水稻rdb1抗旱基因的制作方法

专利名称：：水稻rdb1抗旱基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种用于基因工程
技术领域：
的基因蛋白编码序列。更具体的为涉及一种水稻抗旱基因。
背景技术：
：植物在生长过程中会遭遇到各种各样的自然环境，其中有些自然灾害常造成农作物大量减产，如干旱、滞涝和病虫害等。培育抗逆性作物品种是农业科学技术研究的重要目标之一。当前一个重要的育种手段是将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。为抵抗不良的外界环境的胁迫，植物体细胞感受外界环境的变化并将信号传递到细胞内，会诱导细胞表达各种应答基因共同来抵御不良环境对植物体的伤害。包含BURP区域的蛋白是植物中发现的一个蛋白质家族，该蛋白家族在植物发育和抗逆反应中发挥着重要作用。它是根据油菜BnBNM2、蚕豆VfUSP、拟南芥AtRD22和番茄LsPGle四个蛋白名的第一个字母来命名的。该基因在N—端有一个特异的重复结构，C一端有一个信号肽，在植物的生长、发育和抗逆反应中发挥重要作用。其中，AtRD22类基因在植物不同的逆境环境下均有明显的增强表达，是植物ABA信号传导研究中一个重要的参照基因。在对现有技术文献的分析中，虽然杂志《MolecularAndGeneralGenetics综合分子遗传学》在1993，238(1-2):17-25发表了文章"Theplanthormoneabscisicacidmediatesthedrought-inducedexpressionbutnottheseed-specificexpressionofrd22，ageneresponsivetodehydrationstressinArabidopsisthaliana(植物激素脱落酸介导的干旱诱导表达但不是种子特异表达的拟南芥基因rd22是脱水胁迫应答基因)"，对拟南芥基因范)i2在脱水和盐胁迫处理下的表达已经做了充分肯定，是脱落酸ABA诱导表达的正相关的基因。但其相关研究仍开展得不够，对其在抗逆机制中发挥的作用还无人涉及，尤其是在我国最重要的粮食作物水稻中，尚无人开展相关研究。国家育种中心有关资料表明利用转基因技术迸行水稻品种改良，只是表现出对病虫害有极强的抗性，获得明显延缓叶片衰老等，但是，还需对抗旱、抗盐等性能进行鉴定。此外，在2000年召开的以"提高水稻抗旱能力，构建节约淡水资源的水稻旱植技术体系;应用生物技术提高水稻育种效率，扩大育成品种遗传基础"为主题的国际学术会议上，专家们对应用生物技术开展水稻抗旱性研究的必要性和紧迫性、必要的技术方法和研究设施、研究现状和进展等方面作出了充分的阐述和分析。并达成如下共识(l)应加大我国水稻抗旱性研究的投资力度，提高旱稻的产量、抗性和品质.，使其达到与水稻相当的水平；(2)建立栽培稻旱植体系并大面积应用，是减少稻作灌溉用水，节约水资源，减少环境污染的关键性技术；(3)把改良我国现有旱稻品种的产量、品质和抗性水平，提高现有高产水稻品种的抗旱能力作为育种策略(4)充分运用水稻基因组研究成果和分子标记、转基因等先进技术，把抗旱性与高产、优质、抗病虫、抗除草剂等优良性状(基因)加以整合。尤其在我国，干旱、半干旱地区约占国土面积的一半以上，年受旱面积达三至四亿亩，特别是担负粮食生产任务百分之六十五以上的华北、东北和西北，恰恰是中国最缺水的地区。可见，利用基因工程技术，克隆出其中优良的抗逆基因，通过基因转化提高植物抗逆性，对提高干旱、半干旱地区的植被覆盖，增加旱地农业的产量都是非常重要的。
发明内容基于上述存在的问题，本发明的目的在于拓展当前植物生物技术中的可应用基因，本发明打破了人们常规的意识形态，也对水稻进行了深入的有关研究，出人意料的是在对水稻的相关研究中发现了与植物抗旱性有关的基因序列，从而提供了一种抗旱蛋白编码序列。该蛋白序列与植物抗旱性有关，将该蛋白基因的完整翻译区(codingsequence)与组成性表达启动子结合直接转入一般植物，将提供该植物的抗旱能力。使其所公开的与抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白密切相关的蛋白基因和抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白序列及其核酸序列，应用于转基因技术改良植物抗逆研究中，使该植物具有明显的抗旱作用，能够降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。本发明是通过以下技术方案实现的本发明所分离出的DNA分子，该分子包括编码具有抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列杂交。该编码序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。该编码序列具有SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列。所述的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白质活性的多肽，是本发明分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白质活性的多肽，它包括具有SEQIDNO.3氨基酸序列的多肽，最好，该多肽是具有SEQIDNO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、活性氧等处理下均能发挥作用，提供植物的抵抗各种不良环境的能力。所述的DNA分子，它包含在本发明所提供的一种载体，该载体是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。本发明用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。在本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。在本发明术语"抗旱稻沪旱3号的水稻RDBl抗旱基因序列"中，抗旱稻沪旱3号为申请者工作单位自己经多年的选育与抗旱性鉴定选育而成的高产旱稻新品种，可以从上海市农业生物基因中心获得。