用于鉴定样品中细菌的挥发性有机化合物的快速检测的制作方法

专利名称：用于鉴定样品中细菌的挥发性有机化合物的快速检测的制作方法
技术领域：
在各种实施方式中，本发明涉及用于检测样品中一种或多种挥发性有机化合物 (本文也称为“V0C”或“有机化合物”)的方法以确定样品中的一种或多种细菌的有无。
背景技术：
细菌感染、细菌污染和耐药细菌传播的发生为不断增长的全球性健康问题。例如， 在全世界范围内估计每年发生超过880万的肺结核新病例。最新的报道也强调了肺结核抗 性株的出现，其对使用公共交通工具(如商业性飞机)的旅客构成了危险。细菌的有无、细 菌量或细菌的细菌负荷量及细菌抗性株(如肺结核)的快速检测为卫生组织(如世界卫生 组织)当务之急。目前检测细菌有无的方法通常包括培养疑似含有细菌的样品并随后分离，及使用 各种生化试验。依据分离和培养所述细菌所耗的时间，所述测试需耗时2 21天来完成。 因此，尽管所述生化试验相对便宜，但生长和继代培养样品中的细菌以达到测试细菌所需 的最低浓度是耗时的。有用于快速检测细菌的基于PCR的方法，但其通常是昂贵的且需要先进的实验室 设备和技术及使用的各种试剂。此外，通常有样品的频繁污染，其妨碍了在资源非常有限的 环境中的使用。作为例子，结核分枝杆菌(本文也称为“TB”、“MTb”或“M. tuberculosis”)MTb诊 断标准近百年来没有显著的变化。至于研发出新型MTb诊断，对大规模的使用(例如在第 三世界国家中)而言，其通常是不实际的。一用于活性肺结核诊断的标准为抗酸杆菌痰涂 片镜检。如果患者痰被测试为MTb阳性(认为“涂片阳性”)，则其患有活性肺结核、被认为 有高传染性，且为其安排了用于治疗的全面药物疗程。然而，痰涂片镜检有低敏感性且通常 需要经适当培训的人员来完成。实际上，估计痰涂片镜检至多检测患有活性肺结核患者的 25% 60%。因其需要至少10，000个MTb杆菌/ml的存在，所述方法也具有相对差的检测 限制。用于MTb诊断的血清学测试确实存在，但其需继续进行开发且相比活动性疾病， 更特异于接触。一些商业化的测试使用免疫显性的抗原以用ELISA或浸渍片形式检测免疫 球蛋白类(如IgG)。估计血清学测试可检测痰涂片阳性的MTb病例的1/3 3/4。其用 HIV共感染可检测显著较少部分的涂片阴性病例。实际上，对兼感染了 HIV和MTb的患者而 言，血清学测试可检测少于1/3的患有所述疾病活动形式的患者。已开发出噬菌体系统，其可使用通过感染和在MTb细胞中复制而作为指示物的噬菌体检测液体培养中活的分枝杆菌。噬菌体系统是快速、稳健和高灵敏性的，但对其重复性 和性能所知很少。尽管噬菌体系统因其快速、稳健和高灵敏性而有很好的前景，但使用时通 常需要专业技术人员，而结果其非常昂贵。因此，在发展中国家所述系统可能不适于很好的 广泛使用。通常在III级实验室使用的放射性和荧光液体培养系统是高灵敏性的，也需要完 整的微生物实验室的支持并通常需要相对长的时间(1 3周)以生成结果，且购买其相对 昂贵。尽管放射性液体培养系统稳健且灵敏，但需要放射性物质，因此其通常需要用于其使 用的特殊设施和培训。其物质的成本会非常高且所述系统不便携。也开发了一些非标准化培养系统，其采用廉价的试剂且更适合于广泛的使用，但 需要更多的研究以确定这些系统的准确性。至少已证明了其与标准诊断水平相当的性能水 平。采用廉价试剂的非商业性液体培养生长检测方法更适合于在发展中国家中使用，但其 还没有标准化，因此其未被TB诊断专家欣然认同。它们可受益于试剂、包装和产品支持的 标准化。核酸扩增(NAA)系统已在工业化国家使用了一段时间，且FDA已批准了用于痰中 MTb检测的两个系统。NAA比涂片镜检测试灵敏性高，但比培养灵敏性低。尽管NAA好于涂 片镜检，但其昂贵并需要大量的技术支持和质量控制。例如，使用于诊断和药物抗性测定的 细菌的快速测序(即使用PCR)难于使其在野外使用时便携和稳健。其通常需要大量的动 力和经特别处理(即冷藏)的试剂。另外，即使在严格管理的实验室仍有可能污染而导致 假阳性测试。对在高需求(发展中)国家中使用的系统而言，所述原因使其成为不可能的 目标。