轮状病毒vp6蛋白的一种编码基因及其应用的制作方法

专利名称：轮状病毒vp6蛋白的一种编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因及其应用，特别涉及利用该编码基因生产轮状病毒口服疫苗的方法及得到的轮状病毒口服疫苗。
背景技术：
轮状病毒的感染在人类、哺乳动物、鸟类中普遍存在，是病毒性腹泻的主要病原物。轮状病毒分为7个组(A-G)，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要原因，在世界范围内广泛流行。无论发达国家还是发展中国家，90％以上的婴幼儿在3岁之前都受到了轮状病毒的感染。在发展中国家，每年大约有一千八百万儿童因感染轮状病毒住院，其中约一百万人死亡，造成巨大的经济损失(Dodet etal.1997)，在我国婴幼儿死因中居第二位。另外，轮状病毒也是幼龄牲畜(牛、羊、猪)致死的重要原因之一。犊牛感染多发生于3天-15周龄，病死率可达50％，有的并发肺炎，致死率升高。缺乏母源抗体保护的仔猪，在出生一周内发病率较高，病死率高达100％。由此可见，诱导被动免疫对于研制轮状病毒疫苗显得尤其重要。
轮状病毒属于呼肠孤病毒科，其基因组为双链RNA，包括11个基因片段。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。轮状病毒的外壳分为三层，最外层由VP4和VP7构成，中间层由VP6构成，内层由VP2构成(Raming R F，Annu.Rev.Microbiol.，1997，51225-255)。VP4和VP7可以诱导机体产生中和性抗体，决定轮状病毒的血清型，是主要的种属特异性抗原，利用VP4和VP7制成的疫苗不能产生交叉保护。VP6是组或亚组特异性抗原，占病毒颗粒的51％，VP6蛋白诱导机体产生的抗体具有很强的交叉反应性，表达VP6蛋白的疫苗能够提供异源保护作用。VP6蛋白虽然不能刺激机体产生中和性抗体，但是它能够增强同源和异源的VP4和VP7蛋白的免疫原性，提高中和抗体水平(Esquivel FR，et.al.Arch.Virol.，2000，145813-825)。Feng N等人(J.Clin.Invest.，2002，1091203-1213)的研究结果表明VP6抗体IgA在体内通过抑制病毒复制过程中的早期转录实现对机体的保护作用。因此，在研制轮状病毒疫苗时可以将VP6蛋白作为候选蛋白来生产高效的人畜共用疫苗。
1998年美国FAD批准使用人一猴轮状病毒四价重配疫苗(RRV-TV)，该疫苗对重症腹泻保护性较好，对普通腹泻的阻断效果在70％左右，但1999年因为发现引起婴幼儿肠套叠而被停止使用(Centers for Disease Control.MMWR，1999，48577-581)。尽管现在正在研制的亚单位疫苗和DNA疫苗在国外已经获得专利授权，但因为存在制备工艺、安全性、生产成本等问题，目前均未上市。表达人轮状病毒VP7的非复制性的重组腺病毒于2002年在国内申请专利(申请号02104125.3)。由于VP7是种属特异性抗原，以一种血清型的VP7制成的疫苗往往不能使机体产生抵抗其它血清型的轮状病毒的能力，因为轮状病毒在不同的地区存在不同的血清型，所以，这种疫苗不利于大面积推广。
利用植物作为生物反应器生产可食用疫苗在生物技术领域开辟了一条新途径。1992年，Mason等(Proc Natl Acad Sci USA，1992，8911745-11749)提出了用转基因植物生产疫苗的新思路，迄今为止，已经有多种病毒和细菌抗原在植物中表达用以生产口服疫苗。轮状病毒经肠道粘膜感染且繁殖局限在肠道，因此诱导局部保护性粘膜免疫是研制轮状病毒疫苗的关键所在。应用转基因植物生产可食用疫苗具有巨大的潜力，因为它不仅能够诱导机体产生分泌型的黏膜IgA，还是一个生产抗原蛋白的廉价系统。有研究表明，口服途径比其他非肠道途径更易于诱导黏膜免疫，利用转基因植物生产的抗原蛋白到达肠道后被肠道淋巴上皮中特殊的抗原捕捉细胞—M细胞(microfold cell)识别并转运，进一步在抗原呈递细胞和T细胞的协助下，激活B细胞并释放分泌型IgA(sIgA)。sIgA与黏膜内的可溶性抗原、细菌、病毒等结合后，可能封闭了它们与M细胞上的受体相结合的位点，从而阻止其进入机体；另外，sIgA还可经血液循环进入小肠上皮细胞，对正在感染上皮细胞的病毒发挥拦截作用。所以，黏膜IgA不仅能够抵抗那些定殖在黏膜表面的微生物，还能抵抗那些经过黏膜表面进入机体但却引起系统性疾病的病原微生物(Lamm M E，Annu Rev Microbiol，1997，51311-340)。
