专利名称：紫菜种质鉴定试剂及使用方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物技术，具体地说是一种紫菜种质鉴定试剂及使用方法。
紫菜是中国重要的经济海藻，目前，紫菜采苗主要以丝状体做为种苗进行采苗，但单凭丝状体的颜色等感观特征不能有效地鉴别种间、种内的差异，生产中会引起混乱使用，因此，建立一套快速、有效的紫菜种质检测技术十分必要。紫菜种质检测方法有形态学水平即形态外表特征的鉴定，染色体水平即细胞中染色体鉴定，同工酶水平即生化蛋白质大分子的鉴定，和近年来脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)水平的研究鉴定技术。
从分子标记方法角度看，随机扩增多态脱氧核糖核酸(RAPD)、限制性片断长度多态性(RFLP)、扩增片断长度多态性(AFLP)、间隔简单重复序列(ISSR)等技术不断出现，这些高技术在藻类方面的应用刚刚开始。国外已对海带、紫菜、单细胞藻、马尾藻、江篱属的一些种，开展了分子遗传标记的研究，主要目的是阐述海藻的分子、生化水平的进化关系。
海洋生物领域中的分子标记技术，目前仅局限在RAPD、RFLP水平。RAPD方法虽然成本低，相对技术简单，但实验室的可交流性差；RFLP方法要求的DNA质量高，但要使用放射性同位素，具有一定危险性。目前，国内一些研究单位在DNA提取、扩增反应条件等方面，一般实验室主要采用RAPD技术作了探索，但随引物、模板的差异其结果有较大的不同，可重复性差，难以形成统一的标准，因此，受到许多限制，如果发明具有分子标记作用的鉴定试剂，对经济海藻种质检测、杂交鉴定、病害诊断等可以进行应用。
本发明的目的是提供一种能提高紫菜种质鉴定的特异性和标准性的紫菜种质鉴定试剂及使用方法，具有可重复性、有效性，能在原有的RAPD扩增基础上，再进一步对紫菜的细胞系作更严格的鉴定。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是紫菜种质鉴定试剂，按浓度计，取三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)7～15mM，乙二胺四乙酸(Ethlenediaminetetra-acetic acid缩写EDTA)18～22mM，氯化钠(NaCl2)1.2～1.4M；按体积百分比计，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl trimethylammonium bromide)，1.5～2.5％十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate缩写SDS)；所述三羟甲基胺基甲烷盐酸pH值为8.0～8.3；其使用方法，按如下步骤操作a.紫菜丝状体DNA的提取，紫菜丝状体研磨，离心，用所述试剂溶解液，在35～70分钟时间范围内裂解；用氯仿∶异戊醇抽提，上清液加入0.2～0.25倍于上清液体积的10％SDS水溶液和0.3～0.36倍于上清液体积的3.5～4.5M乙酸钾(KAc)水溶液，置于冰中10～15分钟，用氯仿∶异戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液体积的异丙醇水溶液，冰中置30～50分钟，离心10～15分钟；离心后试管里的沉淀物用70％乙醇洗1～3次，抽干，用0.8～1.2mL三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris.EDTA)缓冲液溶解沉淀；加RNA酶10～13mg/ml，35～38℃保温1～1.5小时，用等体积的氯仿∶异戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍上清液体积的醋酸钠水溶液，1.5～2.5倍上清液体积的无水乙醇，-18～-22℃沉淀，离心10～20分钟；用70～80％乙醇洗，抽干，用1～2倍于上清液体积的Tris.EDTA缓冲液溶解沉淀，取2～4μl DNA样品在0.7～0.9％的琼脂糖(Agarose)胶电泳，溴化乙锭(EtBr)染色，与标准Lamda DNA对照，估算DNA浓度。
b.所述紫菜丝状体DNA的纯化
DNA粗提物，与300～500μl溶胶液、8～12μl玻璃奶(Glassmilk)混匀，冰上放置10～20分钟，中间轻摇2～3次；离心30～50秒，去上清液，其沉淀用300～500μl漂洗液漂洗，吹干；用500～1000μl H2O或1～3倍于上清液体积的500～1000μl Tris.EDTA缓冲液在50～70℃范围内保温5～10分钟，离心1～3分钟，上清液保存备用。
c.RAPD反应10μl反应体积中含有50～60mM Tris.HCl，2～5mM氯化镁(MgCl2)，0.2～0.5mM二磷酸多苷(DNTP)，0.8～1.0％富可400(Ficoll400)，1～3mM酒石磺(Tartarzine)，4～6μm牛肉血压清蛋白(BSA)，30～50ng引物，5～10ng模板DNA，0.5～0.7单位Taq聚合酶。
多聚循环反应(PCR)参数条件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2～5个循环；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38～45个循环；70～75℃保温4～6分钟。