另一种常见的MTb测试为结核菌素或纯化的蛋白衍生物(PPD) (PPD皮试)，其为研 发用于筛选潜伏的MTb的皮试。其他的用于潜伏的MTb的筛选包括测量由从MTb、鸟分支 杆菌和牛分支杆菌获得的PPDs刺激后的全血中的T淋巴细胞产生的IFN-Y的新型体外测 定。也使用单独的特异性抗原以提高特异性。所述结核菌素或PPD皮试与普通的肺结核疫 苗、卡介苗(“BCG”)和环境细菌共用许多抗原，所以未被潜伏的MTb感染的人常被测试为 阳性。由于临床医生解释结果和患者的多次就诊以获得结果的需要使所述方法进一步复杂 化。在许多患者(包括已接种了 MTb疫苗的患者或用其他类型的分枝杆菌感染的患者)中 所述皮试经常得到不可靠的结果。当HIV/AIDS患者也是MTb的携带者时，其经常被测试为 阴性。尽管研发中的其他皮试(如测量IFN-γ的皮试)不完美且提高所述测试的特异性 通常以灵敏性为代价，但其更特异。因此，需要快速的床旁诊断化验细菌检测装置、方法和系统(例如以筛选疑似感 染一种或多种细菌的患者)。优选地，所述装置、方法和系统可用于野外，例如现场快速监测 人或动物的细菌感染(例如在发展中国家或脱离实验室环境的任何场所)、确定环境中细 菌的存在或测试工业环境中的细菌。发明概述在各种实施方式中，本发明通过利用某些VOC的灵敏检测以鉴定样品中某些细菌 的存在从而解决了目前细菌诊断和鉴定的限制。其允许在实验室外的环境中进行例如细菌 感染的诊断、药物疗效的确定和/或耐药细菌株的诊断。所述细菌可包括，例如，结核分枝 杆菌、金黄色葡萄球菌(本文也称为“Staph”或“S. aureus”)、肺炎克雷伯菌(本文也称为“Kleb”或“K. pneumonia")和/或大肠杆菌(本文也称为“E. coli”)。不受任何理论限制， 认为某些VOC与细菌的代谢相关，因此可使用其进行检测从培养物中分离或从存在的多种 类型细菌中分离的存活的、近来存活的或生长的细菌。因此，在各种实施方式中，本发明涉及检测与特定细菌的代谢、存在和/或生长有 关的一种或多种VOC以检测样品中细菌和/或相关细菌株的有无、浓度、状态(如存活、生 长等)和/或抗性数据。可使用便携式装置(例如床旁诊断化验装置(如但不限于微分迁 移率光谱仪(“DMS”)))检测一种或多种的V0C。可直接从来源(例如人或动物的呼出气 (例如疑似患有肺结核(再活化的或原发的))或从自然环境或工业来源释放的气体)直接 检测一种或多种的V0C。可从固体或液体样品(例如从身体来源、从自然环境来源和/或工 业来源)产生所述V0C。来源可为例如来自身体、水或土壤样品和/或工业产品或废物流样 品的组织或流体(例如尿液、汗液、血液、痰和/或冷凝液)。一方面，本发明涉及用于鉴定样品中结核分枝杆菌有无的方法。所述方法的实施 方式包括收集疑似具有结核分枝杆菌的样品；及检测一种或多种指示样品中结核分枝杆 菌有无的挥发性有机化合物的有无。所述有机化合物可以是，或包括甲氧基苯(苯甲醚) (CAS 100-66-3)、2_ 丁酮(CAS :513-86_0)、2_乙基己酸甲酯(例如，手性形式的2-乙基 己酸甲酯(CAS :816-19-3))、丙酸甲酯(CAS :554-12_1)、2_ 戊酮、3-戊酮(CAS :96-22_0)、 2，4_ 二甲基-1-庚烯、甲基异丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二甲基亚砜、二甲基硫、 2-甲基丙酸甲酯(CAS :547-63-7)、1-乙氧基-2-甲基丙烷(CAS :627-02_1)、1-乙氧基丁 烷(CAS :628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637_92_3)、2_ 甲基丁酸甲酯(868-57-5)、异丁醇 (CAS 78-83-1)和/或图22中的质谱代表的芳香族化合物。另一方面，本发明涉及用于鉴定样品中金黄色葡萄球菌有无的方法。所述方法 的实施方式包括收集疑似具有金黄色葡萄球菌的样品；及检测一种或多种指示样品中金 黄色葡萄球菌有无的挥发性有机化合物的有无。