2000年，O’Brien G J等(Virology，2000，270444-453)利用病毒载体在烟草中表达了轮状病毒VP6蛋白且在植物体内成功装配成病毒颗粒。2002年，Matsumura，T.等(Arch Virol，2002，1471263-1270)应用农杆菌介导的转化系统在转基因马铃薯中表达了牛轮状病毒VP6基因。2003年Yu J等在转基因马铃薯中表达了鼠轮状病毒VP6基因(Transgenic Research，2003，12163-169)。但是，在上述研究中，VP6蛋白的表达量都很低，最高含量仅达到马铃薯块茎总可溶性蛋白的0.1％。因为低水平表达的抗原直接口服可能引起机体的免疫耐受，所以增加转基因植株中抗原基因的表达量已经成为发展可食用疫苗的关键因素。
迄今为止，已有多种双子叶植物和单子叶植物用于生产疫苗，目前已报道的表达抗原蛋白的植物材料主要集中在烟草和马铃薯，这主要是因为这两种植物的遗传转化易于操作，但是烟草中含有尼古丁等对人体有害的成分，而马铃薯又不宜生食，煮熟后会导致抗原蛋白含量降低50％，所以这两种植物不适于商品化生产口服疫苗。
对于轮状病毒感染引起的人和动物的腹泻目前尚无有效的治疗和预防手段，本领域迫切需要开发研制一种安全高效的疫苗。

发明内容
本发明的目的是提供在双子叶植物中，特别是在苜蓿中具有较高表达量的轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因。
本发明所提供的轮状病毒VP6蛋白编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的DNA序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的序列1由1194个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第1位至1194位碱基，编码397个氨基酸残基的VP6，名称为sVP6基因，其单链DNA的分子量为367.86，双链DNA的分子量为736.0。
序列表中的序列2由1216个碱基组成，自序列2的5′端第1-8位碱基是Kozak序列(AACCATGG)，自序列2的5′端第5-1195位碱基是sVP6编码序列，自序列2的5′端第1196-1213位碱基是一个内质网固位信号肽SEKDEL序列(TCT GAG AAA GAT GAG CTA)，自序列2的5′端第1213-1216位碱基是终止密码子(TAA)，将序列表中序列2的核苷酸序列命名为sVP6-SEKDEL基因。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述轮状病毒VP6蛋白编码基因生产轮状病毒口服疫苗的方法。
本发明所提供的生产轮状病毒口服疫苗的方法，是将上述任一种轮状病毒VP6蛋白编码基因导入双子叶植物细胞，得到表达轮状病毒VP6蛋白的双子叶转基因植物，提取所述双子叶转基因植物的总可溶性蛋白，得到轮状病毒口服疫苗。
所述双子叶植物包括苜蓿，大豆，番茄，苹果，香蕉和胡萝卜等。
所述双子叶植物优选为苜蓿。
所述轮状病毒VP6蛋白编码基因可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将其导入植物细胞。所述轮状病毒VP6蛋白编码基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。
含有所述轮状病毒VP6蛋白编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
为了提高轮状病毒VP6蛋白的表达量，所述轮状病毒VP6蛋白编码基因的5′端连接有以下元件1)所述轮状病毒VP6蛋白编码基因的5′端紧密连接有Kozak序列(AACCATGGCT)；2)所述Kozak序列的5′端紧密连接有烟草蚀刻病毒5′非翻译区；所述烟草蚀刻病毒5′非翻译区可具有序列表中序列3的核苷酸序列；该烟草蚀刻病毒5′非翻译区可以用限制性内切酶XhoI或EcoR I和Nco I酶切载体pRTL2得到；3)所述烟草蚀刻病毒5′非翻译区的5′端连接有带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子；所述带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子是下述核苷酸序列之一；1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；3)用限制性内切酶HindIII或SphI或PstI或HincII和XhoI或EcoRI酶切载体pRTL2得到的带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸片段；