PCR反应后，产物直接在1.5％Agarose胶上进行电泳分离，EtBr染色，紫外照相记录结果。
d.ISSR反应10～15mM Tris.HCl，2～6mM MgCl2，0.2～0.6mM DNTP，0.8～1.0％Ficoll400，1～3mM Tartarzine，4～6μm BSA，30～60ng引物，5～10ng模板DNA，0.6～0.8单位Taq聚合酶。
ISSR反应参数条件96℃ 1分钟；94℃ 30秒，退火温度+4℃10秒，72℃ 60秒，2～4个循环；
94℃ 30秒，退火温度+2℃10秒，72℃ 60秒，2～5个循环；94℃ 2秒，退火温度℃10秒，72℃ 70秒，35～45个循环；70～75℃保温4～6分钟。
扩增产物用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其电泳结果处理与PCR反应相同。
所述氯仿∶异戊醇比例为24∶1；步骤a中所述醋酸钠pH值在5.0～5.4范围内；所述Tris.HCl pH值在8.0～8.5范围内；所述DNTP为二磷酸腺苷(DATP)、二磷酸胞苷(DCTP)、二磷酸胸苷(DTTP)和二磷酸鸟苷(DGTP)；优化反应条件所述引物为ISSR25、ISSR28或ISSR30；所述退火温度根据不同的引物在46～50℃之间；所述EDTA的pH值在8.0～8.5范围内。
本发明具有如下优点由于本发明简化了紫菜丝状体DNA的提取步骤，采用Glassmilk进行纯化，用PCR扩增条件优化了反应条件，具有可重复性、稳定性，鉴定效率高特点。本发明属分子标记的商品试剂，可以应用于紫菜的种质鉴定，有效地区分紫菜或非紫菜材料、紫菜不同细胞系，还可以对紫菜生产单位选择育种有重要作用。另外，在区别具有同一感官特征的紫菜细胞系时，也可以进行分子标记鉴定，区别出具有不同遗传背景的紫菜细胞系，为紫菜混杂的区分提供一种有效的方法。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1紫菜种质鉴定试剂按浓度计，取10mmolL-1Tris.HCl，pH值为8.0，20mmolL-1EDTA，1.4M NaCl2；按体积百分比计，取2％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，1.5％SDS。
所述试剂的使用具体操作如下1.紫菜丝状体DNA的提取
紫菜丝状体及硅胶及液氮研磨，研磨的粉末转移到50mL离心管，通过含有15mL所述试剂溶解液，65℃保温35min，将细胞充分裂解。用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.2倍于上清液体积的10％SDS水溶液和1/3倍于上清液体积的4M KAc水溶液，置于冰中10分钟，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，上清液加入0.6倍于上清液体积的异丙醇水溶液，冰中30分钟，12000rmp离心10分钟；离心后试管里的沉淀物用70％乙醇洗一次，抽干乙醇，用1mL Tris.EDTA缓冲液(10mM Tris HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；加2μl无DNA酶的RNA酶10mg，在37℃情况下保温1小时，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，加0.1倍上清液体积的醋酸钠水溶液(pH5.2)，2倍上清液体积的无水乙醇，-18℃沉淀2小时以上，12000rmp离心10分钟；用70％乙醇洗一次，抽干除去多余的乙醇，用200μl 1倍于上清液体积的Tris.EDTA溶解沉淀，取2μl DNA样品在0.8％的Agarose胶电泳，EtBr染色，与标准Lamda DNA对照，估算DNA浓度。
2.用提纯DNA试剂Glassmilk纯化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，与300μl溶胶液、10μl Glassmilk混匀，冰上放置10分钟，中间轻摇3次；1000rpm离心30秒，去上清液，其沉淀用300μl漂洗液漂洗3次，吹干；用500ul H2O漂洗，于60℃温度下保温5分钟，12000rpm离心1分钟，上清保存备用。
3.RAPD反应10μl反应体积中含有50mM Tris HCl(pH8.3)，2mM MgCl2，0.2mM DATP、0.2mM DCTP、0.2mM DTTP和0.2mM DGTP，0.8％Ficoll400，1mM Tartarzine，5μm BSA，30ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.5单位TaqDNA聚合酶。
多聚循环反应(PCR)参数条件
94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2个循环；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38个循环；72℃保温5分钟。
