专利名称：一种植物抗旱相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种植物抗旱相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物抗旱性的方法。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
干旱是限制植物生长发育的主要逆境，随着人类的经济发展、人口膨胀以及生物种群的破坏，水资源短缺现象日趋严重，它严重地影响了农业生产和生态环境，已成为全球关注的问题，因此寻求植物特别是农作物抗旱途径是十分必要的。提高作物的抗旱性，除了利用传统的育种方法，目前，应用基因工程育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。
拟南芥是一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗旱性分子生物学机制的研究将极大地有助于找到提高农作物抗旱性，增加产量的方法。
拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，获知了一些抗旱基因的功能，如DREB、CBF、ABRE等。
目前，还未找到有效的抗旱功能基因，面对日益严重的作物干旱问题，寻找新的抗旱功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物抗旱相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物抗旱相关蛋白，名称为LEW2-1(LEaf Wilt 2-1)，其来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；
2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的蛋白质。
序列表中的序列2由985个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
LEW2-1的编码基因(LEW2-1)也属于本发明的保护范围。
LEW2-1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的序列1由3217个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第68位至3025位碱基，编码序列2的蛋白质。
含有本发明LEW2-1的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增LEW2-1中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗旱性的方法。
本发明所提供的增强植物抗旱性的方法，是抑制植物中的上述植物抗旱性相关蛋白编码基因的表达。
抑制植物中的上述植物抗旱性相关蛋白编码基因LEW2-1的表达可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制LEW2-1表达均可。
利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为抗旱；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的LEW2-1转入植物中，植物就表现出旱敏感。
本发明的LEW2-1基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度来筛选转化植株。携带有本发明LEW2-1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明的植物抗旱相关蛋白及其编码基因为农作物抗旱育种提供基因与技术的支持(保障)。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
图1为lew2-1、野生型植株的抗旱性比较照片图2为lew2-1、野生型植株的渗透调节能力比较照片图3为lew2-1、野生型植株在正常和逆境胁迫条件下抗逆基因的表达特征具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、LEW2-1及其编码基因的获得以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗100-200mg为材料，用Trizol分别提取根和茎干总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μm的引物1和引物2各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。其中，引物15’ATGATGGAGTCTAGGTCTCCCAT 3’，引物25’ACTGTCTT GATCGTTATTGCTAA3’。在PE 9700仪上扩增先94℃预变性3min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min 30sec，共计35个循环；最后72℃延伸4min，将获得的PCR产物，作1％琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-LEW2-1，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列1的DNA序列，为LEW2-1的cDNA基因，由3217个碱基组成，其编码序列为自5’端第68位碱基到第3025位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。
实施例2、培育抗旱性增强的拟南芥1、LEW2-1基因被敲除的纯合突变体lew2-1的获得根据LEW2-1基因序列中的特异性片段，设计引物RNAi-F5’ATGATGGAGTCTAGGTCTCCCAT 3’和RNAi-R5’ACTGTCTTGATCGTTATTGCTAA 3’，以哥伦比亚生态型拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到长度约为350bp的目的片段，利用gateway系统(入门载体构建转化系统，购自INVITROGEN公司)将该350bp目的片段整合到质粒pJawoh-8(购自INVITROGEN公司)中，形成反向重复序列，经测序检测整合片段和插入方向正确，转化农杆菌(筛选标记为卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素)，利用农杆菌侵染方法转化拟南芥，对得到的F1代植株用除草剂草丁磷(basta，购自INVITROGEN公司)筛选转化苗，分离纯化。对经草丁磷筛选无分离性状现象的株系Trizol提取总RNA，琼脂糖电泳后转尼龙膜，进行Northern-blot检测。其中，所用的探针为以野生型拟南芥组DNA为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增得到的DNA片段，其中20μl PCR反应体系内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。在PE 9700仪上扩增94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min 30sec，共计35个循环；72℃延伸4min，将获得的PCR产物，作1％琼脂糖凝胶电泳。探针P32标记后与总RNA杂交，结果未得到杂交条带，证明LEW2-1基因表达的RNA已被降解，得到纯合突变体lew2-1。