序列3中，自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为XhoI的识别位点，自5′端第6位至第11位脱氧核苷酸为EcoRI的识别位点，自5′端第139位至第144位脱氧核苷酸为NcoI的识别位点。序列4中，自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为HindIII的识别位点，自5′端第7位至第12位脱氧核苷酸为SphI的识别位点，自5′端第13位至第18位脱氧核苷酸为PstI的识别位点，自5′端第19位至第24位脱氧核苷酸为HincII的识别位点，自5′端第770位至第775位脱氧核苷酸为XhoI的识别位点，自5′端第775位至第780位脱氧核苷酸为EcoRI的识别位点。
所述轮状病毒VP6蛋白编码基因通过表达载体pBsVP6导入植物细胞。
利用上述方法生产的轮状病毒口服疫苗也属于本发明的保护范围。
本发明采用双子叶植物偏爱的密码子改造了人A组轮状病毒VP6基因的部分核苷酸序列，大幅度提高了VP6蛋白在转基因植物叶片中的表达量(含量高达总可溶性蛋白的0.28％)，抗原基因在转基因植物中表达量的提高为轮状病毒植物疫苗的商业化生产提供了重要保证；用本发明的轮状病毒口服疫苗口服免疫BALB/c母鼠，母鼠体内产生了高水平的抗VP6的血清IgG和黏膜IgA抗体；用猿轮状病毒SA-11对免疫后母鼠所生育的小鼠攻毒，结果证实，母鼠产生的VP6抗体可以传递给小鼠，并且能够为小鼠提供异源交叉保护。本发明的轮状病毒口服疫苗可以通过口服的方式诱导人和动物产生黏膜免疫，能够用于预防多种轮状病毒感染引起的婴幼儿和幼龄牲畜的急性腹泻。
本发明的生产轮状病毒口服疫苗的方法具有以下优点1.成本低，易推广植物是大规模生产蛋白质的廉价系统，一旦获得高效表达抗原蛋白的转基因植物，就可在短时间内迅速通过无性繁殖形成产业化规模。植物疫苗易于制备，无需冷藏，可大大降低生产成本。
2.更安全本发明的轮状病毒口服疫苗中只增加了轮状病毒VP6抗原蛋白，没有改变植物其它的遗传组成，不含有对人体有害的成分。另外口服疫苗不需要用注射器注射，既降低成本又避免了注射器不洁带来的污染。
3.更高效抗原蛋白在转基因植物中可以被有效的翻译后加工，如糖基化、磷酸化、酰胺化和高级结构的空间折叠，从而使这种重组蛋白具有与天然蛋白相同的免疫原性，这是原核生物表达系统所无法比拟的，后者无法对源自真核生物的蛋白进行翻译后加工。
4、本发明首选苜蓿作为受体植物，主要是考虑到苜蓿的生物产量高、蛋白含量高(每100g嫩叶中的蛋白质含量为5.9g)、适口性好，苜蓿嫩叶不仅可以做为动物饲料，也可以经过简单的加工过程制成口服液供人食用。


图1为VP6基因和改造后的sVP6基因的核苷酸序列比较图2A为植物表达载体pBsVP6质粒的构建示意2B为pBsVP6质粒的T-DNA区的结构示意3A为转基因苜蓿的PCR检测图3B为转基因苜蓿的Southern杂交检测图3C为转基因苜蓿总RNA的RT-PCR检测图4为原核表达载体pGVP6和pGsVP6的构建示意5A为在E.coli BL21中表达的GST-VP6和GST-sP6融合蛋白的SDS-PAGE电泳5B为纯化的VP6和sVP6蛋白的SDS-PAGE电泳6为Western杂交检测转基因苜蓿叶片中的VP6图7为ELISA定量测定转基因苜蓿叶片中VP6蛋白含量图8为PCR扩增检测无性扩繁的转基因苜蓿图9A为检测口服免疫的母鼠初免疫后第36天的抗VP6血清IgG抗体图9B为检测口服免疫的母鼠初免后第60天的抗VP6小肠黏膜IgA抗体图9C为检测口服免疫的母鼠初免后连续四周的抗VP6唾液IgA抗体图9D为检测口服免疫的母鼠初免后连续四周的抗VP6粪便IgA抗体图10为转基因植物疫苗对被动免疫的小鼠的保护作用具体实施方式
下述实验中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、利用双子叶植物偏爱密码子合成的人A组轮状病毒VP6基因-sVP6基因及sVP6-SEKDEL基因用DNAMAN软件对人A组轮状病毒VP6基因(GenBank AF260931)的编码区序列进行分析，分析其A+T百分含量，限制性内切酶位点，转译的氨基酸序列，密码子使用偏爱性。比较VP6基因编码区序列与双子叶植物的密码子偏爱性的差别，在不改变一个氨基酸序列的前提下，对VP6编码区序列进行改造，使其密码子偏爱性接近双子叶植物，尽量避免使用稀有密码子NCG和NTA。
此外，为了保证产生成熟的可转译的mRNA，改造以下序列1)改造VP6基因编码区序列中的六个多聚腺苷酸(Poly(A))信号序列，以免在poly(A)下游20bp-30bp处mRNA被切割从而不能产生全长的mRNA。这些序列包括AF260931的第69-74位的GATAAA；第280-285位的AATATT；第401-406位的GATAAA；第532-537位的AACCAA；第792-797位的AATAAT；第1038-1043位的AATGAA。
2)改造VP6基因编码区序列中的四个可能的mRNA降解序列(AF260931的第122-126位的ATTTA；181-185位的ATTTA；392-396位的ATTTA；716-720位的ATTTA。