PCR反应后，产物直接在1.5％Agarose胶上进行电泳分离，EtBr染色，紫外照相记录结果。
4.ISSR反应10mM Tris HCl(pH8.3)、2mM MgCl2、0.2mM DATP、0.2mM DCTP、0.2mM DTTP和0.2mM DGTP，0.8％Ficoll400，1mM Tartarzine，5μm BSA，30ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.6单位Taq DNA聚合酶。
反应参数条件96℃ 1分钟；94℃ 30秒，退火温度46℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，2个循环；94℃ 30秒，退火温度46℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，2个循环；94℃ 2秒，退火温度46℃ 10秒，72℃ 70秒，36个循环；72℃保温4分钟。
扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其电泳结果处理与RAPD相同。
实施例2紫菜种质鉴定试剂按浓度计，取15mmolL-1Tris.HCl，pH值为8.1，18mmolL-1EDTA，1.3M NaCl2；按体积百分比计，取1.5％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，1.2％SDS。
所述试剂的使用具体操作如下1.紫菜丝状体DNA的提取紫菜丝状体及硅胶及液氮研磨，研磨的粉末转移到50mL离心管，通过含有15mL所述试剂溶解液，50℃保温45min，将细胞充分裂解。用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.23倍于上清液体积的10％SDS水溶液和0.36倍于上清液体积的3.5M KAc水溶液，置于冰中13分钟，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，加入0.7倍于上清液体积的异丙醇水溶液，冰中40分钟，12000rmp离心15分钟；离心后试管里的沉淀物用70％乙醇洗2次，抽干乙醇，用0.8mL Tris.EDTA缓冲液(10mM Tris HCl，pH8.5，1mMEDTA，pH8.2)溶解沉淀；加2μl无DNA酶的RNA酶15mg，在38℃情况下保温1.5小时，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，加0.2倍于上清液体积的醋酸钠水溶液(pH5.0)，1.5倍于上清液体积的无水乙醇，-20℃沉淀2小时以上，12000rmp离心15分钟；用75％乙醇洗一次，抽干乙醇，用200μl 1倍于上清液体积的Tris.EDTA溶解沉淀，取3μl DNA样品在0.7％的Agarose胶电泳，EtBr染色，与标准Lamda DNA对照，估算DNA浓度。
2.用提纯DNA试剂Glassmilk纯化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，与400μl溶胶液、18μl Glassmilk混匀，冰上放置15分钟，中间轻摇2次；1000rpm离心40秒，去上清液，其沉淀用400μl漂洗液漂洗3次，吹干；用2倍于上清液体积的1000μl Tris.EDTA漂洗，或于50℃温度下保温8分钟，12000rpm离心2分钟，上清液保存备用。
3.RAPD反应10μl反应体积中含有55mM Tris HCl(pH8.5)，4mM MgCl2，0.5mM DATP、0.5mM DCTP、0.5mM DTTP和0.5mM DGTP，1％Ficoll400，2mM Tartarzine，4μm BSA，40ng引物ISSR28，8ng模板DNA，0.6单位Taq DNA聚合酶。
多聚循环反应(PCR)参数条件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，4个循环；
94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，40个循环；72℃3保温5分钟。
PCR反应后，产物直接在1.5％Agarose胶上进行电泳分离，EtBr染色，紫外照相记录结果。
4.ISSR反应13mM Tris HCl(pH8.1)、3mM MgCl2、0.4mM DATP、0.4mM DCTP、0.4mM DTTP和0.4mM DGTP，1％Ficoll400，3mM Tartarzine，4μm BSA，60ng引物ISSR28，10ng模板DNA，0.7单位Taq DNA聚合酶。
反应参数条件96℃ 1分钟；94℃ 30秒，退火温度50℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，4个循环；94℃ 30秒，退火温度50℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，4个循环；94℃ 2秒，退火温度50℃ 10秒，72℃ 70秒，35个循环；70℃保温6分钟。
扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其电泳结果处理与RAPD相同。
实施例3紫菜种质鉴定试剂按浓度计，取7mmol L-1Tris.HCl，pH值为8.3，22mmolL-1EDTA，1.2M NaCl2；按体积百分比计，取2.5％Cetyl trimethyl ammoniumbromide，2.5％SDS。
所述试剂的使用具体操作如下1.紫菜丝状体DNA的提取紫菜丝状体及硅胶及液氮研磨，研磨的粉末转移到50mL离心管，通过含有15mL所述试剂溶解液，35℃保温70min，将细胞充分裂解。用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.25倍于上清液体积的10％SDS水溶液和0.3倍于上清液体积的4.5M KAc水溶液，置于冰中15分钟，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，上清加入0.8倍于上清液体积的异丙醇水溶液，冰中50分钟，12000rmp离心13分钟；离心后试管里的沉淀物用70％乙醇洗3次，抽干乙醇，用1.2mL Tris.EDTA缓冲液(10mM Tris HCl，pH8.2，1mM EDTA，pH8.5)溶解沉淀；加2μl无DNA酶的RNA酶12mg，在35℃情况下保温1.3小时，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提3次，加0.3倍于上清液体积的醋酸钠水溶液(pH5.4)，2.5倍于上清液体积的无水乙醇，-22℃沉淀2小时以上，12000rmp离心20分钟；用80％乙醇洗一次，抽干乙醇，用200μl 1倍于上清液体积的Tris.EDTA溶解沉淀，取4μl DNA样品在0.9％的Agarose胶电泳，EtBr染色，与标准Lamda DNA对照，估算DNA浓度。
2.用提纯DNA试剂Glassmilk纯化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，与500μl溶胶液、12μl Glassmilk混匀，冰上放置20分钟，中间轻摇3次；1000rpm离心50秒，去上清液，其沉淀用500μl漂洗液漂洗3次，吹干；800ul的H2O漂洗，或于70℃温度下保温10分钟，12000rpm离心3分钟，上清液保存备用。
3.RAPD反应10μl反应体积中含有60mM Tris HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，0.4mM DATP、0.4mM DCTP、0.4mM DTTP和0.4mM DGTP，0.9％Ficoll400，3mM Tartarzine，6μm BSA，50ng引物ISSR30，10ng模板DNA，0.7单位Taq DNA聚合酶。
多聚循环反应(PCR)参数条件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，5个循环；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，45个循环；72℃保温5分钟。
PCR反应后，产物在1.5％Agarose胶上进行电泳分离，EtBr染色，紫外照相记录结果。
4.ISSR反应15mM Tris HCl(pH8.4)、5mM MgCl2、0.6mM DATP、0.6mM DCTP、0.6mM DTTP和0.6mM DGTP，0.9％Ficoll400，2mM Tartarzine，6μm BSA，40ng引物ISSR25，5ng模板DNA，0.8单位Taq DNA聚合酶。
反应参数条件96℃ 1分钟；94℃ 30秒，退火温度48℃+4℃ 10秒，72℃ 60秒，3个循环；94℃ 30秒，退火温度48℃+2℃ 10秒，72℃ 60秒，3个循环；94℃ 2秒，退火温度48℃ 10秒，72℃ 70秒，40个循环；75℃保温5分钟。
扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其电泳结果处理与RAPD相同。
权利要求
1.一种紫菜种质鉴定试剂，其特征在于按浓度计，由三羟甲基氨基甲烷盐酸7～15mM，乙二胺四乙酸18～22mM，氯化钠1.2～1.4M；按体积百分计算，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化铵，1～2％十二烷基硫酸钠。
2.按照权利要求1所述紫菜种质鉴定试剂，其特征在于所述三羟甲基胺基甲烷盐酸pH值为8.0～8.3。
