专利名称：水稻蛋白OsOEE3-1及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻蛋白<9^9￡^3-/及 其编码基因与应用。
背景技术：
土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。全世界共有10亿公 项的盐i威地，约占世界陆地面积7.6%，我国盐碱地近1亿多公项，农业 耕地因盐渍化引起的减产、弃耕地就近333.5万公顷。近年来，我国设施 农业的快速发展，特别是蔬菜和花卉大棚生产面积不断扩大，据统计，2005 年全国蔬菜、花卉、瓜果等作物设施栽培面积达210万公项。设施农业的 发展为农业生产结构调整和提高农业生产效益发挥了重要作用，但是随着 设施栽培时间延长，土壤次生盐渍化的问题日益加剧，严重影响了设施栽 培作物的产量和品质，效益也随之下降，从而影响设施农业的健康发展。 解决设施栽培土壤盐渍化一般采取以下两种措施， 一是用石膏和硫磺等化 学方法或用排水和灌溉洗盐等物理方法改良土壤；二是通过常规育种或生 物技术手段培育耐盐作物品种，而前者投入成本高。通过培育适宜在盐碱 地区栽培和设施栽培的农作物抗盐新品种将不仅能有效解决设施栽培土 壤盐渍化问题，而且还能通过有效利用部分盐溃化土地而大大地緩解我国 土地资源匮乏的问题。
近年来，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成，植物基因组学 研究已转入到功能基因组学。目前一些研究功能基因组学的新方法和实验 技术体系如cDNA微阵列、基因芯片、基因表达系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE )、基因敲除(gene knockout)和RNAi分析均能有 效分析大量基因的表达和功能模式，并在耐盐性相关功能基因资源发掘上 取得了一定进展。 一些与渗透调节相关基因已从不同植物种类中被成功克 隆并转化应用，如脯氨酸合成相关基因P5CS ( Kishor PBK, Hong Z， Miao G H， Hu CAA, Verma DPS. Overexpression of P5CS increases prolineproduction and confers osmotolerance in transgenic plants.尸/fl"/户/y;s/0/， 1995， 108: 1387-1394)和甜菜碱脱氢酶BADH基因(肖岗，张耕耘，刘凤 华等，山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因研究，科学通报，1995， 40(8): 741-745)。
植物体内Na+离子平衡是植物自身耐盐调节的重要机制。朱健康研究 小组发现拟南芥SOS基因系列的调控信号是植物自身调节Na+离子平衡的 重要途径之一。2005年，林鸿宣研究小组与美国栾升教授合作，成功克隆 了水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1。该基因能控制水稻植株地上部钠 离子和钾离子的含量，维持钠和钾离子平衡，使过量钠离子不在茎叶等部 位积累，并使钠离子回流到根部，减轻钠离子毒害，同时增加营养元素钾 离子，从而增加水稻耐盐性。
众所周知，水稻的基因图谱已经绘制完成，也就是所大部分水稻基因 序列是公开的，但是具体涉及到某个基因的功能是未知的，特别是某个基 因编码的蛋白以及该蛋白的对水稻产生的功能影响也是未知的。直接鉴定 某个基因的功能是非常困难的，现有手段往往是先分离出植物蛋白，检测 该蛋白的氨基,列，然后再通过氨基酸序列来比对公用数据库中的某个 基因序列，从而确定该基因的功能以及该基因的应用。
发明内容
本发明提供了一种水稻蛋白，名称为as6>￡￡3-7,它是一个受盐诱导 表达方式的蛋白，有助于提高水稻耐高盐和耐高温性能。
一种水稻蛋白，具有序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列。
该蛋白能够上调超氧物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶等 抗氧化酶活性，清除因高盐或低温胁迫产生的过多的活性氧(超氧离子或 过氧化氢)，维持细胞体内活性氧水平在正常范围内，保护幼苗、植林免 遭因高盐或高温引发的氧化损伤，提高植物抗逆能力。
