一种筛选病毒毒种的方法

一种筛选病毒毒种的方法
【专利摘要】本发明提供了一种筛选用于制备疫苗的病毒毒种的方法，包括：(a)提供一培养细胞；(b)将待筛选的病毒毒种与所述培养细胞相接触一定时间；(c)对在步骤(b)中接触过所述待筛选的病毒毒种的培养细胞，通过蚀斑克隆法分离出不同的病毒克隆，筛选出适于制备疫苗的第一轮病毒毒种，该方法还包括：(d)用在步骤(c)中收获的第一轮病毒毒种，重复步骤(a)-(c)，筛选出适于制备疫苗的第二轮病毒毒种，(e)用在步骤(d)中收获的第二轮病毒毒种系列稀释，获得一系列病毒浓度递减的稀释物，(f)将步骤(e)中的每一份稀释物与培养细胞相接触一定时间，(g)取步骤(f)中最高倍稀释物的病变病毒克隆，继续培养，筛选出适于制备疫苗的第三轮病毒毒种。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明的领域涉及一种筛选病毒毒种的方法，尤其涉及一种筛选优势毒种，提高 细胞培养的病毒滴度及免疫原性的方法。 一种筛选病毒毒种的方法

【背景技术】
[0002] 病毒收获液的病毒滴度，是病毒性疫苗产品的一项关键质量指标。以人用Vero狂 犬病疫苗为例，《中国药典三部（2010版）》规定，狂犬病毒收获液的病毒滴度> 6. 0LgLD50/ ml方可用于疫苗生产，通常仍需要将其超滤浓缩10?20倍以上才能用于制备成品疫苗。 超滤浓缩步骤不仅需要投入大量人力物力，增加成本，而且，有可能使浓缩后的成品苗的宿 主蛋白残留物、DNA残留物以及牛血清残留物含量超标，影响疫苗质量。WHO建议狂犬病疫 苗的生产企业，当病毒滴度达到7. 5LgLD50/ml时，可以不必浓缩。因此高滴度的病毒收获 液对于疫苗的质量和产量至关重要。
[0003] 采用高毒力、高效力的优势毒种是获得高滴度病毒收获液的关键。然而，病毒性 疫苗生产中，疫苗毒株的毒力和效力下降，是比较普遍的现象。疫苗毒株毒力和效力下降 会导致疫苗生产过程中浓缩倍数的进一步提高，从而致使疫苗制作过程中成本提高、残余 物质含量提高，导致生产出高质量的病毒性疫苗变的更加困难。造成这一现象的原因并 不完全清楚，一种可能的解释是，疫苗毒株在多次传代过程中，会产生缺损干扰病毒颗粒 (Defective Interfering Particles),简称DI颗粒。通常认为，DI颗粒含有正常的病毒 结构蛋白，但其内部包裹的核酸基因组有缺损。当病毒毒株中含有一定数量的DI颗粒时， DI颗粒会干扰正常病毒颗粒（又称为标准病毒颗粒、亲代病毒颗粒）在宿主体内的增值， 造成病毒毒株毒力和效力的下降。尽管某些病毒种类，例如脊髓灰质炎病、水泡性口膜炎病 毒及流感病毒的DI颗粒有较多的研究，但关于狂犬病毒DI颗粒的研究仍然不充分。而且， 疫苗毒株的毒力和效力下降，也可能包括其他的未知原因。
[0004] 因此，本领域迫切需要对毒力、效力下降的病毒毒株进行筛选，获得高毒力、高效 力的优势毒株。


【发明内容】

[0005] 本发明针对毒力、效力较低的病毒毒株，利用蚀斑克隆及有限稀释2种方法通过3 次筛选获得了高滴度、高免疫原性的病毒。本发明可用于实验室新病毒的分离和筛选，也可 用于生产用毒株的优化。
[0006] 本发明提供了一种筛选用于制备疫苗的病毒毒种的方法，包括：
[0007] (a)提供一培养细胞；
[0008] (b)将待筛选的病毒毒种与所述培养细胞相接触一定时间；
[0009] (c)对在步骤（b)中接触过所述待筛选的病毒毒种的培养细胞，通过蚀斑克隆法 分离出不同的病毒克隆，筛选出适于制备疫苗的第一轮病毒毒种，该方法还包括：
[0010] ⑷用在步骤（c)中收获的第一轮病毒毒种，重复步骤（a)?（c)，筛选出适于制 备疫苗的第二轮病毒毒种，
[0011] (e)用在步骤（d)中收获的第二轮病毒毒种系列稀释，获得一系列病毒浓度递减 的稀释物，
[0012] (f)将步骤（e)中的每一份稀释物与培养细胞相接触一定时间，