水稻RDBl抗旱基因序列指编码具有抗旱稻沪旱3号的水稻RDBl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第60-1817位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的编码框第60-1817位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.3中第60-1817位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(70-85%—致性)下，更佳的在高度严紧条件(85%以上一致性)下与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%,最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的抗旱稻沪旱3号的水稻RDBl相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-90个，较佳地1-60个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1抗旱基因序列"指具有抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白活性的SEQIDNO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关相同功能的、SEQIDNO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，"抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1保守性变异多肽"指与SEQIDNO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2Score=194bits(492)，Expect=2e-49Identities二108/240(45%),Positives=148/240(61%),Gaps=10/240(4%)Query344YKSSVLETPELLKDPDMALFFLEKNLQQGKKINNALHFANLLATTNSKFLPRGKADSIPF403Y+ET+LDP+ALFFLEK+L+GK++N+++FLPRG+A+++PFSbjct158YNYAAKET-QLHDDPNAALFFLEKDLVRGKEMNVRFNAEDGYGGKTA-FLPRGEAETVPF215Query404SSKELPEILDRFGVRPGSDDAAEMSATLQDCELPANKGEKKACATSLESIVDFVTSSFGA463S++ELRFVGS++AMT+++CEGE+KCATSLES+VDFSGSbjct216GSEKFSETLKRFSVEAGSEEAEMMKKTIEECEARKVSGEEKYCATSLESMVDFSVSKLGK275Query464SDVDAASTVVLSKAVESSSLAQDYTV—SGVRRMAGTGQLIACHPESYPYAVFMCHLTEA521VASTVK++QY++GV++++++CH+YP+AVFCHSbjct276YHVRAVSTEVAKK——NAPMQKYKIAAAGVKKLS-DDKSVVCHKQKYPFAVFYCHKAMM330Query522TTRAYKASLVGKDGTAVEAVAVCHTDTSEWNPEHAAFHVLGVKPGTVPVCHFMQPDAVVW581TTYLG++G+AVAVCH+TSWNPHAFVLVKPGTVPVCHF+VVWSbjct331TT-VYAVPLEGENGMRAKAVAVCHKNTSAWNPNHLAFKVLKVKPGTVPVCHFLPETHVVW389Score=45,8bits(107)，Expect二7e_05Identities二18/34(52%)，Positives=27/34(79%),Gaps:0/34(0%)Query17VSHMDLSPEQYWRSILPNTPMPSSISQLLNYPY50V+AADL+PE+YW+LPNTP+P+S+LL++Sbjct17VAIAADLTPERYWSTALPNTPIPNSLHNLLTFDF50Query:抗旱稻沪旱3号的水稻RDBl的氨基酸序列Sbjct:拟南芥AtRD22的氨基酸序列(ML31189)表2为本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白与拟南芥AtRD22的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似氨基酸用+表示。通过以上的比较未发现明显的相似性(〈0.05)。本发明还包括抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1多肽时，可以将抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白表达载体。如本发明所用，"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语"宿主细胞"为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、水稻细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法和实时定量RT-PCR法技术分析抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1基因产物的表达，即分析抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关的核酸分子。本发明还提供了检测样品中是否存在抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为16-45个核苷酸。