3.一种按照权利要求1所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于按如下步骤操作a.紫菜丝状体脱氧核糖核酸的提取，紫菜丝状体研磨，离心，用所述试剂溶解液，在35～70分钟时间范围内裂解；用氯仿∶异戊醇抽提，上清液加入0.20～0.25倍于上清液体积的10％十二烷基硫酸钠水溶液和上清液体积的3.5～4.5M乙酸钾水溶液，置于冰中10～15分钟，用氯仿∶异戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液体积的异丙醇水溶液，冰中置30～50分钟，离心10～15分钟；离心后试管里的沉淀物用70％乙醇洗1～3次，抽干，用0.8～1.2mL三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液溶解沉淀；加核糖核酸酶10～13mg/ml，35～38℃保温1～1.5小时，用等体积的氯仿∶异戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍于上清液体积的醋酸钠水溶液，1.5～2.5倍于上清液体积的无水乙醇，-18～-22℃沉淀，离心10～20分钟；用70～80％乙醇洗，抽干，用1～2倍于上清液体积的三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液溶解沉淀，取2～4μl脱氧核糖核酸样品在0.7～0.9％的琼脂糖胶电泳，溴化乙锭染色，与标准Lamda脱氧核糖核酸对照，估算脱氧核糖核酸浓度。b.所述紫菜丝状体脱氧核糖核酸的纯化脱氧核糖核酸粗提物，与300～500μl溶胶液、8～12μl玻璃奶混匀，冰上放置10～20分钟，中间轻摇2～3次；离心30～50秒，去掉上清液，其沉淀用300～500μl漂洗液漂洗，吹干；用500～1000μl H2O或1～3倍于上清液体积的500～1000μl三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液在50～70℃范围内保温5～10分钟，离心1～3分钟，上清液保存备用。c.随机扩增多态脱氧核糖核酸反应10μl反应体积中含有50～60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，2～5mM氯化镁，0.2～0.5mM二磷酸多苷，0.8～1％富可400，1～3mM酒石磺，4～6μm牛肉血压清蛋白，30～50ng引物，5～10ng模板脱氧核糖核酸，0.5～0.7单位Taq聚合酶。多聚循环反应参数条件94℃ 60秒，38℃ 10秒，72℃ 20秒，2～5个循环；94℃ 2秒，38℃ 10秒，72℃ 70秒，38～45个循环；70～75℃保温4～6分钟。多聚循环反应反应后，产物直接在1.5％琼脂糖胶上进行电泳分离，澳化乙锭染色，紫外照相记录结果。d.间隔简单重复序列反应10～15mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，2～6mM氯化镁，0.2～0.6mM二磷酸多苷，0.8～1％富可400，1～3mM洒石磺，4～6μm牛肉血压清蛋白，30～60ng引物，5～10ng模板脱氧核糖核酸，0.6～0.8单位Taq聚合酶。间隔简单重复序列反应参数条件96℃ 1分钟；94℃ 30秒，退火温度+4℃10秒，72℃ 60秒，2～4个循环；94℃ 30秒，退火温度+2℃10秒，72℃ 60秒，2～5个循环；94℃ 2秒，退火温度℃10秒，72℃ 70秒，36～45个循环；70～75℃保温4～6分钟。扩增产物用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其电泳结果处理与多聚循环反应相同。
4.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于所述氯仿∶异戊醇比例为24∶1。
5.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于步骤a中所述醋酸钠pH值在5.0～5.4范围内。
6.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于所述三羟甲基氨基甲烷盐酸pH值在8.0～8.5范围内。
7.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于所述二磷酸多苷为二磷酸腺苷、二磷酸胞苷、二磷酸胸苷和二磷酸鸟苷。
8.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于优化反应条件所述引物为ISSR25、ISSR28或ISSR30。
9.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于所述退火温度根据不同的引物在46℃到50℃之间。
10.按照权利要求3所述紫菜种质鉴定试剂的使用方法，其特征在于所述乙二胺四乙酸pH值在8.0～8.5范围内。
全文摘要
一种紫菜种质鉴定试剂及使用方法。按浓度计,由三羟甲基氨基甲烷盐酸7～15mM,乙二胺四乙酸18～22mM,氯化钠1.2～1.4M;按体积百分计算,取1.5～2.5%十六烷基三甲基溴化铵,1～2%十二烷基硫酸钠;其使用方法是通过紫菜丝状体DNA的提取,及玻璃奶技术路线纯化DNA,得高纯度紫菜DNA;PCR扩增、RAPD检测,得初级鉴定图谱;使用通用引物和ISSR鉴定技术,可以得到紫菜不同细胞系间清晰和可重复的多态图谱。纯化后扩增产物的反应重复性高,区分不同细胞系的差异,可有效有鉴定紫菜种质。
文档编号C12Q1/68GK1366068SQ01106080
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月16日 优先权日2001年1月16日
发明者段德麟, 赫英俊, 李笑红, 连绍兴, 于义德 申请人:中国科学院海洋研究所