[0013] (g)取步骤（f)中最高倍稀释物的病变病毒克隆，继续培养，筛选出适于制备疫苗 的第三轮病毒毒种。
[0014] 其中，该培养细胞为任何允许病毒生长的宿主细胞，具体可为任何哺乳动物细胞。 通常，该宿主细胞适合排除外源因子，具有可根据WHO对疫苗生产的要求确认的传代数。很 多细胞系可用于分离和繁殖病毒。已使用的一些细胞系包括传代细胞和二倍体细胞：MDCK 细胞系、MDBK细胞系、vero细胞系、BHK-21细胞系、CEF细胞系、Marc-145细胞系、PER-C6 细胞系、或FRhk-4细胞系。
[0015] 其中，用于本发明方法的病毒来源可从感染的动物或患者分离得到；也可从适当 的组织（如，ATCC)购买得到；或从科研实验室得到。具体的病毒毒种可为狂犬病毒、乙脑病 毒、流感病毒、甲肝病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒，呼吸道合胞病毒，细小病毒，诺如病毒， 人乳头瘤病毒，鼻病毒，黄热病毒，登革热病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，风疹病毒，水 痘-带状疱疹病毒，肠道病毒埃博拉病毒，或牛性腹泻病毒。
[0016] 其中，本发明的方法特别适用于狂犬病毒CTN-1V株和其敏感细胞vero细胞系。
[0017] 其中，步骤（b)中的一定时间为1?2小时。
[0018] 其中，步骤（c)中的筛选出的克隆，在单层细胞上可见明显的蚀斑形成，斑呈圆 型，蚀斑大小不同，但边缘清晰，相互之间不融合，适于制备疫苗的第一轮病毒毒种，通过毒 力检测及效力检测，筛选出毒力高于6. 5LgFFU/ml，效力高于1. 5IU/ml的病毒毒种。
[0019] 其中，步骤（d)中的筛选出的克隆，在单层细胞上可见明显的蚀斑形成，斑呈圆 型，蚀斑形状大小基本一致，且边缘清晰，相互之间不融合，适于制备疫苗的第二轮病毒毒 种，通过毒力及效力检测，筛选出毒力高于7. OLgFFU/ml，效力高于1. 8IU/ml的病毒毒种。
[0020] 其中，步骤（e)中的所述的系列稀释为ΚΓ5?ΚΓ7稀释。
[0021] 其中，步骤（f)中的一定时间为7?9天。
[0022] 其中，所述步骤（f)中所述的筛选出适于制备疫苗的第三轮病毒毒种，是指通过 毒力及效力检测，筛选出毒力高于7. 5LgFFU/ml，效力高于1. 8IU/ml的病毒毒种。
[0023] 其中，前述步骤（c)，（d)，（f)毒力及效力检测通过直接免疫荧光试验（FAT法）和 改良抗体结合试验（M-ABT法）实行。
[0024] 本发明有以下特点：
[0025] 1、本发明通过将两种常见的筛选方式相结合，二者结合能够优势互补，筛选出较 为理想的、均一的优势克隆株。首先采用空斑克隆筛选，能够观察到不同形态的空斑以及 CPE发生时间和空间上的差异，在蚀斑克隆培养阶段容易观察到克隆感染能力的强弱和速 度，进一步对克隆进行毒力和效力检测后可以挑选出优势克隆。本发明在采用琼脂糖蚀斑 克隆法后，继续采用了有限稀释法对克隆进行了进一步的筛选，选择最高稀释度进行培养 可进一步保证病毒克隆的纯度和单一。其后采用有限稀释法，将稀释后的病毒接种至多孔 板，通过显微镜下对细胞的直接观察也可以迅速看到该毒株在不同孔细胞的病变情况，主 要包括病变产生的时间、病变的强度和进展；通过多个平行孔的观察，也能从侧面反映出毒 株群体的均一度。两种常规方法的组合而成的筛选方法，操作简单、难度小、成功率高，可利 用简便的操作技术解决疫苗研发过程中的难点问题。
[0026] 2、本发明特别是适用于狂犬病毒毒株的筛选，提供了每轮筛选的试验参数和筛选 指标。
[0027] 3、本发明通过将两种常见的筛选方式相结合，起到了出乎预料的技术效果，所取 得的病毒毒株的毒力产生了显著增强，且病毒的免疫原性也有明显提高。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1所示，为本发明狂犬病毒株三轮筛选示意图。