3)改造VP6基因编码区序列中的RNA聚合酶II终止序列(AF260931的第803-809位的AGTAGAA)，序列AGTNNAA(N为任意碱基)可能导致mRNA合成提前终止。
将改造后的序列输入计算机，分析其G+C含量，氨基酸序列，酶切位点，并与原序列进行核苷酸同源率和氨基酸同源率的比较。结果表明，密码子改造使得基因的G+C含量从33％增加到44％，接近于双子叶植物的G+C含量(45％)。改造后的基因命名为“sVP6基因”，sVP6基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，该基因与VP6基因的核苷酸序列同源率为87.94％，氨基酸序列同源率为100％(图1)。为了进一步优化外源基因在植物中的表达，在sVP6基因的5’端合成了Kozak序列(AACCATGG)；在sVP6基因的终止密码子(TAA)前插入了一个内质网固位信号序列SEKDEL(TCT GAG AAA GAT GAG CTA)，得到了sVP6-SEKDEL基因(序列2)。sVP6基因(序列1)及sVP6-SEKDEL基因(序列2)的核苷酸序列由上海生工生物工程公司合成。将sVP6-SEKDEL基因(序列2)连接到pUC19质粒的BamHI/SacI位点，获得含有sVP6-SEKDEL基因(序列2)的重组质粒pUsVP6。
实施例2、制备轮状病毒口服疫苗1、表达sVP6基因的植物转化载体构建利用限制性内切酶NcoI和SacI消化pUsVP6质粒，回收大小为1.2kb的sVP6-SEKDEL基因片段，并将其插入载体pRTL2(J.Virol.，1990，641590-1597)的NcoI/SacI位点，得到含有sVP6-SEKDEL基因的重组质粒pRsVP6。再用HindIII和Sac I双酶切pRsVP6，回收大小为2.4kb的含有“双增强子的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子+烟草蚀刻病毒(TEV)5’非翻译区(5’-UTR)+Kozak序列+sVP6-SEKDEL”片段，与经同样双酶切的pBI121质粒相连接，获得双元表达载体pBsVP6，载体构建图如图2A所示。
pBsVP6质粒的T-DNA区包含两个基因表达盒NptII基因表达盒和sVP6基因表达盒。NptII基因的表达赋予植株卡那霉素抗性(Kan R)，作为转基因植株的筛选标记。sVP6基因的表达由具有双增强子的CaMV 35S启动子驱动；基因5’端连接有TEV 5’-UTR序列和Kozak序列，用以优化基因转译的起始；基因3’端的内质网固位信号序列SEKDEL参与目标蛋白的细胞内定位，从而增强蛋白的稳定性和表达量。pBsVP6质粒的T-DNA区的结构示意图如图2B所示。
2、sVP6基因在苜蓿中的表达和检测利用冻融法将pBsVP6质粒引入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。LBA4404是一种改造后的农杆菌，它含有的质粒pAL4404有完整的vir基因，但T-DNA区被删除。pAL4404和pBsVP6质粒构成双元载体系统，介导pBsVP6中的T-DNA区稳定整合到植物染色体上。
将新鲜的含有pBsVP6的农杆菌LBA4404菌液稀释10倍后，加入预培养1-2天的保定紫花苜蓿的子叶和下胚轴，浸泡3-5min，用滤纸吸干残留菌液，将子叶和下胚轴放在不含抗生素的SH愈伤保持培养基(SH培养基+0.025mg/L KT+2mg/L2，4-D)上共培养3-4天；再将叶片转入含有抗生素的的SH选择培养基(SH培养基+0.05mg/L KT+2mg/L 2，4-D+25mg/L Kan+500mg/L Cb)中，每两周更换一次培养基。当愈伤组织有胚状体形成时，将胚状体转移到分化培养基(SH培养基+0.4mg/L KT+50mg/L Kan+500mg/L Cb)上生长，分化产生1cm以上的幼芽时，将幼芽转移到生根培养基(1/2MS基本培养基+50mg/L Kan+500mg/L Cb)上，培养20天左右，每株幼苗可长出3-5条长约10cm的根，大约10-12周可以获得卡那霉素抗性植株，将生根且生长良好的抗性植株移栽到蛭石土中，4周后种植到温室。
为了检测sVP6基因是否整合到转基因苜蓿的基因组中，用CTAB法(王关林等，植物基因工程原理与技术，第一版，1998，北京，科学出版社)从幼嫩的转基因苜蓿叶片中提取植物基因组DNA。以植物基因组DNA为模板，利用特异性引物P 1(5′-ATGGAGGTTCTGTACTCATTGTC-3′)和特异性引物P2(5′-AGACTTGATCAACATGCTTCT-3′)PCR扩增sVP6基因。结果表明，127株卡那霉素抗性植株中有58株扩增出一条预期大小的1.2kb条带(图3A)。图3A中，1-10为pBsVP6质粒转化的苜蓿，11为未转化的苜蓿(阴性对照)，12为pBsVP6质粒(阳性对照)，M为1kb DNA ladder.