此外，根据本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关同源基因或同源蛋白。为了得到与抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关基因相关的抗旱稻沪旱3号cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选抗旱稻沪旱3号cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自抗旱稻沪旱3号的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关的基因家族的核苷酸序列。本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明具有在抗渗透胁迫具有明显的作用，能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱能够造成大部分农作物如水稻、棉花、油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，此外大面积的应用各种农药也严重污染环境，因此，本发明具有很大的应用价值。具体实施方式下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明说明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例l抗旱稻来源的水稻RDB1基因的克隆1.组织分离(isolation)抗旱稻沪旱3号从上海市农业生物基因中心获得，将抗旱稻沪旱3号置于25'C发芽24小时，在温室种植于液体培养基中，待抗旱稻沪旱3号叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。2.RNA的分离(RNAisolation)先幼苗此水中取出，将根暴露在空气中1小时，模拟干旱条件，然后取叶片投入液氮中，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀桨后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents,GIBC0BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据BURP基因家族的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[RCF(SEQIDNO.1)+RCR(SEQIDNO.2)]得到PCR产物(362bp)进行回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知含BURP区域中的保守序列的同源性很高，故初步认为它是一个含BURP区域的蛋白，类似于拟南芥rd22蛋白基因。(2)3，-RACE第一轮PCR[AAP+RCF(SEQIDNO.l)]第二轮PCR[AUAP+R301(5，-CACG(G/T)C(A/C/G)(C/G)(A/G)GTGGMCCC(A/G)(A/G)AGCACG-3，)]得到R3，(420bp),回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingro叩，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知含BURP区域中的保守序列的同源性很高，故初步认为它是一个含BURP区域的蛋白，类似于拟南芥rd22蛋白基因。(3).5'-RACE第一轮PCR[MP+RCR(SEQIDNO.2)]第二轮PCR[(AUAP+R5R(5'-CGTGCTYYGGGTTCCACYSBGMCGTG-3，)]得到R5'(约1724bp)(过程同(l))将测序结果的重叠区拼接，发现得到的片段既是该基因的完整编码区。BLAST的结果证明从抗旱稻沪旱3号中新得到的基因确为一个与拟南芥RD22相关的基因。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白的全长编码序列(SEQIDNO.3)。本发明新的抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1全长cDNA的长度为2119bp，详细序列见SEQIDNO.3，其中开放读框位于60-1817位核苷酸(1755个核苷酸)。根据全长cDNA推导出抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1的氨基酸序列，共585个氨基酸残基，分子量为64563.32道尔顿，等电点(pi)为8.09。详细序列见SEQIDNO.3。实施例2抗旱稻来源的水稻RDB1在抗旱稻沪旱3号中的拷贝数分析采用常规方法从抗旱稻沪旱3号叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用EcoRI和Pstl酶切DNA[20pg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用AmershamPharmacia公司GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule(PRN3540)，我们将RDB1基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60。C杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1%SDS)中，于60。C漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1%SDS)中于60。C漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。结果(Southernblot)发现在杂交膜上每一条酶切电泳道上均只出现一条杂交带，说明抗旱稻沪旱3号基因RDB1在抗旱稻沪旱3号中是单拷贝基因。