所述有机化合物可以是，或包括甲硫醇 (CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18_3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羟基-2-丁 酮(CAS 513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS :122-78_1)。另一方面，本发明涉及用于鉴定样品中肺炎克雷伯菌有无的方法。所述方法的实 施方式包括收集疑似含有肺炎克雷伯菌的样品；及检测一种或多种指示样品中肺炎克雷 伯菌有无的挥发性有机化合物的有无。所述有机化合物可以是甲硫醇(CAS:74-93-l)、 2-庚酮(CAS 110-43-0)、2_ 壬酮(CAS :821-55_6)和 2- ^^一烷酮(CAS :112-12_9)。另一方面，本发明涉及用于鉴定样品中大肠杆菌有无的方法。所述方法的实施方 式包括收集疑似含有大肠杆菌的样品；及检测一种或多种指示样品中大肠杆菌有无的挥 发性有机化合物的有无。所述有机化合物可以是，或包括甲硫醇(CAS:74-93-l)、二甲基 二硫化物(CAS 75-18-3)和吲哚(CAS 120-72-9)。在所述任一方面，可检测一种或多种挥发性有机化合物的浓度。样品中检测到的 有机化合物的存在或浓度可指示特定细菌的存在、浓度、状态(如存活、生长等)和/或表 型特征(抗生素抗性、株系等)。在某些实施方式中，一种或多种有机化合物的至少一部分 对样品中的细菌(例如被检测到的细菌)是唯一的。在某些实施方式中，可在气相中检测 有机化合物。所述样品本身即可为气相。例如来自个体的呼出气，或者与固体或液体样品 (例如在培养物或培养基中生长的样品)混合的气体，或者由固体或液体样品产生的气体。
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可由任何来源获得所述样品，例如来自个体的呼出气。所述呼吸可包括来自个体 的体液。另外，所述样品可包括流体，例如与个体呼吸相关的体液、痰液、血液、尿液或胸膜 液。在某些实施方式中，所述样品包括固体物质，例如组织或排泄物。在某些实施方式中， 所述样品可来自自然环境或工业环境，例如土壤、水、经加工食品和/或加工废物流。所述样品可包括暴露于用于处理细菌的候选治疗的细菌以检测细菌的抗治疗株。 所述候选治疗可为候选药物(例如抗生素)，且所述细菌的抗治疗株可抗所述药物。可立 即分析所述样品的挥发性有机化合物。另外，可培养所述样品，并分析培养样品的液上空间 的挥发性有机化合物。检测到的指示细菌的挥发性有机化合物可为不论培养条件(例如在 培养基内容)的相同化合物或所述化合物对在特定培养条件下生长的细菌有特异性。在各 种实施方式中，本发明涉及用于鉴定样品中细菌(如结核分枝杆菌)的方法。所述方法包 括收集疑似含有细菌的样品、使用特定培养基(例如包含丙酸盐的培养基)培养样品；及 检测与在特定的培养基上的细菌代谢有关的，且指示所述培养样品中所述细菌的存在，或 者对所述样品中所述细菌的治疗或抗性的应答的一种或多种挥发性有机物。在各种实施方式中，本发明涉及用于鉴定样品中某种细菌的装置。所述装置可包 括用于接收疑似有某种细菌的样品的输入部；和用于检测指示所述样品中所述细菌的存 在、或者对所述样品中所述细菌的治疗或抗性的应答的一种或多种挥发性有机化合物的工 具。一方面，所述装置鉴定样品中的结核分枝杆菌，且所述一种或多种挥发性有机化合物包 括甲氧基苯(苯甲醚)(CAS :100-66-3)、2-丁酮(CAS :513-86_0)、2_乙基己酸甲酯(例 如，手性形式的2-乙基己酸甲酯(CAS :816-19-3))、丙酸甲酯(CAS :554_12_1)、2_戊酮、 3-戊酮(CAS 96-22-0) ,2,4- 二甲基-1-庚烯、甲基异丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、 二甲基亚砜、二甲基硫、2-甲基丙酸甲酯(CAS 547-63-7)、1_乙氧基_2_甲基丙烷(CAS 627-02-1)、1_ 乙氧基丁烷(CAS :628_81_9)、叔丁基乙醚(CAS :637-92_3)、2_ 甲基丁酸甲 酯(868-57-5)、异丁醇(CAS :78-83-1)和/或图22中的质谱代表的芳香族化合物。