构建的重组标准质粒在转基因水稻筛查定性PCR中的验证。所述的定性PCR验证，是指用定性PCR方法验证构建的重组标准质粒pUC_RS中能扩增出水稻内标准基因SPS特异序列以及转基因水稻中常用的元件(CaMV35S，Bt, NPT II,Htp，Bar，NOS)序列，且pUC-RS中各特异性序列的检测灵敏度能满足定性PCR检测的要求。本发明还涉及所述的重组标准质粒在转基因水稻筛查中的应用。本发明还涉及一种用于转基因水稻筛查的检测试剂盒，主要包括所述的重组标准质粒(标准品)和特异性引物；所述特异性引物序列如下:CaMV35S基因特异性引物:35S-F:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC35S-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCSPS基因特异性引物:SP S-F:ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTCSPS-R:GCCTAGGATTACATATGGCAAGA
权利要求
1.一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得:将SEQ IDN0.1所示的CaMV35S 基因、SEQ ID N0.2 所示的 SPS 基因、SEQ IDN0.3 所示的 Bt 基因、SEQ ID N0.4 PJf示的NPT II基因、SEQ ID N0.5所示的Htp基因、SEQ ID N0.6所示的Bar基因和SEQ IDN0.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。
2.如权利要求1所述的重组标准质粒，其特征在于所述融合片段核苷酸序列如SEQIDN0.8所示。
3.如权利要求1所述的重组标准质粒在转基因水稻筛查中的应用。
4.一种用于转基因水稻筛查的检测试剂盒，主要包括权利要求1所述的重组标准质粒和特异性引物；所述特异性引物序列如下: CaMV35S基因特异性引物:35S-F:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC35S-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCSPS基因特异性引物:SPSF:ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTCSPS-R:GCCTAGGATTACATATGGCAAGABt基因特异性引物:Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTACBt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGTNPT II基因特异性引物: Npt-F:ACTGGGCACAACAGACAATCGNpt-R:GCATCAGCCATGATGGATACTTTHtp基因特异性引物:Hpt-F:GAAGTGCTTGACATTGGGGAGTHpt-R:AGATGTTGGCGACCTCGTATTBar基因特异性引物:Bar-F:ACCATCGTCAACCACTACATCGBar-R:GCTGCCAGAAACCCACGTCATNOS基因特异性引物:Nos-F:GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNos-R:TTATCCTA GTTTGCGCGCTA。
全文摘要
本发明提供了一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得利用重叠PCR技术将SEQ ID No.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID No.2所示的SPS基因、SEQ ID No.3所示的Bt基因、SEQ IDNo.4所示的NPTⅡ基因、SEQ ID No.5所示的Htp基因、SEQ ID No.6所示的Bar基因和SEQ ID No.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再利用分子克隆技术将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。该重组标准质粒可以替代转基因水稻筛查检测中的阳性标准品，用于对转基因水稻定性PCR筛查检测，很好地解决了转基因水稻筛查检测过程中阳性标准品匮乏的问题。
文档编号C12Q1/68GK103215346SQ201310065278
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者汪小福, 陈笑芸, 徐俊锋, 缪青梅, 朱妍晴, 朱青 申请人:浙江省农业科学院