实施例3抗旱稻来源的水稻RDB1蛋白的生物信息学分析为了了解水稻RDB1蛋白所具有的蛋白保守的功能区，将其蛋白序列在专业的蛋白质家族分类网站Pfam上(http:〃www.Sanger,ac.uk/Software/Pfam/search,shtml)进行搜索，发现该蛋白序列第361-584氨基酸最值得信赖的区域为BURP区域，该区域是根据油菜BnBNM2、蚕豆VfUSP、拟南芥AtRD22和番茄LsPGie四个蛋白名的第一个字母来命名的，含该区域的蛋白是植物特有的，在植物发育和抗逆中发挥重要的作用。其Pfam-B区域编号为Pfam-B—22373。下表3和表4均为Pfam网站上提供的搜索结果和说明。表3DomainStartEndBitsEvslueAlignmentModeBURP361584348.609.le-102AlignIs表4AlignmentofBURPvsRDB1/361-584BURP和RDB1(361-584)的比对*-〉alFFlEkDLkpGktmp..myFtkkdktakrpfLpRqiadkiPFSssKalFFIEkLGk++++++F+t+fLpRad+iPFSsRDB1361ALFFLEKNLQQGKKINnaLHFANLLATTNSKFLPRGKADSIPFSSKE407IkeileeFsvkpgSseAkiikeTlkeCErpaieGEeKyCaTSLESMvDFa1+eil+F+vpgS+A++++Tl+CEpa+GEKCaTSLES+vDF+RDB1408LPEILDRFGVRPGSDDAAEMSATLQDCELPANKGEKKACATSLESIVDFV457tSklvGrnknvqatstevniekgtsk....qkYtvvkegVkklagGkddKaVtS++G++va+st+vk+++++qYtvgV+++ag+++RDB1458TSSFG-ASDVDMSTVVLSKAVESsslaQDYTV--SGVRRMAG--TGQLI502aCHrqnYPYaVFyCHkvrk.TraYvVpLegeDGtqkkvkAVAvCHtDTSaaCH+++YPYaVFCH+++++TraY++L+gDGt+v+AVAvCHtDTS+RDB1503ACHPESYPYAVFMCHLTEAtTRAYKASLVGKDGT—AVEAVAVCHTDTSE550WnPkHvAFqVLkvkPGtvPVCHFlpedhvvWvpk〈-*WnP+HAFVL+vkPGtvP簡Fd+vvW+++,1551WNPE脆FHVLGVKPGTVPVCHFMQPDA兩TRR584为了进一步了解该蛋白序列其他的一些属性，在EBI(欧洲生物信息研究所)网站(http:〃www.ebi.ac.uk/Radar/index.ht迈l)提供的蛋白序列分析工具Radar对水稻RDB1蛋白进行重复序列分析，具体的分析结果见表5。从表5可知该蛋白包从序列第25—294片段中含18个重复单元，其长度为16，其重复区占总蛋白序列长度的46°%。表5No.ofRepeatsITotalScore|Length|Diagonal|BW-From！BW-To|Level181590.65|16119123612511125-40(20.32/9.31)P.EQYWRSILPN.T.PMP.S44-58(17.41/6.86)Q1LNY..PYLPA.V.RLP.R64-79(31.48/18.75)Q.RNYKSSVSHV.A.ERS.H85-101(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H107-122(39.07/25.16)Q.RNYKSSVSPV.A.ELP.H128-144(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H150-165(26.09/14.19)Q.RNYKSSVSP.xA.EL.xHm-187(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H193-208(31.67/18.91)Q.RNYKSSVSPM.A.EL.xH214-230(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H236-251(39.07/25.16)Q.RNYKSSVSPV.A.ELP.H257-273(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H279-294(39.07/25.16)Q.RNYKSSVSPV.A.ELP.H300-316(34.90/21.63)Q.RNYKLSALPA.TnELP.H322-337(39.45/25.48)Q.RNYKSSVSPM.A.ELP.H343-358(39.61/25.61)Q.丽KLSVSPA.A.ELP.H364-379(35,96/22.53)Q.RNYKLSVLPA.T.ELV.H384—397(22.04/10.77)Q.R證SSVLET.P.EL...实施例4抗旱稻来源的水稻RDB1基因在不同激素和化学试剂处理下的表达分析1.材料准备水稻品种沪旱3号发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，分别用3种不同浓度的氯化钠(100mM,200mM，500mM)、双氧水(100mM，200mM，500mM)、水杨酸(SA)(0.5mM，2mM，5mM)、甘露醇(100mM，200mM，500mM)和甲基茉莉酸(20uM，50uM，100uM)和脱落酸(20uM，50nM，lOOixM)处理1h，然后剪取叶片和根，快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。2.无DNA的总RNA制备按上海华舜生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beck迈anCoulter，D,640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5ug，加入1uLDNAaseI(美国工nvitrogen公司)和lPL10X反应缓冲液，补足体积至10uL，常温反应30min，然后每管加入lnL2咖olL-lEDTA终止反应，最后在70。