快速检测花生抗旱性的方法及所使用的探针的制作方法
【专利摘要】本发明首先公开一种花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针，所述探针的5’端到3’端的脱氧核苷酸序列为如SEQ?ID?No.1所示。然后公开一种快速检测花生抗旱性的方法，其中，采用如前所述的花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针检测花生的组织中的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量，根据所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量的高低，判定被检测的花生品种的抗旱性的强弱情况。操作简便，耗时短，结果简单明了，使用的探针更为灵敏，稳定性和重复性也更高，结果更为可信。
【专利说明】快速检测花生抗旱性的方法及所使用的探针
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗旱性检测方法，尤其涉及一种快速检测抗旱性的方法及所使用 的探针，特别涉及对花生品种的抗旱性检测。
【背景技术】
[0002] 花生是一种重要的油料作物，在我国山东、湖南、广东各地均普遍种植。干旱是影 响花生产量的最主要因素之一，所以如何快速准确的分辨不同花生品种抗旱性的强弱，对 于筛选优良品种，提高花生产量具有重要意义。
[0003] 传统鉴定花生抗旱性的方法主要是通过多种抗旱生理指标，如脱落酸（ΑΒΑ)含 量、游离脯氨酸含量、叶片含水量、干旱情况下叶片萎蔫指数等，运用隶属函数法，综合考虑 诸多生理指标情况，进行综合排名，以确定不同品种花生抗旱性的差异，但传统方法鉴定花 生抗旱性所需材料较多、耗时久、操作繁琐，重复性差、结果难以量化。
[0004] ΑΒΑ作为植物干旱胁迫下的应答激素，干旱胁迫下，可以通过调节相关抗旱基因表 达，激活植物应对干旱系统，抵御干旱胁迫，其合成酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED)在合成过程中起关键作用。花生中的NCED基因命名为AhNCEDl。早期研究发现，不 同花生品种的抗旱性与其体内ΑΒΑ水平呈正相关，即在水分胁迫下抗旱性强的花生品种累 积的水平高于不抗旱品种；AhNCEDl的基因及其蛋白在正常生长条件与干旱胁迫下的表达 水平与花生体内的ΑΒΑ含量呈现正相关性，直接影响不同花生抗旱性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是，根据上述花生体内ΑΒΑ含量与AhNCEDl基因和蛋白表达的正相 关性，针对传统鉴定花生抗旱性方法的缺点，设计了一种基于分子生物学的鉴定花生抗旱 性方法。
[0006] 为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 首先，设计一种花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（AhNCEDl基因）的探针， 所述探针的5'端到3'端的脱氧核苷酸序列为：ATGTCCCCGGAATCTCCATCCTCTCTGT。
[0008] 然后，设计一种快速检测花生抗旱性的方法，其中，采用如前所述的花生9-顺 式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针检测花生的组织中的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加 氧酶的基因的相对表达量，根据所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达 量的高低，判定被检测的花生品种的抗旱性的强弱情况。
[0009] 关于检测材料：所述花生组织是花生叶片。具体地，所述花生叶片为花生四叶期幼 苗的叶片。
[0010] 检测材料需要进行前期处理：所述花生叶片在对花生植株进行干旱胁迫处理后进 行9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量检测。所述干旱胁迫处理时间 为2小时。所述花生植株用20%的平均分子量为6000的聚乙二醇（PEG-6000)进行干旱胁 迫处理。
[0011] 基因表达的检测：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达 量的检测方法为实时定量荧光聚合酶链式反应（Real Time PCR)。
[0012] 具体地，所述实时定量荧光聚合酶链式反应的反应体系包括目的基因的探针和引 物对，以及内参基因的探针和引物对；
[0013] 所述目的基因为所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因，其引物对 的5'端到3'端的脱氧核苷酸序列分别为，上游：TTACCTGTGGGATTGTTTGC，下游： ACATGAGCCTCTACTTCTGC ；
[0014] 所述内参基因为18S，其引物对的5'端到3'端的脱氧核苷酸序列分别为，上游： TACGTCCCTGCCCTTTGTAC，下游：CCTACGGAAACCTTGTTACGAC ;所述 18S 的探针的 5' 端到 3' 端 的脱氧核苷酸序列为：ACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAA。
[0015] 更进一步地，所述实时定量荧光聚合酶链式反应的反应条件为：首先在95°C下保 温30秒；然后在如下条件循环40次：95°C保温5秒，降温至60°C保温34秒。
[0016] 关于相对表达量的统计方法：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因 的相对表达量采用2^ 法进行统计。
[0017] 基于上述的基因表达的检测方法和数据统计方法，判定被检测的花生品种的抗旱 性的标准为：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量大于500的 定义为强抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量 为50?500的定义为中等抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的 基因的相对表达量小于50的定义为弱抗旱花生品种。
[0018] 进一步地，所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量越 高，指示被检测的花生品种的抗旱性越强。
[0019] 与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
[0020] (1)本发明所取用的花生组织为四叶期的花生幼苗的叶片，只需要将花生种子在 光照培养箱的条件下培养10天左右即可获得，使得本发明所提供的检测方法在花生幼苗 期即可确定被检测品种的抗旱性强弱；