根据上述水稻蛋白OsO￡￡3-7的氨基酸序列，通过NCBI和TIGER数 据库搜索，比对到编码水稻冷激蛋白的基因Os(9￡￡3-7 (^yzfl w"'va Qxygen gvolving ghancer protein R),基因OyO五五3-7的基因号为 Os07g0544800 (ID4343515 ),该基因的开放阅读框(ORF )为654 bp, 具有序列表中SEQIDNO.2所述的核苷酸序列；mRNA长度为961 bp，具有序列表中SEQIDN0.3所述的核苷酸序列。
上述基因可以应用于提高植物耐高盐和耐高温的性能，具体操作如
下
(1) 将上述基因连接Superl300载体中；
(2) 将上述重组载体通过农杆菌介导转化到目标植物；
(3) 以潮霉素B为抗性标记，结合高盐(200mMNaCl以上)和高 温(46°C)处理为选择压进行筛选，得到具有耐高盐和耐高温性能的植物。
本发明水稻蛋白可以提高水稻耐高盐和耐高温性能，将编码该蛋白的 基因导入其它植物当中，如草莓、辣椒、茄子、 一串红、非洲菊等，也有
可能提高这些植物的耐高盐和耐高温性能。通过上述手段， 一方面可以增 加作物在盐碱地上的产量，提高我国滨海地区的盐碱地的利用；另一方面 可以克服设施条件下蔬菜、花卉等植物因土壤返盐和夏季高温引起的生育 障碍，提高其产量和品质，增加农民收入。
具体实施方式
基因的获得
(1) 以杂交水稻耐盐组合汕优10号和盐敏感组合两优培九为材料， 将它们的种子播在含100 mM NaCl溶液浸湿滤纸培养亚中，置于3(TC培 养箱中发芽，每天更换盐溶液，以保持盐浓度基本一致。待幼苗生长至IO d,分别收集汕优10号和两优培九幼苗的叶片。
(2) 用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法(Salekdeh G H， Siopongco J, Wade L J, Ghareyazie B, Bennett J. A proteomic approach to analyzing drought- and salt-responsiveness in rice. FieW Cra;2002， 76 ( 2-3 ) : 199-219 )快速
提取叶总蛋白，具体#:作如下
1) 水稻叶片用液氮研磨成细粉，分装入1.5 ml离心管中，加入1 ml 蛋白提取液I (含10%三氯乙酸和0.07。/。P-巯基乙醇的丙酮溶液)在-20。C 沉淀粗蛋白lh，在4。C、 13000rpm下离心20min，取沉淀，弃上清；
2) 然后往沉淀中加入lml蛋白提取液II (含0.07。/。p-巯基乙醇的丙 酮溶液)，在-20。C悬浮粗蛋白丸1 h,在4。C、 13000 rpm下离心20min， 取沉淀，弃上清，再重复用蛋白提取液II，在相同条件下悬浮提取3次后，真空抽干沉淀；
3 )用裂解液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% Chaps (Ameresco 公司，美国)、50 mmol /LDTT ( Promega公司，美国)和0.5% pH3誦10 的40%两性电解质)溶解沉淀，裂解液用量为25pl裂解液/mg沉淀，然后 在室温下放置1 h，裂解期间不断涡旋5-6次。
(2 )才艮才居Bradford法(Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976， 72:248-54)用考马斯亮兰G-250 (Sigma公司)测定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用双 向凝胶电泳(第一向采用17 cm pH7-10的IPGs干胶条(Bio-Rad公司) 聚焦，第二向采用变性/SDS-2D-PAGE分离)分离。
第一向等电聚焦分四步进行，第一步，电压250V15min;第二步， 电压10000 V 5 h;第三步，电压10000 V， 60000 Vh;第四步，电压500 V直到结束。
在第一向等电聚焦向第二向转换时，需要平tf胶条，分两步进行，第 一步，在平衡液I (含6.0 mol/L尿素、2% SDS (Promega公司，美国)、 0.375mol /L pH 8.8 Tris-HCl (Promega公司，美国)、20%甘油和130 mmol/LDTT (Promega公司，美国))中平衡10 min;第二步，在平衡液 II (含6.0 mol/L尿素、2% SDS (Promega公司，美国)、0.375 mol /L pH 8.8 Tris-HCl (Promega公司，美国)、20%甘油和135 mmol /L碘乙酰胺)中 平衡10min,然后转移到第二向SDS-2D-PAGE胶，跑胶采用恒流，每块 胶的电流24mA，运行5-6h。