2、lew2-1、野生型植株的抗旱性比较将在土壤中生长2周的lew2-1植株、野生型植株分别停止浇水10-14天，其它培养条件均相同，观察比较植株存活率及叶片萎焉情况以确定其抗旱性。结果如图1所示，表明野生型植株(WT)的存活率为2％，存活植株三分之一的叶片枯黄；LEW2-1基因被敲除的lew2-1植株全部存活，无萎蔫枯黄叶片；说明LEW2-1基因缺失后，可使植株抗旱，3、lew2-1、野生型植株的渗透调节能力比较将lew2-1、野生型植株的种子分别播种在普通(MS)培养基上，4℃下春化2-3天后在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养5-6天，然后转移到含有不同浓度的甘露糖(0、420、520mmol/L)的培养基上在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养7-10天，观察比较植株根系及整株生长情况以确定它们的渗透调节能力。结果如图2所示，表明随着甘露糖浓度的升高，野生型植株(WT)的根系生长减慢，变化明显；在甘露糖浓度达到420mmol/L时，全部植株的四分之三叶片变黄，甘露糖浓度达到520mmol/L时，全部植株的全部叶片变黄；LEW2-1基因被敲除的lew2-1植株的根系生长虽然也减慢，但变化不如野生型植株的明显，在甘露糖浓度达到520mmol/L时，只有五分之一植株的三分之一叶片变黄；说明LEW2-1基因缺失后，植株渗透调节能力增强，有利于抗旱。
实施例3、检测lew2-1、野生型植株中抗逆基因表达情况选取在普通(MS)培养基中生长2周的lew2-1，野生型植株分别进行以下处理水培处理在普通液体(MS)培养基中生长2周；干旱处理在室温下暴露放置3小时；高光处理于普通(MS)培养基中在高光强(260微摩尔/秒·平方厘米)条件下生长2周；分别提取上述处理的植株RNA，以rRNA为对照(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物ATGATGGAGTCTAGGTCTCCCAT和ACTGTCTTGATCGTTATTGCTAA进行PCR得到的DNA片段)，利用RNA印迹杂交技术检测抗逆基因拟南芥干旱、高盐及低温应答基因RD29A，抗盐耐旱基因P5CS和ABA(脱落酸)合成基因SDR1，分别在lew2-1、野生型植株中的表达情况，以确定其对相应胁迫的抗性大小。其中，检测RD29A所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’GACGAG TCAGGA GCTGAGCTG3’和5’CGATGCTGCCTTCTCGGTAGAG3’进行PCR得到的DNA片段；检测P5CS所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’AGCCTTGGCACAGGAGCAACG3’和5’TGAGAC CAGTGACAGCATCAAACA3进行PCR得到的DNA片段；SDR1所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’TGATCACTGGAGGAGCCACAGG 3’和5’CTCCGCTTATGTACC GCGAGTC3’进行PCR得到的DNA片段。
结果如图3所示，表明lew2-1植株在正常条件下(control)，以及水培，干旱和高光处理条件下，RD29A，P5CS和SDR1的表达量都显著高于野生型植株。说明LEW2-1基因缺失后，可使植株抗旱，图3中，W表示野生型植株，M表示lew2-1植株。
序列表<160>2<210>1<211>3217<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atccatccaa atctcaatcc ctaattaggg ttcatttctc tgtttctcca aacaggggaa 60ttcgaagatg atggagtcta ggtctcccat ctgcaacact tgtggtgaag agattggtgt 120aaaatcaaac ggagagttct ttgtggcttg tcatgagtgt agtttcccga tctgcaaagc 180ttgtcttgag tatgaattca aagaaggtcg aagaatttgc ttgcgttgcg gcaatcctta 240cgatgagaat gtgtttgatg atgttgagac aaagacatct aaaactcaat ccattgttcc 300aacacagacc aataacactt ctcaggattc agggattcat gctagacata taagtacagt 360ctcaacaata gacagtgaac tgaatgatga atatggcaat ccaatttgga agaacagagt 420ggagagctgg aaagacaaga aagacaagaa gagcaagaag aagaagaaag atccaaaagc 480aacaaaagct gaacaacatg aggctcagat tcctacccaa cagcacatgg aagatacgcc 540accgaacaca gaatctggtg ctacagatgt gctttcggtt gtgattccta tcccaaggac 600aaaaatcact tcatatagga ttgtcatcat catgcggttg atcatcttgg ctctgttttt 660taactaccgt atcacgcatc ctgtcgatag cgcttacggt ttatggctaa catctgtgat 720atgtgagatt tggtttgctg tttcttgggt gttggatcag ttccctaaat ggtctcctat 780taaccgagaa acttacatcg accggttatc cgcaagattc gaaagagaag gcgagcaatc 840acagcttgca gctgtagatt tctttgttag tacggtagat ccattaaagg agccaccttt 900gataactgca aacacggttc tttcgatcct cgcgcttgat tatccggtgg ataaagtctc 960ttgctatgta tctgatgatg gtgctgcaat gctttcgttt gagtctttgg ttgagacagc1020agattttgct aggaaatggg tacctttctg caaaaagtac tccatcgagc cacgagctcc1080cgagttttac ttctcgctta aaatcgatta cttgagggat aaagttcaac cttcttttgt1140gaaagaacgt agagccatga aaagagatta tgaagagttt aaaataagaa tgaatgcttt1200agtcgccaag gctcaaaaga caccagaaga aggatggaca atgcaagatg gaacatcttg1260gcccgggaac aacactcgtg accatcccgg gatgattcag gtttttcttg gatatagcgg1320