用Nco I和Sac I分别双酶切pBsVP6质粒转化苜蓿植株和未转化植株的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，转移到Hybond N+尼龙膜上，采用Promaga公司随机引物标记试剂盒标记sVP6基因(序列1)，以α-32P标记的sVP6基因作为探针进行Southern杂交。结果如图3B所示，表明转化后的苜蓿基因组DNA中获得一条特异性的杂交条带，而未转化的苜蓿基因组DNA中无杂交条带。图3B中，1为pBsVP6质粒的PCR产物(阳性对照)，2为未转化的苜蓿(阴性对照)，3-6为pBsVP6质粒转化的苜蓿。
用SDS法(王关林等，植物基因工程原理与技术，第一版，1998，北京，科学出版社)提取Southern杂交呈现阳性信号的转基因植株和未转化植株的总RNA，分别以植株总RNA为模板，采用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒和引物P1、P2进行RT-PCR，结果如图3C所示，表明Southern杂交呈现阳性信号的转基因植株扩增得到了一条1.2kb的条带，而未转化植株没有获得条带。图3C中，1-6为pBsVP6质粒转化的苜蓿，7为未转化的苜蓿(阴性对照)，8为pBsVP6质粒的PCR产物(阳性对照)，M为1kb DNA ladder，这些结果表明sVP6基因已经整合到转基因苜蓿的染色体中且表达了完整的mRNA。
3、VP6和sVP6蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化根据VP6基因、sVP6基因的序列和pGEX-4T-1质粒载体(Invitrigen，USA)的酶切位点，设计上游引物和下游引物，为了便于与pGEX-4T-1载体连接，引物5′端分别引入BamH I或Xho I酶切位点。以A组轮状病毒的基因组DNA为模板，利用pr imer3(5′-TACGGATCCAGAACCATGGAGGTTCTGTAC-3′)和pr imer4(5′-ACGCTCGAGTCACTTAATCAACATGCTTCTAATG-3′)PCR扩增获得1.2kb的VP6基因；以pUsVP6质粒为模板，利用primer3(5′-TACGGATCCAGAACCATGGAGGTTCTGTAC-3′)和primer5(5′-ACGCTCGAGTCACTTAATCAACATGCTTCTAATG-3′)PCR扩增1.2kb的sVP6基因。
PCR扩增获得的VP6基因经BamH I和Xho I双酶切后，连接到原核表达载体pGEX-4T-1载体的BamH I/Xho I位点，构建所得原核表达质粒命名为pGVP6；PCR扩增获得的sVP6基因经BamH I和Xho I双酶切后，连接到原核表达载体pGEX-4T-1载体的BamH I/Xho I位点，所得原核表达质粒命名为pGsVP6，载体构建图如图4。
分别用重组质粒pGVP6和pGsVP6转化E.coli BL21感受态细胞(天为时代，中国)，37℃经IPTG诱导靶蛋白表达，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析靶蛋白表达情况。在图5A中，M为蛋白质分子量标准，1-3分别为pGEX-4T-1质粒转化的E.coli在未诱导、IPTG诱导3hr、5hr时的表达产物，4-6分别为pGVP6转化的E.coli的在未诱导、IPTG诱导3hr、5hr时的表达产物，7-9分别为pGsVP6转化的E.coli的在未诱导、IPTG诱导3hr、5hr时的表达产物。结果表明pGVP6和pGsVP6质粒在BL21细胞中均得到高效表达，pGVP6表达的GST-VP6和pGsVP6表达的GST-sVP6融合蛋白大小一致，均为65kDa。
用谷胱苷肽—琼脂糖树脂层析柱吸附GST-VP6和GST-sVP6融合蛋白，融合蛋白经20U/ml凝血酶酶切和缓冲液L洗脱，洗脱产物经FPLC 900快速蛋白液相色谱系统(Amershan，USA)进一步分离纯化，SDS-PAGE电泳结果表明获得了42kDa的VP6蛋白和sVP6蛋白(图5B)。在图5B中，1为从pGVP6转化的E.coli BL21中提纯的VP6蛋白，2为从pGsVP6转化的E.coli BL21中提纯的sVP6蛋白，M为蛋白质分子量标准。
4、转基因植物表达的VP6蛋白的定性和定量分析采用Western杂交和定量ELISA技术定性和定量检测VP6蛋白在转基因苜蓿中的表达量。
取pBsVP6转化的转基因植物叶片1g置于研钵中，加入1ml提取缓冲液[10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)，105mM NaCl，0.05％Tween，40mM抗坏血酸钠，20mM乙二胺四乙酸二钠，1mM PMSF]，液氮研磨。12000r/min离心10min，取上清，上清液经30％和60％的饱和(NH4)2SO4分级沉淀，获得的植物总可溶性蛋白(TSP)回溶于0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)。TSP经透析24hr后用于免疫学检测和小鼠口服免疫。植物总可溶性蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离，应用电转移装置将蛋白转移至尼龙膜上进行Western Blot免疫印迹反应。Western杂交的第一抗体为1000倍稀释的轮状病毒VP6兔抗血清，该抗血清是以轮状病毒VP6蛋白为抗原免疫兔子，按常规方法制备的；第二抗体为5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz，USA)，杂交膜洗涤3次后，用NBT/BCIP显色，观察结果。Western杂交结果如图6所示，表明在转基因苜蓿中检测到了完整的VP6蛋白，其分子量与从E.coli中提纯的VP6蛋白一致，均为42kDa。图6中，1为从重组的E.coli中提纯的VP6蛋白(阳性对照)，2为未转化的苜蓿叶片(阴性对照)，3-8为pBsVP6转化的苜蓿叶片，M为蛋白质分子量标准。