C加热10min使DNAaseI失活。3.第一链cDNA的合成将上述RNA样品各取2uL，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4yL25腿olL-1MgC12，2yL10XRT缓冲液，2nLdNTP混和液和luL0ligo(dT)15，加水补足体积到18.5iiL，在70'C加热变性10min，快速在冰上冷却。然后加0.5uLRNaseinhibitor和luLAMVRTase，在42"C水浴60min，7(TC下加热10min终止反应。1.2.3定量PCR根据基因OsRDB的序列设计特异性引物RF:5'-GCCAGCTGCTTTGCATACCT-3，，RR:5，-TGGATGMGCMCATATCACG-3，用于荧光定量PCR，根据Actin(GenBankaccessionNo.AY212324)基因的cDNA序列设计特异性引物AF:5，-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3'，AR:5，-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3，用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国ABIPRISM7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含SYBRPremixExTaq(2X)10uL，正反向引物各0.5uL，各种处理的cDNA模板lixL，加水补足体积至25uL。反应程序为95°C30s，然后在95°C10s，60°C35s下循环40次，设定在每个循环中60°C35s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取liiLRNA作为模板进行PCR，方法同上。1.2.4分析方法Ct是通过7000systemSDSVersionl.2.3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0.2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2—"CT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。1.2.5分析结果低浓度的氯化钠和甘露醇(lOOmM)处理l小时后没有明显诱导该基因的表达，但中等浓度能明显诱导其根和叶中该基因的表达，ABA浓度处理中，低浓度的ABA对叶的表达影响很小，但明显增强根中的应答，中等浓度(50uM)表达量在根和叶中都是最高的，而且根中表达增幅明显高于叶片中，说明该基因在根中能敏感地感受到外界的变化。低浓度的水杨酸和甲基茉莉酸能诱导基因表达，但随着浓度的提高，表达量降低，与对照相比，甚至表达量明显减少。说明该基因是依赖ABA的，低胁迫条件下不表达，但并随着外界环境胁迫增强，该基因表达逐步增强，是在高胁迫环境下有效发挥作用的基因蛋白。拟南芥基因范W^在叶中表达明显，但在根中基本不表达，其他激素如水杨酸和甲基茉莉酸对其作用无法知道。与拟南芥基因范i^相比较，水稻RDB1基因表达明显不同，是根中表达更敏感的基因。实施例5抗旱稻来源的水稻OsRDBl蛋白在细胞中的定位研究为了了解OsRDBl蛋白是否存在信号肽，选取该蛋白前70氨基酸序列，利用SignalP3.0Server(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析RDB1，在人工神经网络(SignalP-丽)和隐藏马可夫模型(SignalP-HMM)的基础上预测信号肽的存在和剪切位点，具体的分析结果如下SignalP-NN结果〉RDB1#Measuremax,Gmax,Ymax,SmeanSDlength=70Position2121131-201—20Value0.9460.9020.9830.9390.921Cutoff0.320.330.870.480.43signalpeptide1YESYESYESYESYES#Mostlikelycleavagesitebetweenpos.20and21:SHA-AD最可能的剪切位点在第20和21氨基酸之间，即SHA和AD之间。SignalP-HMM结果〉RDB1Prediction:SignalpeptideSignalpeptideprobability:0.999Signalanchorprobability:0.000Maxcleavagesiteprobability:0.934betweenpos.20and2116蛋白RDB1存在信号肽的可能性为0.999，其最可能的剪切位点在第20和21氨基酸之间。从上面结果说明该蛋白在细胞内合成后，通过内质网系统分泌到细胞外。为了进一步证实上面的预测，我们构建了RDB1与荧光蛋白GFP的融合蛋白，然后通过转基因方法导入拟南芥中，通过荧光共聚焦显微镜观察该蛋白在细胞中的分布。根据抗旱稻沪旱3号基因RDB1的全长序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI和SacII，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真Taq酶进行PCR扩增后，将抗旱稻沪旱3号RDB1基因cDNA克隆至中间载体pBI221，该载体含有荧光蛋白GFP，进一步转化大肠杆菌DH5ci，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，使用EcoRI和HindIII酶切质粒，这样就将基因两头分别加入了转录启动子和终止子，构成了一个完整的表达单元，再装入植物表达载体pCAMBIA1301中，转化农杆菌EHA105，最后对拟南芥进行浸花转化实验。1.将拟南芥种子播种在含30%蛭石的土壤中，在20-22"60%左右的相对湿度下让拟南芥健康生长至开花。2.在转化平板上挑取单菌落在lml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入lml上述培养物，200rpm，28。