另 一方面，所述装置鉴定样品中的金黄色葡萄球菌，且所述一种或多种有机化合物包括甲 硫醇(CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18-3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羟 基-2-丁酮(CAS :513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS 122-78-1)。另 一方面，所述装置鉴定样品中的肺炎克雷伯菌，且所述一种或多种有机化合物包括甲硫醇 (CAS 74-93-1)、2-庚酮(CAS 110-43-0)、2_ 壬酮(CAS :821-55_6)和 2- ^^一烷酮(CAS 112-12-9)。另一方面，所述装置鉴定样品中的大肠杆菌，且所述一种或多种有机化合物包 括甲硫醇(CAS 74-93-1)、二 甲基二硫化物(CAS :75-18_3)和吲哚(CAS 120-72-9)。在 任一方面，一种或多种有机化合物的存在可指示样品中相应细菌的存在，或者对所述样品 中所述相应细菌的治疗或抗性的应答。另外或此外，无一种或多种有机化合物可指示样品 中无相应细菌，或者对所述样品中所述相应细菌的治疗或抗性的应答。在某些实施方式中，基于在样品中检测到的有机化合物的存在和/或浓度鉴定样 品中细菌的存在或量。在某些实施方式中，基于样品中检测到的两种或多种有机化合物的 存在或浓度来测定样品中细菌的存在或量。在某些实施方式中，可在不同的时间点(例如 施用治疗后)鉴定样品中细菌的存在或量以便鉴定在细菌负荷和/或治疗效力上的变化。认为上述的各种实施方式的特征不相互排斥且可以各种组合和排列存在。附图简述
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通过涉及使用与相应的附图相结合的下列说明更好的理解本发明实施方式的上 述和其他目的、方面、特征和优势且使其更明显，其中图IA描述了快速诊断结核病(和/或其他细菌)和确定结核病(和/或其他细 菌)治疗抗性的VOC分析的实施方式的流程图；图IB示用于检测来自样品液上空间的VOC的例示方法；图2A为DMS的一实施方式的原理框图；图2B为当离子流经图2A的DMS时的离子的示意图；如实施例1所述，图3A和3B描述了例示DMS输出的放大区以示对应于与匹配的 培养基对照相比的在MTb样品中存在的峰的特征；图4描述了示从匹配的培养基对照中区分MTb的特征之间的分离的例示盒式图；图5A描述了 MTb (线100)对比丙酸盐培养基(线102)的总离子色谱图(“TIC”) 的例示比较；图5B描述了 MTb (线103)和培养基对照(线104) TIC (左图)对比耻垢分支杆菌 (线105)和培养基对照(线106)TIC(右图)的例示比较；图5C示鉴定的VOC的DMS优化的例示结果。具体而言，由纯化的标准物制备五种 鉴定的VOC的混合物，并在DMS上运行。左侧的图像示以前的运行参数而右侧的示当传感 器温度变为40°C时在DMS中更易鉴定所述化合物；图6A 6E示MTb样品和匹配的培养基对照的例示叠加气相色谱_质谱(“GC-MS”) 色谱图，其中图6B 6E示在图6A所示的总色谱图的部分；图7描述了丙酸甲酯的美国标准技术研究院(“NIST”)主库质谱和MTb峰1的例 示头-尾比较作为分析的一部分以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的丙酸甲 酯；图8描述了乙醇中丙酸甲酯的重复注射的例示色谱图作为分析的一部分以鉴定 作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的丙酸甲酯；图9描述了甲醇中标准物2- 丁酮的重复注射的例示色谱图作为分析的一部分以 鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的2-丁酮；