定量ELISA分析是计算转基因植株中VP6蛋白/植物总可溶性蛋白(TSP)的相对含量。取转化的和未转化的植株叶片0.2g，置液氮中研磨，研磨产物迅速转入微量离心管，加入1.0ml包被缓冲液(1.5g/L Na2CO3，2.93g/L NaHCO3)，混匀，12000rpm离心15min，取上清(植物粗蛋白提取液)，供试。首先将植物粗蛋白提取液稀释，加入考马斯亮兰溶液，混匀，室温放置2min，测定595nm的吸光值，从系列稀释的BSA标准曲线上查出样品中的总可溶性蛋白(TSP)的含量。然后，取粗提的植物总可溶性蛋白样品和用包被缓冲液系列稀释的VP6标准样品100μl，加入到酶标板小孔，37℃保温3hr。洗涤酶联板三次，加入1000倍稀释的轮状病毒VP6兔抗血清(该抗血清是以轮状病毒VP6蛋白为抗原免疫家兔，按常规方法制备的)，37℃反应1hr。洗板后加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz，USA)，37℃反应1hr。邻苯二胺-H2O2(pH5.0)显色，H2SO4终止反应，用酶标仪测定每孔样品在492nm的吸光值。在同一块酶联板上测定系列稀释的从E.coli中提纯的VP6蛋白的吸光值，建立标准曲线，将植物样品的吸光值与其比较，确定VP6蛋白在转基因植株中的含量。最后计算转基因植株中VP6蛋白/TSP的相对含量(％)。定量ELISA结果表明，转基因苜蓿植株中VP6蛋白的含量占植物总可溶性蛋白的0.06％-0.28％，最高表达量为0.28％(no.14)(图7)。图7中，1为未转化植株(阴性对照)，2-19为pBsVP6转化植株。
5快速无性扩繁的转基因苜蓿植株为了快速获得大量的转基因苜蓿，将VP6蛋白表达量较高的转基因苜蓿植株(lane 4，5，6，8，13，14，15，16，19)进行无性繁殖。取转基因苜蓿的叶片，75％酒精消毒10s，0.1％的氯化汞消毒4min，再用无菌水冲洗5～6次；切成小块放在SH愈伤培养基上培养，四周后转入SH分化培养基，培养三周，切取抗性芽转入1/2MS培养基上诱导生根，三周就可以移栽到装有蛭石土的花盆中，花盆生长两周即可种植在大田。共计三个月就获得了大量的高表达植株，足以满足动物免疫的需求。
转基因苜蓿(no.14)经无性扩繁共获得79株苜蓿植株，以这79株植物基因组DNA为模板，利用P1和P2PCR扩增sVP6基因。琼脂糖凝胶电泳结果表明，全部植株经PCR扩增均获得了1.2kb的目标片段(图8)，说明利用转基因苜蓿的叶片大量扩繁植株并不会导致目标基因的丢失。图8中，9为未转化植株(阴性对照)，1-8为pBsVP6转化植株，10为pBsVP6，作为阳性对照。紫花苜蓿是异花授粉的多年生植物，染色体为异源四倍体，获得纯合子需要较长的周期，通过叶片无性扩繁短期内就获得了大量转基因苜蓿，省去了繁琐的自交育种过程，从一个侧面证明紫花苜蓿是一种合适的植物疫苗表达系统。
实施例3、表达轮状病毒VP6蛋白的转基因苜蓿口服免疫母鼠可以使子代小鼠获得保护本研究采用主干经硫代磷酸化修饰的CpG ODN作为免疫佐剂，其序列为TCCATGACGTT CCTGACGTT(CpG ODN 1826)，由上海生工生物工程公司合成，使用剂量为10μg/次。高表达sVP6蛋白的转基因苜蓿经过无性繁殖后，三个月即可获得大量的材料用于小鼠的免疫。经30％和60％的(NH4)2SO4分级沉淀获得的转基因苜蓿叶茎总可溶性蛋白(TSP)回溶于0.1M PBS，TSP经生理盐水透析24hr后用于小鼠口服免疫。
将30只6-8周龄的BALB/c母鼠分成3组，每组10只，每周用灌胃法免疫一次，连续免疫4周(第0、7、14、21d)。用10mg非转基因苜蓿TSP混合10μgCpG ODN佐剂灌胃免疫第一组母鼠(group1)，作为阴性对照；用10mg转基因苜蓿TSP(含VP6蛋白24μg)混合10μg CpG ODN佐剂灌胃免疫第二组母鼠(group2)；用24μg提纯的VP6蛋白混合10μg CpG ODN佐剂灌胃免疫第三组母鼠(group3)，作为阳性对照。
ELISA检测是用提纯的VP6蛋白样品(20μg/ml)包被酶联板，用5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗测定抗VP6 IgG抗体效价，而用2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgA作为二抗测定小鼠产生的抗VP6IgA抗体效价。用酶标仪测定样品在492nm的吸光值；样品的吸光值是阴性对照(非转基因苜蓿TSP混合10μg CpG ODN灌胃免疫小鼠)的吸光值的2倍以上，则判定为阳性结果，抗体滴度以样品获得阳性结果的最高稀释倍数的倒数来表示。用每组小鼠的抗体滴度的平均值的倒数做柱形图，并在图中标明标准差的分析结果。
初免后第36d，对免疫母鼠眼眶采血，收集血清。第二组母鼠经10mg转基因苜蓿TSP免疫4次后，母鼠体内均检测到了高滴度的特异性的抗VP6的血清IgG抗体，抗体滴度为1/7800-1/9600；明显高于用24μg提纯的VP6蛋白免疫的第三组母鼠(抗体滴度为1/4800-1/7200)(图9A)。