[0029] 图2a_c所示，为通过第一轮蚀斑克隆法所获得的三种不同病变克隆在光学显微 镜下放大1〇〇倍的典型形态照片，分别记为IPUIIP1和IIIP1，而附图2d则为空白细胞放 大1〇〇倍的典型形态照片；
[0030] 图3a-C所示，分别为IP1、IIP1和IIIP1经过毒力及效力筛选后，所获得的三 种不同病变克隆在光学显微镜下放大100倍的典型形态照片，分别记为IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3,而附图3d则为空白细胞放大100倍的典型形态照片；
[0031] 图4a_c所示，分别为1?1?3、11?1?3、111?1?3，二次克隆后优选高毒力高效力的克 隆连续在vero细胞上传代3代之后的克隆，在光学显微镜下放大100倍的典型形态照片， 而附图4d则为空白细胞放大100倍的典型形态照片。

【具体实施方式】
[0032] 以下通过实施例进一步说明本发明的内容，但本发明并不局限于实施例。本领域 技术人员也可以根据需要选择其它的病毒毒株和敏感细胞，选择适宜的病毒毒力和效力测 定方法实施本发明。
[0033] 病毒株与细胞株
[0034] 本发明实施例采用的病毒株为狂犬病毒CTN-1V株，由中国药品生物制品检定所 提供，其基因序列参见Genebank序列fj959397。采用的细胞为Vero细胞（非洲绿猴肾细 胞），来源于美国ATCC，由中国药品生物制品检定所提供。
[0035] 筛选方法
[0036] 本发明通过将常见的蚀斑克隆法、有限稀释法进行特定的组合，用于筛选优势病 毒株。本发明实施例优选的筛选方法包括2次蚀斑克隆法筛选、1次有限稀释法筛选，本发 明实施例的筛选过程参见图1。
[0037] 蚀斑形态观察：本发明的发明人发现，筛选前的病毒株在进行蚀斑试验时可产生 形态不同的蚀斑。本发明将蚀斑分为三类，其形态特征描述如下：
[0038] I型：其形态特征是：斑呈圆型，蚀斑相对比较大，肉眼可见，边缘整齐清晰，蚀斑 相互独立不融合，出斑时间较早；该型蚀斑对应的病毒克隆称为IP1，经扩增三代后检测， 其毒力和效力较高。
[0039] II型：其形态特征是：蚀斑形态小，边缘较清晰，出斑时间较迟；该型蚀斑对应的 病毒克隆称为IIP1，经扩增三代后其毒力和效力较低。
[0040] III型：其形态特征是：蚀斑形态较小，边缘模糊，出斑时间迟；该型蚀斑对应的病 毒克隆称为ΠΙΡ1，经扩增三代后其毒力和效力较低。
[0041] 经第一轮筛选后，挑选毒力和效力较高的I型蚀斑的克隆进行第二轮蚀斑筛选， 蚀斑形态趋于均一。
[0042] CPE观察：又称为致细胞病变效应（CPE)，指病毒感染敏感细胞后，引起敏感细胞 形态及代谢变化，这些效应包括但不限于：细胞变圆，脱落，退化，凋亡，活性氧物质（R0S) 诱导等。本发明着重观察病毒感染后敏感细胞后出现典型病变效应的时间，作为衡量病毒 样品毒力和效力的先彳丁指标。
[0043] 检测方法
[0044] 毒力测定：本发明实施例采用两种毒力测定方法，小鼠滴定法和细胞法（FAT法）。
[0045] 小鼠滴定法：将病毒样品在冰浴中用含2%牛血清的PBS作10倍系列稀释，颅内 注射小鼠0. 03ml/只，每个稀释度4只，逐日观察并于第4天后记录小鼠发病及死亡数至第 14天，Reed和Muench法计算每批病毒的LD50值，单位以LgLD50/ml表示，具体参见《中国 药典三部》2010版，111-113。