用500ml固定液(40%曱醇和10%乙酸)固定30min，然后用500ml 银氨染色液(含有3.6°/。氢氧化钠10.5 ml、 20%硝酸银9ml和5 ml氨水) 染色32-33 min，用双蒸水冲洗4次，然后用500ml显色液(含有1%柠檬 酸2.5 ml和甲醛250 ^ )显色5-12 min，最后用500 ml 5°/。醋酸终止反应5 min。
扫描后用PDQUEST (Bio-Rad公司)软件分析胶图匹配情况，结果 发现在汕优10号幼苗叶片中一个高表达蛋白点，估测其等电点和分子量 分别为pI9.8和22 KD左右。
6(3 )在胶上切下该高表达蛋白点，加入8jil 10 ng4d胰蛋白斷Trypsin, Roche,美国)进行胶内消化，然后置于4'C冰箱放置40min使胶片完全 吸收酶液，再补加10 jil 25 mM碳酸氬铵緩冲液(pH 8.0),于37。C温育 12 h,胶内蛋白质被酶解成肽段混合物。
(4 )在上述肽段混合物中加入30-50 |Lil 5% TFA ( Merk公司，德国) 于40。C提取上述酶切肽段1小时一次，再用相同体积的50% CAN和 2.5%TFA (Merk公司，德国)溶液于30。C提取1小时一次，最后用25 |ul CAN (Fischer公司，美国)超声提取一次，合并3次提取液。真空干燥， 然后用4 jil 0.5%三氟乙酸溶解，将0.6jil溶解物用基质辅助激光解吸离子 化飞行质镨(MALDI-TOF-MS )分析，获得肽质量指紋(Peptide Mass Fingerprint, PMF)图谱，查询Mascot数据库，以较高分值(117)显著 (比对分高于65 )比对到水稻OsOEE3扁l蛋白，匹配序列占总氨基酸序列 37 %。
根据已有的水稻(9sO￡￡3-7的氨基酸序列，通过NCBI和TIGER数据 库搜索，比对到编码水稻放氧增强子蛋白基因，基因号为Os07g0544800 (ID 4343515 )。该基因的开放阅读框(ORF )为654 bp, mRNA长度为 961 bp。
基因克隆与转化
以汕优10号幼苗(播后10天)总mRNA为模板，利用RT-PCR方法 扩增到(％0￡￡3-/基因的编码序列。
具体操作如下首先，将mRNA反转录成第一链cDNA,所用反转录 试剂盒为TaKaRa公司的High Fidelity PrimerScript RT-PCR Kit,反应体 系20 pl，依次加入1 pi 20 M随机引物、1 jil 10 mM dNTP、 2^1总RNA 和DEPC水至10 pi,在65。C变性5分钟，迅速在冰上冷却2分钟，稍微 离心，然后依次加入4 pi 5x PrimerScript RT buffer、 0.5|al RNase inhibitor 、 0.5^1 PrimerScript RTase和5(il DEPC水。轻拔t混合均匀，30。C反应10分 钟，42。C反应30分钟，95°C 5分钟使酶失活。为了去掉与cDNA互补的 RNA链，加入l pi RNase H在37。C温育20min， -20°(:保存。然后以第一 链cDNA为摸板扩增目的基因a (9￡￡3-7,所用扩增配对引物OsOEE3-1-F ， 5 ，-TCTAGAATGGCACAGGCAATGGCGTC-3 ，， OsOEE3誦l-R, 5,-GGTACCCTAGCCTAGCTTGGCGAGGA-3，， PCR反应体系为50 依次加入2x PCR buffer 25 fil、 2.5 mM dNTPs 4^1、反转录产物2pl、 20pM正向引物(OsOEE3-l-F) 1^1 、20(xM反 向引物(OsOEE3-l-R) 1^1、 2.5U/^ilTagDNA聚合酶0.5^d,最后加水至 50 pl。 PCR反应条件预变性94。C3min，变性98°C 10s，退火55。C 15s， 延伸72。C50s, 30个循环，最后延伸72。C 10min， 4。C保存。
将回收纯化的(％<9￡￡3-/基因的DNA与pMD19-T载体进行连接反 应，连接体系lOpl,各组分分别为0.5pl pMD19-T载体、4.5^1纯化的 0 0￡￡3-7基因的DNA、 5|il Solution I。在14。C-16。C下连接8-12小时， 然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，将OsO五五3-7基因 装入pMD19-T载体后经测序正确，用TakaRa公司生产的EcoRI和HindIII 酶切，酶切体系40 ^d，包括4 nl 10xbuffer、 8 (il已插入OsC^五3-7基因 的pMD19-T载体、1^1 Xbal、 1 pl Kpnl和26|il水，在37。C水浴中温育6 h。