C培养5-6hr至OD600为0.6-1.0。3.4000rpm离心5分钟使农杆菌沉淀下来，然后用5%蔗糖溶液重悬农杆菌。4.在浸花之前，在菌液中添加SilwetL-77至浓度0.05%。5.将拟南芥花序全部浸泡在菌液中2—3秒中，同时轻轻抖动。6.将浸泡过的植株在黑暗中横放16-24小时，同时保持一定湿度。7.然后在温室条件下让拟南芥正常生长，直至成熟结实。8.收集干燥的种子。种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70%的乙醇消毒1分钟，然后用0.1%升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入含有50ug/ml潮霉素的0.5XMS培养基上，冷处理2天，然后在持续的光照条件下培养7—10天。9.在培养基上生长出来的阳性拟南芥植株，用镊子剥取单层表皮，放置在荧光共聚焦显微镜下，用绿色荧光滤片观察表皮细胞。通过荧光共聚焦显微镜观察，发现荧光主要分布在细胞壁上，说明融合蛋白通过细胞运输分泌到细胞外沉积在细胞壁上。进一步证实水稻0sRDBl蛋白是含有信号肽的分泌蛋白。实施例6抗旱稻来源的水稻0sRDBl蛋白或多肽在水稻中进行表达的抗逆性鉴定含目的基因(抗旱稻来源的水稻RDB1)的表达载体的构建根据抗旱稻沪旱3号基因RDB1的全长序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例l中获得的扩增产物为模板，经高保真TaQ酶进行PCR扩增后，将抗旱稻沪旱3号基因RDB1基因cDNA克隆至中间载体(如pBI221)，进一步转化大肠杆菌DH5ct，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，使用EcoRI和HindIII酶切质粒，这样就将基因两头分别加入了转录启动子和终止子，构成了一个完整的表达单元，再装入植物表达载体pCAMBIA1301中，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。1.种子消毒成熟的中花11水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡l-2min，无菌水冲洗2次；再用30%NaClO消毒30min,其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D2.0mg/L)上，每皿约30粒，于28。C暗培养。2.继代培养经过近l月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。3.农杆菌的培养在转化平板上挑取单菌落在lml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入lml上述培养物，200rpm，28。C培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含ASlOOuM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的00600=0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS=acetosringone4.共培养将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2，4-D2.0mg/L+AS100uM)上，28。C暗培养三天。5.洗菌共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。6.选择培养将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2,4-D2.0mg/L+Hyg30mg/L+Cef400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2,4-D2.0mg/L+Hyg50mg/L+Cef250mg/L)上，再选择2周。7.分化培养将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT2.0mg/L+NM0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+Hyg30mg/L+Cef200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养IO天左右，再转到分化培养基(N6+KT2.0mg/L+NM0.2mg/L+6—BA2.0mg/L+Hyg30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。8.生根培养约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。9.转基因苗的移栽当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。10.含基因的转基因水稻的抗性鉴定鉴于编码，在前面的表达分析中发现该基因专门在中高等环境胁迫时发挥作用，可进一步对含&y"W的转基因水稻植株进行抗旱耐盐鉴定。在中等胁迫情况下用300Mm氯化钠和300慮甘露醇处理转基因水稻和转基因水稻的种子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究0^Z^7基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。通过实时定量PCR分析结果证明，转基因植株ft^Z^7转录水平比空白对照植株表达明显增强，在盐和甘露醇处理后其表达量更是显著增强到8倍以上。非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外在盐和甘露醇处理下非转基因植株生长比转fl^"W植株缓慢，7天后叶片明显，28天60%植株开始枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是生长没有未经处理的植株快，14天后出现叶片巻縮，28天后仅只2%植株枯萎而死。