[0046] 细胞法（直接免疫荧光试验法，FAT法）：在96孔微量培养板中3倍系列稀释病毒 样品，即100ul培养液中加50ul样品，之后加入BSR单细胞悬液，细胞浓度为5X10 5/孔，同 时设2孔细胞对照，混匀后置37°C，5% C02孵箱中培养24h。弃培养液，PBS洗板孔1次，晾 干后加入80%冷丙酮固定-，2〇1：，1〇1^11后，弃丙酮，待挥发干燥后，加入工作浓度的？11^ 标记的狂犬病毒NP荧光抗体50ul/孔，37°C孵育60min，PBS洗板孔3次，于荧光显微镜下 观察结果并计数每孔中荧光灶数，取〈20个荧光灶的两个稀释度的数据进行计算，单位用 FFU/ml表示。具体方法参见《中国生物制品杂志》，2006, Voll9(l) : 87-88。
[0047] 效力测定：本发明实施例采用两种效力测定方法，分别是NIH法和M-ABT法。NIH 效力测定方法参见《中国药典三部》，2010版，附录80-81。M-ABT法效力测定方法参见《国 际检验医学杂志》，2011年，第9期，第923-924页，单位以IU/ml表示。
[0048] 免疫原性测定：将待测病毒经BPL灭活后免疫动物（免疫2次，间隔7天），检测 中和抗体水平，单位以Π /ml表示。具体按《中国药典三部》，2010版，111页。
[0049] 以下实施例采用的方法如无特殊说明，均为常规方法，按照《中国药典》（三部）中 "冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）"中的相关要求进行。以下实施例中所用的实验材料或 生物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均 设置三次重复实验，结果取平均值。
[0050] 实施例1.获得利于组织培养的待筛选病毒
[0051] 取冻存的狂犬病毒CTN-1V株按0. 1M0I接种于T25细胞瓶，37°C吸附1小时后弃 毒，加入维持液（DMEM+1%牛血清），34. 5°C、5% C02的培养箱培养，8-10天后病变（++- +++)时收获，记为CTN-1V-F1。将CTN-1V-F1在vero细胞上连续传3代，从而获得利于组 织培养的待筛选病毒，记为CTN-1V-F4(F4)，并用FAT法和M-ABT法检测毒力效力（毒力 7. OLgFFU/ml，效力 1. 8IU/ml)，分装 1. 5ml 离心管备用。
[0052] 实施例2.通过蚀斑克隆法筛选待筛选病毒狂犬病毒CTN-1V株
[0053] 2. 1第1轮克隆：
[0054] 将实施例1中收获的狂犬病毒F4收获液稀释至1(Γ4-1(Γ6,每个稀释度以4ml vero(2-3X10 5)细胞和0. 4ml稀释病毒混种于6孔板，每个稀释度接种2孔，同时以4ml vero (2-3X105)细胞和0. 4ml稀释液混种6孔板作为细胞对照，2孔，37°C培养24小时。
[0055] 吸取上清弃去，每孔加2. 5mll %的营养琼脂糖，34. 5°C培养3天。
[0056] 每孔补加含有0· 1M Η印es的1%的营养琼脂糖lml，34. 5°C培养3天，显微镜下 观察蚀斑，依据蚀斑大小分别挑出蚀斑接种至24孔板，同时加入lml细胞混种34. 5°C培养。
[0057] 如附图2a_c所示，为通过蚀斑克隆法所获得的三种不同病变克隆在光学显微镜 下放大100倍的典型形态照片，分别记为IPUIIP1和IIIP1，而附图2d则为空白细胞放大 100倍的典型形态照片。
[0058] 在IP1、IIP1和IIIP1中，选取不同克隆在细胞上连续传3代后收获，并通过一段 时间的培养，以空白细胞作为参照，观察其CPE (致细胞病变效应）以及通过FAT法和M-ABT 法进行毒力和效力检测（表1)，选取可作为后续筛选的理想病毒毒株，记为IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3。附图3a-c所示，分别为IP1F3、IIP1F3、IIIP1F3在光学显微镜下放大100倍的典 型形态照片，而附图3d则为空白细胞放大100倍的典型形态照片。表1为IP1F3、IIP1F3、 IIIP1F3的毒力和效力检测数据。
[0059] 表1. IP1F3、IIP1F3、IIIP1F3的毒力和效力检测数据