作如下上述混合基因经凝胶电泳以后，从凝胶上切下所需DNA片段， 放在1.5 ml的Eppendorf管中。加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5 min， 期间轻摇Eppendorf管几次使胶完全溶化。加入10ial玻璃奶，颠倒混匀， 冰浴下放置10 min。每隔2-3 min混匀1次，12000 rpm离心30 s，吸弃上 清。加入250 pl漂洗液，用移液器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀， 12000 rpm离心30 s,吸弃上清。重复漂洗1次。用^r头将剩余的漂洗液 吸干净。然后，放置于37。C温箱千燥15-20 min。加入20 pl的无菌蒸馏水， 混匀，60。C水浴5min， 12000 rpm离心1 min，回收上清液，即为纯化的 基因0 0￡五3-/。
将回收的基因片段连入Superl300载体中，操作如下连接体系10 包括2 pl Superl300载体、6 pl纯化的OsO￡E3-/基因的DNA、 1 pl 10xT4 连接酶buffer和1 [xl T4连接酶，在4-l(TC下连接12 h,然后将连接产物 转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，提取质粒进行鉴定。
基因片段连入Superl300载体后再转入EHA105农杆菌中，操作如下 取200pl农杆菌感受态细胞，加入5-10iul构建好的质粒DNA, 30。C水浴30 min,液氮中速冻1 min, 37。C水浴5 min，然后加入1 ml YEB培养基 (1升YEB培养基含1 g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗 糖和0.5gMgS。4.7H20, pH7.0), 28。C恢复培养4h; 10000 g离心30 s, 弃上清，加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100 pg/ml卡 那霉素和125 ng/ml利福平的YEB平板(1升YEB培养基含1 g酵母提取 物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗4唐、0.5gMgS(V7H20和12g琼脂， pH7.0)上，28。C培养约48h。
经鉴定正确后(才兆取阳性克隆作为才莫板，用菌落PCR方法进行鉴定)， 通过农杆菌介导转化模式植物水稻，操作如下接种含有目的质粒的农杆 菌菌落于10 ml YEB培养基(含0.1%酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5% 蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4.7H2O、 1.2%琼脂、100吗/ml卡那霉素 和125 pg/ml利福平)中28°C 、 200 rpm震荡培养过夜，转化前一天按1:50 接种于200 ml含相同抗生素的YEB培养液中扩大培养至OD6()()为0.6-0.8。 取菌液，按1 % ~ 2%的比例，转入新配制的无抗生素的YEB液体培养基 中，6小时后，菌液OD6oo为0.2-0.5时即可用于转化。
取粳稻品种爱知旭(Oyz" ^Wva L cv Aichi Asahi)幼胚，用70%酒精浸 泡lmin,然后用0.1。/。升汞溶液灭菌30min,再用无菌水冲洗3次，置无 菌滤纸上吸干，接种于诱导培养基(NB培养基外加2 mg丄"2， 4-D)上 诱导愈伤组织11-13 d后继代，继代后4 d用于共培养。愈伤组织在含有 100 mol丄"乙酰丁香酮和含目的基因质粒的农杆菌的液体培养基中培养 20 min，用滤纸吸去多余的菌液后，转到含乙酰丁香酮的固体培养基上 26。C暗培养2 d, 经共培养的愈伤组织转移到选择培养基(NB培养基外 加2 mg丄"2， 4-D 、 50 mg丄"潮霉素B和头300 mg丄"头孢遙將)上。 