图10描述了 2- 丁酮和C14H24O的NIST主库质谱的例示头-尾比较作为分析的一 部分以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的2- 丁酮；图11描述了乙醇中标准物3-戊酮的重复注射的例示色谱图作为分析的一部分以 鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的3-戊酮；图12描述了 MTb和标准物3-戊酮叠加谱的例示色谱图作为分析的一部分以鉴定 作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的3-戊酮；图13描述了甲醇中2-戊酮标准物的重复注射的例示色谱图作为分析的一部分以 鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的2-戊酮；图14描述了 2-戊酮和标准物2-戊酮的NIST主库质谱的例示头-尾比较作为分 析的一部分以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的2-戊酮；图15描述了 2-甲基-N，N- 二异丙基丙酰胺和标准物2_戊酮的NIST主库质谱的 例示头-尾比较作为分析的一部分以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的2-戊 酮；
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图16描述了 1-氨基-2-甲基吡啶氢氧化物和甲氧基苯(苯甲醚)的NIST主库 质谱的例示头-尾比较作为分析的一部分以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物 的苯甲醚；图17描述了甲醇中甲氧基苯标准物的重复注射的例示色谱图作为分析的一部分 以鉴定作为样品中结核分枝杆菌的指示化合物的苯甲醚；图18A和18B示对于三种不同细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌及 对照的分别来自DMS和GC-MS的例示DMS和色谱输出；图19A和19B描述了对于下列样品的分别来自DMS和GC-MS的例示DMS和色谱输 出(i)大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的混合物，( )金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯 菌的混合物，(iii)仅金黄色葡萄球菌和(iv)培养基对照样品；图20描述了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的例示GC-MS色谱图的叠 加部分，其与特异于大肠杆菌或肺炎克雷伯菌的特定VOC相关；图21描述了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的例示GC-MS色谱图的叠 加部分，其与特异于金黄色葡萄球菌的特定VOC相关；图22描述了 MTb培养物中检测到的不论培养基中的脂质成分的挥发性芳香族化 合物的VOC的例示质谱的光谱图样；图23描述了示图22中代表挥发性芳香族化合物的峰的耻垢、Mtb和培养基对照 的例示TIC的叠加部分。可在用培养基中的三种不同脂质成分培养的MTb培养物中检测到 所述化合物；图24A描述了用含有不同浓度丙酸钠的培养基制备的MTb培养物的例示TIC的叠 加部分，并示挥发性有机化合物、丙酸甲酯的峰。图24B为描述从图24A中的TIC峰区发出 的丙酸甲酯信号强度的柱形图；及图25描述了用含有碳来源的混合物的培养基制备的MTb培养物的例示TIC的叠 加部分。发明详述在各种实施方式中，本发明涉及改进的鉴定样品中细菌的方法，并允许某些细菌 感染或污染的快速和准确诊断。此外，本发明的实施方式允许药物(如抗生素)效力的确 定和/或某些耐药细菌菌株的诊断。更具体而言，可通过检测与MTb存在或数量有关的V0C(例如与MTb代谢有关的 V0C)的存在或数量来鉴定样品中的MTb。