[0021] (2)本发明对花生植株只需要用20%的PEG-6000浸泡根部2小时，即可有效模拟 干旱胁迫，操作简便，耗时短；
[0022] (3)本发明采用Real Time PCR对花生的抗旱性进行检测，与传统方法相比，使用 的花生材料少，取材简单，通常仅需80-100mg花生叶片即可；
[0023] (4)本发明利用AhNCEDl基因相对表达量的结果，只需对比干旱胁迫处理前后花 生叶片AhNCEDl基因相对表达量的变化倍数，即可确定其抗旱性强弱，相对于传统的繁琐 的计算统计，结果简单明了，也可量化；
[0024] (5)本发明对于AhNCEDl基因表达检测采用TaqMan探针法，与一般的SYBR法（染 料法）相比，探针法更为灵敏，稳定性和重复性也更高，结果更为可信，储存稳定，更可以用 于研发通用的试剂盒产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为本发明快速检测花生抗旱性的技术流程图。
[0026] 图2干旱胁迫不同时间下各产地不同花生品种叶片AhNCEDl的表达变化。
[0027] 图3干旱胁迫下不同产地花生品种叶片含水量的变化。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0029] 实施例
[0030] 一、目的基因和内参基因的引物和探针的设计
[0031] 根据 AhNCEDl 的 cDNA 序列，利用 Primer Premier5. 0 软件进行 Real Time PCR 引 物设计（表1)。引物合成由公司完成。
[0032] 表1花生内参基因和目的基因对应引物
[0033]
【权利要求】
1. 一种花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针，其特征在于，所述探针的5'端 到3'端的脱氧核苷酸序列为：ATGTCCCCGGAATCTCCATCCTCTCTGT。
2. -种快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的花生9-顺 式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针检测花生的组织中的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加 氧酶的基因的相对表达量，根据所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达 量的高低，判定被检测的花生品种的抗旱性的强弱情况。
3. 如权利要求2所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生组织是花 生叶片。
4. 如权利要求3所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生叶片为花 生四叶期幼苗的叶片。
5. 如权利要求4所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生叶片在对 花生植株进行干旱胁迫处理后进行9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达 量检测。
6. 如权利要求5所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述干旱胁迫处理 时间为2小时。
7. 如权利要求5所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生植株用 20 %的平均分子量为6000的聚乙二醇进行干旱胁迫处理。
8. 如权利要求2所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生9-顺 式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量的检测方法为实时定量荧光聚合酶链 式反应。
9. 如权利要求8所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于，所述实时定量荧光 聚合酶链式反应的反应体系包括目的基因的探针和引物对，以及内参基因的探针和引物 对； 所述目的基因为所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因，其引物对 的5'端到3'端的脱氧核苷酸序列分别为，上游：TTACCTGTGGGATTGTTTGC，下游： ACATGAGCCTCTACTTCTGC ； 所述内参基因为18S，其引物对的5'端到3'端的脱氧核苷酸序列分别为，上游： TACGTCCCTGCCCTTTGTAC，下游：CCTACGGAAACCTTGTTACGAC ;所述 18S 的探针的 5' 端到 3' 端 的脱氧核苷酸序列为：ACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAA。
10. 如权利要求9所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于，所述实时定量荧光 聚合酶链式反应的反应条件为：首先在95°C下保温30秒；然后在如下条件循环40次：95°C 保温5秒，降温至60 C保温34秒。
11. 如权利要求8所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生9-顺 式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量采用法进行统计。
12. 如权利要求11所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于，判定被检测的花 生品种的抗旱性的标准为：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达 量大于500的定义为强抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因 的相对表达量为50?500的定义为中等抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜 素双加氧酶的基因的相对表达量小于50的定义为弱抗旱花生品种。
13.如权利要求2或12所述的快速检测花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生 9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量越高，指示被检测的花生品种的抗 旱性越强。
【文档编号】C12Q1/68GK104087675SQ201410341788
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】刘帅, 李玲, 李丽梅, 李晓云 申请人:华南师范大学