10 d后挑选成活的愈伤组织进行复筛，抗性愈伤转移到分化培养基(NB 培养基外加2 mg丄-12, 4-D 、 3 mg丄"、6-BA、 0.5 mg丄"NAA、 4 mg丄"KT、 50 mg.U1潮霉素B和头300 mg.1/1头孢瘗將)上诱导出苗。培养温度26°C ， 每天光照15 h。抗性植抹转到含1/2 N6大量元素(1415 mg丄"KN03、 231.5 mg丄'1 NH4S04、 83 mg丄"CaCl2'2H20、 92.5 mg丄"MgSO4'7H20、 200 mg丄"KH2P04、 200 mg丄"FeSO4,7H20和2.2 mg丄"MnS04.4H20)的无激 素培养基上使其生根。当试管苗长到约8cm高并有发达的根系时，即可移栽入土。单抹收获T1代种子。繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因 52个4朱系。
通过农杆菌介导浸花法转化模式植物拟南齐，操作如下接种含有目 的基因质粒的农杆菌菌落于10mlYEB培养基(含0.1%酵母提取物、0.5% 牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4.7H2O、 1.2%琼脂、100 1ig/ml卡那霉素和125 pg/ml利福平)中28°C、 200 rpm震荡培养过夜， 转化前一天按1:50接种于200 ml含相同抗生素的YEB培养液中扩大培养 至OD600为1.2~1.6，约6h, 5000 g离心15 min集菌，重悬于渗透緩沖 液，使OD600为0.8， 200 ml重悬液可使用3次。转化所用浸泡液含有 0.5xMS大量元素、0.5xMS微量元素、0.5mg/LVB5、5。/。蔗糖、44nM6-BA (Sigma公司，美国)和0.03% Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司，美国)。 将200 ml含目的农杆菌的渗透转化液置于一容器中，翻转种有拟南芥的 花盆，使植抹浸入含有待转化农杆菌的渗透緩冲液中，浸5分钟，緩慢取 出花盆，侧放于托盘中，盖上黑塑料布避光24小时，第二天取下塑料布， 直立i文置花盆。
制备MS筛选平板(MS培养基外加80 g/ml潮霉素和50 g/ml氨节青 霉素)，转化收获的T1代种子经消毒后播种于筛选平板，每15cm的平板 上可以筛选IOO吗左右的拟南芥种子。4。C春化3天，平放在生长箱中培 养(22。C恒温，24h光照)，7-10天后挑选在筛选培养基上根系和地上部 生长正常的阳性植抹，移入正常MS培养基緩苗3-5天后移植入土壤，单 抹收获T2代种子。繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因60个抹系。 基因功能鉴定
(1)耐高盐性能鉴定 取T3代纯合转基因抹系和野生型(粳稻品种爱知旭)种子，均匀放 在两层用蒸馏水润湿的发芽纸上，在25。C光照条件下培养10d，观察幼苗 生长情况。然后将转基因抹系和野生型的水稻幼苗分别移入含200 mM NaCl或正常清水的发芽盒内，置于相同光温条件的培养箱中培养。培养5 d后，观察转基因抹系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发现在200 mMNaCl处理下，野生型水稻幼苗叶片出现白化表型，严重时幼苗白化 死亡，而转OsC^五3-7基因抹系叶片仍保持绿色。叶片最大光化学效率测
10定(Fv/Fm)结果表明，在200 mM NaCl下，野生型幼苗地上部最大光化 学效率显著降低，而转(％(9￡五3-7基因抹系幼苗地上部最大光化学效率未 出现明显变化，说明Oy(9五五^ 基因在水稻中超量表达可以提高水稻幼苗 耐盐性。
T3代纯合转基因林系和野生型(ecotype Columbia))拟南芥种子用1% 次氯酸钠消毒，在4。C冰箱中春化3天，然后置于温度22。C、湿度50%、 连续24h光照的培养箱中培养。培养7d后，观察幼苗生长情况。待幼苗 子叶完全展开后，将转基因抹系和野生型幼苗移入含200 mM NaCl和正常 的MS固体培养基(含lx大量元素、lx微量元素、lx铁盐、3%蔗糖和0.8% 琼脂)上，然后置于相同光温条件(22°C、湿度50%、连续24 h光照) 的培养箱中培养。培养12-15d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐 胁迫下的表型。结果发现在200mMNaCl下，野生型幼苗全部白化死亡， 转OsO五五3-7基因抹系幼苗叶片仍保持绿色，说明0 (9五￡3-/基因超量表 达可以緩解拟南芥盐害。 (2)耐高温性能鉴定