每周(第0、7、14、21、28d)收集每只母鼠的唾液测定粘膜IgA抗体滴度，结果表明，每次免疫后，抗体滴度都有所增强；初免后第28d，第二组母鼠的唾液IgA抗体滴度最高可达1/480，略高于第三组母鼠(最高抗体滴度1/400)(图9C)。
每周(第0、7、14、21、28d)收集每只母鼠的粪便测定粘膜IgA抗体滴度，结果表明，抗体滴度在每次免疫后都有所增强；初免后第28d，第二组母鼠的粪便IgA抗体滴度最高可达1/240，与第三组母鼠(最高抗体滴度1/240)持平(图9D)；唾液和粪便抗体滴度的持续增加说明免疫的母鼠未出现免疫耐受现象。
初免后第60d，每组处死4只母鼠，收集小肠并匀浆，ELISA测定肠粘膜IgA抗体滴度；结果证实，第二组母鼠肠道内均产生了特异性的抗VP6的粘膜IgA抗体，滴度为1/300-1/640，明显高于第三组母鼠(抗体滴度为1/160一1/480)(图9B)。总体来看，小肠粘膜IgA抗体滴度高于唾液和粪便IgA抗体滴度。
用未转化的苜蓿TSP免疫的第一组10只母鼠体内均未检测到特异性的抗轮状病毒VP6的IgG和IgA抗体。
以上研究结果表明表达改造的sVP6基因的轮状病毒可食用疫苗能够诱导机体产生体液免疫和粘膜免疫；用CpG ODN作为口服佐剂，能有效的增强小鼠的体液免疫和粘膜免疫。
每组剩余的6只BALB/c母鼠和未免疫的BALB/c公鼠交配，经过大约19-20天的怀孕期，每只母鼠可生育4-9只小鼠。用非转基因苜蓿免疫的第一组母鼠共生育了30只乳鼠，用转基因苜蓿免疫的第二组母鼠共生育了32只乳鼠，用提纯的VP6蛋白免疫的第三组母鼠共生育了24只乳鼠。在整个实验过程中，乳鼠一直由母鼠哺乳。
由于乳鼠只在出生后的15天之内对轮状病毒引起的腹泻敏感，所以在乳鼠出生后的第五天，用猿轮状病毒SA-11对其攻毒，剂量为100 tissue cultureinfective dose(TCID)50，连续10天观察并记录小鼠的腹泻情况。
猿轮状病毒SA-11攻毒后，每天观察3次乳鼠的肛门，如果3次均没有水样粪便，便判定为不腹泻，否则就判定为腹泻；腹泻的乳鼠肛门变成红色，而且粘有大量的粪便，腹泻和不腹泻乳鼠表现出的症状差异是明显的；依据肛门变红的程度和粘有的粪便量来定性判断乳鼠的腹泻强度。
转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻症状明显减轻，肛门变红的程度和粘有的粪便量明显低于对照组(未转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠)。与对照组相比，转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻持续时间明显缩短，腹泻率(腹泻乳鼠占全部攻毒乳鼠的百分数)明显降低，在攻毒后第5天，所有的乳鼠不再腹泻，腹泻减少率(未转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻率—转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻率)达到60％；而纯化的VP6蛋白免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻持续时间略有缩短，腹泻率略有降低，在攻毒后第7天，所有的乳鼠不再腹泻，腹泻减少率(未转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻率—纯化的VP6蛋白免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻率)为25％(图10)。图10中，分数的分母为所用测试乳鼠数，分子为腹泻乳鼠数。
这项研究结果表明，转基因植物疫苗口服免疫的母鼠体内产生的抗人A组轮状病毒VP6抗体可以传递给小鼠，并且能够为小鼠提供抵抗其他A组轮状病毒的异源交叉保护。表达密码子优化的轮状病毒VP6蛋白的转基因植物疫苗有希望成为预防由A组轮状病毒引起的婴幼儿和幼畜腹泻的安全而高效的疫苗。
实施例4、轮状病毒口服疫苗的加工以苜蓿为例介绍轮状病毒口服疫苗的制备，不同的转基因植物需要不同的加工工艺来生产口服疫苗。
苜蓿是一种多年生的豆科植物，有“牧草之王”的美誉，生物量高，可以采用刈割的方法，在短时期内获得大量的转基因苜蓿材料。温室中培养的苜蓿一年可以刈割九次，收获的苜蓿嫩叶可以加工成可食用疫苗。
苜蓿叶蛋白的加工工艺如下首先采用集粉碎、打浆和压榨于一体的多功能双螺旋压榨机处理苜蓿叶片，然后采用加热凝聚法提取叶蛋白，先加热到80℃-90℃，快速冷却到40℃，滤出的凝聚物是口感良好的细胞质蛋白，可以直接供人或动物食用。只要对每一批次提取的转基因苜蓿的VP6抗原蛋白含量进行抽样，就可以获得确定剂量的植物疫苗，用于商品化生产。