将处理28天后的植株改放在正常的条件下，7天后，对照非转基因植株只有25%恢复到正常状况，而转基因植株82%恢复到正常状况。这证明水稻0^/^7基因在中等旱和盐胁迫下的的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良作物抗旱耐盐的研究和产业化生产中。本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征-(A)长度26bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.1TGCGCCACGTC(A/G)CT(C/G)GAG(G/T)CC(A/C)TGGT(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征-(A)长度22bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述:SEQIDNO.2CGGCA(T/C/G)GA(A/G)GTGGCA(C/G)ACCGGCSEQIDNO.3的信息SEQUENCELISTING〈110〉上海市农业生物基因中心〈120〉利用旱稻来源的水稻RDBl蛋白提高植物抗旱能力〈130>2<160>2〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉2119〈212〉腿<213〉0ryzasativa<220><221>CDS<222>(60)..(1817)<400〉1catccttcgtagtgcaattcacttatacacggagtttaattagtttattgccttctaca59atggataggatettcgcccgtttcttttgcttcetactgattgcggca107MetAspArgliePheAlaArgPhePheCysPheLeuLeulieAlaAla151015gtaagecatgcagetgatctgteccccgagcaatactggcgatecate155ValSerHisAlaAlaAspLeuSerProGluGinTyrTrpArgSerlie202530etccctaacaccccaatgccaagetecateteccaacttcttaactac203LeuProAsnThrProMetProSerSerlieSerGinLeuLeuAsnTyr354045cctta_cttgcctgetgttagattacctcgccgtacggatgetggtcag251ProTyrLeuProAlaValArgLeuProArgArgThrAspAlaGlyGin505560cgcaactacaaateateagttteacatgtggetgaacgatctc'accgt299ArgAsnTyrLysSerSerValSerHisValAlaGluArgSerHisArg65707580gtagatgatggccaacgcaactacaagttateagetttacctgccact347ValAspAspGlyGinArgAsnTyrLysLeuSerAlaLeuProAlaThr859095aatgaaetacctcaccgtacggatgetggtcaacgcaactacaagtea395AsnGluLeuProHisArgThrAspAlaGlyGinArgAsnTyrLysSer100105110teagttteacctgtggetgaaetacctcaccgtgtagatgatggccaa443SerValSerProValAlaGluLeuProHisArgValAspAspGlyGin115120125cgcaactacaagttateagetttacctgccactaatgaaetacctcac491ArgcgtArg145Asn130acgThrTyrgatAspLysgttValLeuggtGlySercaaGin150Ala135cgcArgLeuAsnProtacTyrAla犯gThrteaSer155Asn140teaSerGlugttValLeuteaSerProcctProHisatgMet160539getAlagaaGluetaLeutctSerC3CHis165cgtgtaValgatAspgstAspggtGly170caaGincgcArgAsntacTyrtmgLys175ttaLeu587teaSergetAlattaLeucctPro180gcaAlaactThrasitAsnGluetaLeu185cctProcacHiscatHisa_cgThrAsp190getAlaggtGly635c肌GincgcArgaacAsn195tacTyra_agLysteaSerteaSergttVal200teaSercctProgtgValgetAlag犯Glu205etaLeucctProcacHis683cgtArggtaVal210gatAspAspggtGlycaaGincgcArg215肌cAsntacTyraagILysttaCeuteaSer220getAlattaLeucctProgccAla731actThr225aatAsnGluetaLeucctProC3CHis230cgtArgacgThrgatAspgetAlaggtGly235C￡l￡lGincgcArg犯cAsntacTyraagLys240779teaSerteaSergttValteaSercctPro245gtgValgetAlaga_aGluetaLeucctPro250HiscgtArggtaValgatAspgatAsp255ggcGly827c肌GincgcArgaacAsntacTyr260肌gLysttaLeuteaSergetAlattaLeu265cctProgccAlaactThraatAsng犯Glu270etaL_eucctPro875C3CHiscgtArgatalie275gatAspgetAlaggtGlycaaGincgcArg280aa<cAsntacTTyr卿LysteaSerteaSer285gttValteaSercctPro923atgMetgetAla290g肌GluetaLeucctProC3CHiscgt295gcaAlagatAspgatAspggtGlycaaGin300cgcArgaacAsntacTyrEmgLys971ttaLeu305teaSergttValteaSercctProgetAla310getAlagaaGluetaLeucctProHis315cgtArggtaValgatAspgatAspggtGly3201019caaGincgcArgaatAsntacTyr肌gLys325ttaLeuteaSergttValttaLeucctPro330gccAlaactThrGluetaLeugttVal335His1067tatTyrac3ThrgatAspggtGly340ca^GincgcArgaatAsntacTyraagLys345teaSerteaSergttValttgLeug观Glu350acgThrccaPro1115gaaGlucttLeuetcLeu355gacAspcccProga_cAspatgMet360gcgAlaetcLeuttcPhettcPhecttLeu365gagGlu肌gLysaatAsn1163cttc幼ggtattaataacgccetcC￡ICttcgccaa^cttg1211LeuttgLeu385Gin370gccAlaGinactThrGlya_cgThrLysAsntystecSer390lie375肌gLysAsnttcPheAsnctgLeuAlaProLeucgaArg395His380ggcGlyPhe肌gLysAlagcgAlaAsngacAspLeutecSer■1259atelieccgProttcPhetecSertctSer405Lysg肌GluetaLeucccProg&gGlu410ateliectgLeugacAspeggArgttcPhe415gggGly1307gtgValeggArgccgProggcGly420tecSergacAspgacAspgcgAlagetAla425gsgGluatgMetagtSergetAlaacgThr430ctgLeuC3gGin1355gacAsptgcCysg&gGlu435ctgLeuccgProgcgAlaaeitAsn￡iagLys440ggaGlygagGlufmgLysLysgccAla445tgcCysgccAla肌gThr1403tcgSerctgLeu450gagGlutctSerata_liegtcValgacAsp455ttcPhegtcValaca_ThrtecSerageSer460tttPhegggGlygccAlaagtSer1451gacAsp465gtcValgacAspgccAlagccAlatecSer470accThrgttValgtgValetcLeu3gtSer475aa_gLysgcgAlagtgValgagGlutctSer4801499tctSertcgSerctgLeugcgAlacagGin485geicAsptacTyracgThrgtgValageSer490ggcGlygtgValaggArgcgaArgatgMet495gccAla1547ggaGlyaccThrggcGlycagGin500etcLeuateliegetAlatgcCyscatHis505ccgProgagGlutcgSertacTyrccgPro510tacTyrgetAla1595gtgValttcPheMet515tgcCysC3CHisetcLeuThrgagGlu520gcgAla3CgThrElCgThr鄉ArggcgAla525tacTyraeigLysgccAla1643teaSerttgLeu530gtcValggcGlyLysgatAspggtGly535actThrgcgAlagtgValGlugcgAla540gtcValgccAlagtgValtgcCys1691C3CHis545accThrgacAspacgThrtcgSergagGlu550tggTrpaacAsnProgagGluC3CHis555getAlagccAlattcPhecatHisgtgVal5601739etcLeuggcGlygtcValaeigLyscctPro565gggGlyactThrgtgValcctProgtcVal570tgcCysC3CHisttcPheatgMetcagGin575cctPro1787gacAspgetAlagtcValgtcValtggTrpa.ccThrcgcArgaggArgggcGlytgfitgtatgtatgtatgecatat1837580585agtacctactteategtactgtactgcgtacgcatgctgccagctgetttgcataccttg1897ctgctggagatatataattaatatccagcacttatatactcgtcacttctatcgtgtgtc1957gaaggttatatacttgtagcatttgggg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技术领域：
的抗旱稻沪旱3号OsRDB1抗旱基因序列，其编码具有抗旱稻沪旱3号的水稻RDB1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列能与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列杂交，与SEQIDNO.3中从核苷酸第60-1817位的核苷酸序列有至少70％的同源性。所述的水稻RDB1蛋白序列及其核酸序列，应用于转基因技术改良植物抗逆研究中，使该植物具有明显的抗旱作用，能够降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。文档编号C12N15/29GK101323854SQ20071011115公开日2008年12月17日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者余舜武,吴金红,罗利军申请人:上海市农业生物基因中心