取T3代纯合转基因抹系和野生型(粳稻品种爱知旭)种子，均匀放 在两层用蒸馏水润湿的发芽纸上，在25。C光照条件下培养10d,观察幼苗 生长情况。然后将转基因林系和野生型的水稻幼苗移入46。C高温培养箱， 处理12h后，再放回到25。C光照条件下培养，4-5 d后野生型幼苗叶片出 现黄化，严重时幼苗叶片局部开始白化死亡，而转0 0￡￡3-7基因抹系叶 片仍保持正常绿色。叶片最大光化学效率测定(Fv/Fm)结果表明，野生 型幼苗地上部最大光化学效率显著降低，而转0 (9￡五3-/基因抹系幼苗地 上部最大光化学效率未出现明显变化，说明Os(9五五3-7基因在水稻中超量 表达可以提高水稻幼苗耐高温性能。
取T3代纯合转基因抹系和野生型拟南芥种子，播在塑料土盆中，在 22。C温室内培养，取生长到4周的转基因林系和野生型幼苗，在45。C低温 培养箱中处理8h,再放回到22。C温室内培养，3-4d后野生型幼苗叶片出 现失水巻曲，严重时幼苗叶片开始白化，而转OyC^五3-7基因抹系叶片仍 保持正常绿色说明基因在拟南齐中超量表达可以提高拟南芥幼 苗耐高温性能。<110>杭州市农业科学研究院
<120> 水稻蛋白OsOEE3-l及其编码基因与应用
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<160> 3
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 1
Met Ala Gin Ala Met Ala Ser Met Thr Gly Leu Ser Gin Leu Asn Gly 1 5 10 15
Val Gin Leu Pro Ala Gly Pro Arg Arg Ala Gly Gly Arg Ser Arg Leu
20 25 30
Ala Val Val Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Asp Val Gin Thr Gly Arg
35 40 45
Arg Ala Val Leu Gly Leu Val Ala Thr Gly lie Ala Gly Gly Ala Leu
50 55 60
Ala Gin Ala Ala Leu Ala GIu Ala Ala Lys Pro lie Lys Leu Gly Pro 65 70 75 80
Pro Pro Pro Pro Ser Gly Gly Leu Pro Gly Thr Leu Asn Ser Asp Gin 85 90 95
12Ala Arg Asp Thr Asp Leu Pro Leu Arg Glu Arg Phe Tyr Leu Gin Pro
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Lys Glu Ser Ala Gin Asp
115 120 125
lie lie Asn Leu Lys Pro Leu lie Glu Lys Lys Gin Tip Pro Phe Val
130 135 140
Arg Asp Asp Leu Arg Leu Arg Ala Ser Tyr Leu Arg Tyr Asp Leu Lys 145 150 155 160
Thr Val lie Asn Ser Lys Pro Lys Asp Glu Lys Lys Gly Leu Lys Asp 165 170 175
Leu Thr Gly Lys Leu Phe Ala Thr lie Asp Gly Leu Asp His Ala Ala
180 185 190
Lys lie Lys Ser Pro Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Tyr Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Ser Ala Leu Gly Asp Val Leu Ala Lys Leu Gly 210 215
<210> 2
<211> 654
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 2
atggcac鄉caatggcgtc catgaccggg ctgtcgc鄉gcgtgcagct gccggccggg 60