[0060]

【权利要求】
1. 一种筛选用于制备疫苗的病毒毒种的方法，包括： (a) 提供一培养细胞； (b) 将待筛选的病毒毒种与所述培养细胞相接触一定时间； (c) 对在步骤（b)中接触过所述待筛选的病毒毒种的培养细胞，通过蚀斑克隆法分离 出不同的病毒克隆，筛选出适于制备疫苗的第一轮病毒毒种，该方法还包括： (d) 用在步骤（c)中收获的第一轮病毒毒种，重复所述步骤（a)?（c)，筛选出适于制 备疫苗的第二轮病毒毒种， (e) 用在步骤（d)中收获的第二轮病毒毒种系列稀释，获得一系列病毒浓度递减的稀 释物， (f) 将步骤（e)中的每一份所述稀释物与所述培养细胞相接触一定时间， (g) 取步骤（f)中最高倍稀释物的病变病毒克隆，继续培养，筛选出适于制备疫苗的第 三轮病毒毒种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养细胞为哺乳动物细胞。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为MDCK细胞系、MDBK细 胞系、vero细胞系、BHK-21细胞系、CEF细胞系、Marc-145细胞系、PER-C6细胞系、或FRhk-4 细胞系。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒毒种为狂犬病毒、乙脑病毒、流感 病毒、甲肝病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒，呼吸道合胞病毒，细小病毒，诺如病毒，人乳头瘤 病毒，鼻病毒，黄热病毒，登革热病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，风疹病毒，水痘-带状 疱疹病毒，肠道病毒埃博拉病毒，或牛性腹泻病毒。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞为vero细胞系，所述的病毒毒株 为狂犬病毒毒株。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（b)中的一定时间为1?2小时。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（c)中的所述的筛选出适于制备疫 苗的第一轮病毒毒种，是指通过毒力及效力检测，筛选出毒力高于6. 5LgFFU/ml，效力高于 1. 5IU/ml的病毒毒种。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（d)中的所述的筛选出适于制备疫 苗的第二轮病毒毒种，是指通过毒力及效力检测，筛选出毒力高于7. OLgFFU/ml，效力高于 1. 8IU/ml的病毒毒种。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（e)中的所述的系列稀释为ΚΓ5? 10_7稀释。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（f)中的一定时间为7?9天。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤（f)中所述的筛选出适于制备疫 苗的第三轮病毒毒种，是指通过毒力及效力检测，筛选出毒力高于7. 5LgFFU/ml，效力高于 1. 8IU/ml的病毒毒种。
12. 如权利要求7, 8, 11所述的方法，其特征在于，所述毒力及效力检测通过直接免疫 荧光试验和改良抗体结合试验实行。
【文档编号】C12N7/00GK104109654SQ201410341791
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】李薇, 李建强, 陈军 申请人:兰州生物制品研究所有限责任公司