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180 185 190Ile Leu Ala Leu Phe Phe Asn Tyr Arg Ile Thr His Pro Val Asp Ser195 200 205Ala Tyr Gly Leu Trp Leu Thr Ser Val Ile Cys Glu Ile Trp Phe Ala210 215 220Val Ser Trp Val Leu Asp Gln Phe Pro Lys Trp Ser Pro Ile Asn Arg225 230 235 240Glu Thr Tyr Ile Asp Arg Leu Ser Ala Arg Phe Glu Arg Glu Gly Glu245 250 255Gln Ser Gln Leu Ala Ala Val Asp Phe Phe Val Ser Thr Val Asp Pro260 265 270Leu Lys Glu Pro Pro LeuIle Thr Ala Asn Thr Val Leu Ser Ile Leu275280 285Ala Leu Asp Tyr Pro Val Asp Lys Val Ser Cys Tyr Val Ser Asp Asp290 295 300Gly Ala Ala Met Leu Ser Phe Glu Ser Leu Val Glu Thr Ala Asp Phe305 310 315 320Ala Arg Lys Trp Val Pro Phe Cys Lys Lys Tyr Ser Ile Glu Pro Arg325 330 335Ala Pro Glu Phe Tyr Phe Ser Leu Lys Ile Asp Tyr Leu Arg Asp Lys340 345 350Val Gln Pro Ser Phe Val Lys Glu Arg Arg Ala Met Lys Arg Asp Tyr355 360 365Glu Glu Phe Lys Ile Arg Met Asn Ala Leu Val Ala Lys Ala Gln Lys370 375 380Thr Pro Glu Glu Gly Trp Thr Met Gln Asp Gly Thr Ser Trp Pro Gly385 390 395 400Asn Asn Thr Arg Asp His Pro Gly Met Ile Gln Val Phe Leu Gly Tyr405 410 415Ser Gly Ala Arg Asp Ile Glu Gly Asn Glu Leu Pro Arg Leu Val Tyr420 425 430
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675 680 685Lys Met His Cys Arg Gly Trp Arg Ser Ile Tyr Cys Met Pro Leu Arg690 695 700Pro Ala Phe Lys Gly Ser Ala Pro Ile Asn Leu Ser Asp Arg Leu His705 710 715 720Gln Val Leu Arg Trp Ala Leu Gly Ser Val Glu Ile Phe Leu Ser Arg725 730 735His Cys Pro Leu Trp Tyr Gly Cys Ser Gly Gly Arg Leu Lys Leu Leu740 745 750Gln Arg Leu Ala Tyr Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro Phe Thr Ser Leu755 760 765Pro Leu Val Ala Tyr Cys Thr Leu Pro Ala Ile Cys Leu Leu Thr Gly770 775 780Lys Phe Ile Ile Pro Thr Leu Ser Asn Leu Ala Ser Met Leu Phe Leu785 790 795 800Gly Leu Phe Ile Ser Ile Ile Leu Thr Ser Val Leu Glu Leu Arg Trp805 810 815Ser Gly Val Ser Ile Glu Asp Leu Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val820 825 830Ile Gly Gly Val Ser Ala His Leu Phe Ala Val Phe Gln Gly Phe Leu835 840 845Lys Met Leu Ala Gly Leu Asp Thr Asn Phe Thr Val Thr Ser Lys Thr850 855 860Ala Asp Asp Leu Glu Phe Gly Glu Leu Tyr Ile Val Lys Trp Thr Thr865 870 875 880Leu Leu Ile Pro Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ile Asn Leu Val Gly Val885 890 895Val Ala Gly Phe Ser Asp Ala Leu Asn Lys Gly Tyr Glu Ala Trp Gly900 905 910Pro Leu Phe Gly Lys Val Phe Phe Ala Phe Trp Val Ile Leu His Leu915 920 925
Tyr Pro Phe Leu Lys Gly Leu Met Gly Arg Gln Asn Arg Thr Pro Thr930 935 940Ile Val Ile Leu Trp Ser Ile Leu Leu Ala Ser Val Phe Ser Leu Val945 950 955 960Trp Val Arg Ile Asn Pro Phe Val Ser Lys Thr Asp Thr Thr Ser Leu965 970 975Ser Leu Asn Cys Leu Leu Ile Asp Cys980 98权利要求
1.植物抗旱相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的植物抗旱相关蛋白，其特征在于所述植物抗旱相关蛋白具有序列表中的SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
3.权利要求1或2所述的植物抗旱相关蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述植物抗旱相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.含有权利要求3或4所述植物抗旱相关蛋白编码基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述植物抗旱相关蛋白编码基因的细胞系。
7.含有权利要求3或4所述植物抗旱相关蛋白编码基因的宿主菌。
8.扩增权利要求3或4所述植物抗旱相关蛋白编码基因的引物。
9.一种利用权利要求3或4所述植物抗旱性相关蛋白的编码基因增强植物抗旱性的方法，是抑制植物中的所述植物抗旱相关蛋白编码基因的表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于抑制植物中的所述植物抗旱性相关蛋白编码基因的表达方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法和siRNA介导的基因沉默方法。
全文摘要
本发明公开了一种植物抗旱性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物抗旱性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与植物抗旱相关的蛋白质。可利用该植物抗旱性相关蛋白的编码基因增强植物抗旱性，如抑制植物中的上述植物抗旱性相关蛋白编码基因的表达。本发明的植物抗旱性相关蛋白及其编码基因可用于培育抗旱植物新品种，具有重要意义。
文档编号C07K14/415GK1687124SQ20051006643
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者巩志忠, 洪旭晖, 陈智忠, 张海荣, 王幼群, 李霞 申请人:中国农业大学