cccaggcgcg ccggcggcag gtccaggctc gccgtcgtca gggccgacgc cgccgccgcc 120
gacgtccaga ccggccgccg cgccgtgctc ggcctcgtcg ccaccgggat cgccggcggc 180
gccctcgcgc aggcggcgct cgccgaggcc gccaagccca tcaagctcgg ccccccgcca 240
ccgccctccg gtggactccc tgggacgctg aactoggacc aggcgaggga cacggacctg 300
ccgctgaggg aaaggttcta cctgcagccg ctgccgccgg cggaggcggc ggcgagggcg 360
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atcaactcca agcccaagga cgagaagaag ggcctcaagg acctcaccgg caagctcttc 540
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<212〉 RNA
<213> 水稻
<400> 3
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caacuccaag cccaaggacg agaagaaggg ccucaaggac cucaccggca agcucuucgc 600
caccauugac gggcuugacc augcagccaa gaucaagagc cccgaagagg cggagaagua 660
cuacacguug accaaaucug cucuuggcga uguccucgcc aagcuaggcu aggaucggca 720
uaauggccau augggguuuc gguguuuuua uguuuguuca uauggaaccg gcaauguacc 780
cuccauguug auauuguauc agcaagcacu uacguaugau ucaaucuuga guuguuguug 840
acggcuaaau cuccaagcag gcgcgauuau cagaaaacaa gggagaaauc caaaaguucu 900
gaacaaaauc aucgcauaau ucauucauau ucagaagcau cauuucacau cacaaguuua 960
权利要求
1、一种水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
2、 一种编码权利要求1所述的水稻蛋白的基因，具有序列表中SEQID N0.2所述的核苦酸序列。
3、 编码权利要求1所述的水稻蛋白的基因在提高植物耐高盐和耐高 温性能中的应用。
4、 根据权利要求3所述的应用，包括以下步骤(1) 将编码所述的水稻蛋白的基因连接到载体中，得到重组载体；(2) 将重组载体通过农杆菌介导转化到植物中；(3) 筛选得到具有耐高盐和耐高温性能的植抹。
5、 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的载体为Superl300 载体。
6、 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的植物为水 稻、草莓、辣椒、茄子、 一串红和非洲菊。
全文摘要
本发明提供公开了一种水稻耐盐蛋白OsOEE3-1，具有序列表中SEQID NO.1所述的氨基酸序列。本发明蛋白在水稻幼苗中得到过量表达，可以提高水稻幼苗耐高盐和高温能力。若将编码该蛋白的基因转化拟南芥、辣椒、茄子、草莓、一串红、非洲菊等蔬菜、花卉等植物，有可能提高其耐高盐和高温性能，有助于增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我国滨海地区的盐碱地的利用；克服设施条件下因土壤返盐或高温引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质，促进农业增效和农民增收。
文档编号C07K14/415GK101445552SQ20081016381
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者何俊平, 雅 忻, 来文国, 王世恒, 王淑珍, 白宇杰, 童建新, 郑桂珍, 阮松林, 马华升 申请人:杭州市农业科学研究院