序列表<160>4<210>1<211>1194<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggaggttc tgtactcatt gtctaagact cttaaagatg ctagagacaa gattgttgaa 60ggcacactct attccaatgt tagcgatctc attcagcaat tcaatcaaat gatcatgact 120atgaatggaa atgacttcca aactggaggc attggtaacc ttccagttag gaattggatc 180tttgattttg gtcttttggg tacaaccctt cttaacttgg atgctaacta tgttgaaaat 240gccagaacta ccattgagta cttcattgac tttattgaca atgtctgcat ggatgaaatg 300gcaagagagt ctcaaagaaa tggagtggct cctcaatctg aggccttgag gaaactctca 360gggatcaaat tcaagaggat caactttgat aactcctcag aatacataga aaactggaat 420ctccaaaaca gacgccagcg tactggattt gtcttccata agcctaacat atttccctac 480tcagccagct tcaccttgaa tagatctcag cccatgcatg ataacttgat gggaactatg 540tggcttaatg ctggaagtga gatccaagtg gctggttttg actattcctg tgctataaac 600gcaccagcca acatacagca gtttgagcac attgtccagc ttagacgtgc actcaccaca 660gctactatca ccttgcttcc tgatgcagaa agattcagtt tcccaagggt tatcaacagt 720gctgacgggg caactacctg gttctttaat cctgtcattc ttaggccaaa caatgtggag 780gtggagttct tgttgaatgg acagattatc aacacatacc aggctcgctt tggtaccatt 840atcgcaggaa actttgatac aattcgattg agcttccagt tgatgcgtcc acccaacatg 900acaccagctg ttaacgcact cttcccacaa gcccaacctt tccaacacca tgccacagtt 960ggactcacct tgcgcattga atctgctgtc tgcgaatcag tgcttgccga tgccaatgag1020actctgcttg ccaatgtgac cgcagtgcgt caagaatatg ctataccagt tggtcctgtt1080
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权利要求
1.轮状病毒VP6蛋白编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的DNA序列。
2.一种生产轮状病毒口服疫苗的方法，是将权利要求1所述的任一种轮状病毒VP6蛋白编码基因导入双子叶植物细胞，得到表达轮状病毒VP6蛋白的双子叶转基因植物，提取所述双子叶转基因植物的总可溶性蛋白，得到轮状病毒口服疫苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双子叶植物包括苜蓿，大豆，番茄，苹果，香蕉和胡萝卜；所述双子叶植物优选为苜蓿。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述轮状病毒VP6蛋白编码基因的5′端紧密连接有Kozak序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述Kozak序列的5′端紧密连接有烟草蚀刻病毒5′非翻译区。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述烟草蚀刻病毒5′非翻译区为自序列表中序列3。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述烟草蚀刻病毒5′非翻译区的5′端连接有带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子是下述核苷酸序列之一；1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；3)用限制性内切酶HindIII或SphI或PstI或HincII和XhoI或EcoRI酶切载体pRTL2得到的带双增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述轮状病毒VP6蛋白编码基因通过表达载体pBsVP6导入植物细胞。
10.权利要求2-9中任一权利要求所述方法生产的轮状病毒口服疫苗。
全文摘要
本发明公开了轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因及其应用。本发明的目的是提供在双子叶植物中，特别是在苜蓿中具有较高表达量的轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因及用该编码基因生产轮状病毒口服疫苗的方法及得到的轮状病毒口服疫苗。本发明所提供的轮状病毒VP6蛋白编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的DNA序列。本发明的轮状病毒口服疫苗能够用于预防多种轮状病毒感染引起的婴幼儿和幼龄牲畜的急性腹泻。
文档编号C07K14/005GK1772902SQ20051010517
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者王涛, 董江丽 申请人:中国农业大学