所述VOC包括，但不限于甲氧基苯(苯甲醚) (CAS 100-66-3)、2_ 丁酮(CAS :78-93_3)、手性形式的 2-乙基己酸甲酯(CAS :816-19_3)、 丙酸甲酯(CAS :554-12-1)、2_ 戊酮(CAS 107-87-9)、3-戊酮(CAS :96-22_0)、2，4-二甲 基-1-庚烯(CAS 19549-87-2)、甲基异丁基酮(CAS 108-10-1)、6_ 甲基-5-庚烯-2-酮 (CAS :110-93-0)、二 甲基亚砜(CAS :67-68_5)、二 甲基硫(CAS :75-18_3)、2-甲基丙酸 甲酯(CAS 547-63-7)、乙氧基 _2_ 甲基丙烷(CAS :627_02_1)、乙氧基丁烷(CAS 628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637-92_3)、2_ 甲基丁酸甲酯(868-57-5)、异丁醇(CAS 78-83-1)和/或图22中的质谱代表的芳香族化合物。可使用所述VOC中的任一种或这些 VOC的任意组合来指示样品中MTb和/或相关的细菌株的存在、浓度和/或状态(如存活、 生长等)。另外，可使用无一种或多种V0C，或者一种或多种VOC的浓度低于阈值的鉴定来确定样品中无细菌。可通过检测与金黄色葡萄球菌存在或数量有关的VOC(例如与金黄色葡萄球菌代 谢有关的V0C)的存在或数量来鉴定样品中的金黄色葡萄球菌。所述VOC包括，但不限于 甲硫醇(CAS :74-93-1)、二甲基硫醚(CAS :75-18-3)、2，3-丁二酮(CAS :431-03_8)、3_ 羟 基-2- 丁酮(CAS 513-86-0)、醋酸丁酯(CAS 123-86-4)和苯乙醛(CAS 122-78-1)。可使 用所述VOC中的任一种或所述VOC的组合来指示样品中金黄色葡萄球菌和/或相关细菌株 的存在、浓度和/或状态(如存活、生长等)。另外，可使用无一种或多种V0C，或者一种或 多种VOC的浓度低于阈值的鉴定来确定样品中无细菌。可通过检测与肺炎克雷伯菌存在或数量有关的VOC(例如与肺炎克雷伯菌代谢有 关的V0C)的存在或数量来鉴定样品中的肺炎克雷伯菌。所述VOC包括，但不限于甲硫醇 (CAS :74-93-1)、2_ 庚酮(CAS 110-43-0)、2-壬酮(821-55-6)和 2—^一烷酮(112-12-9)。 可使用所述VOC中的任一种或这些VOC的任意组合来指示样品中肺炎克雷伯菌和/或相关 的细菌株的存在、浓度和/或状态(如存活、生长等)。另外，可使用无一种或多种V0C，或 者一种或多种VOC的浓度低于阈值的鉴定来确定样品中无细菌。可通过检测与大肠杆菌存在或数量有关的VOC (例如与大肠杆菌代谢有关的V0C) 的存在或数量来鉴定样品中的大肠杆菌。所述VOC包括，但不限于甲硫醇(CAS :74-93-1)、 二甲基二硫化物(CAS 75-18-3)和吲哚(CAS 120-72-9)。可使用所述VOC中的任一种或这 些VOC的任意组合来指示样品中大肠杆菌和/或相关细菌株的存在、浓度和/或状态(如 存活、生长等)。另外，可使用无一种或多种V0C，或者一种或多种VOC的浓度低于阈值的鉴 定来确定样品中无细菌。1.样品收集和处理可将样品收集为固体、液体和/或气体，并对其进行处理以确定指示样品中特定 细菌存在的一种或多种VOC的有无。可直接分析样品的一种或多种V0C，例如从疑似患有 肺部感染的患者的呼吸。另外，可在适合的生长培养基中培养所述样品以允许样品中细菌 的生长和代谢。在某些实施方式中，本发明涉及从个体中取出痰样品，并例如用微流体将其 放置在培养基中，或例如用常规培养方法将其放置在培养物中。如果存在细菌，则刺激其代 谢，可收集由所述代谢所产生的液上空间(气相)并可测试指示所述生长培养基中细菌的 至少一种代谢物的存在。在图IA中描述了样品收集和处理的一例示实施方式。在所述图中1.从受试者 肺中疑似藏有有害细菌(例如MTb)的受试者收集痰样品；2.将所述痰样品转移至收集孔 并为其提供培养基以刺激样品中细菌的代谢；3.可选地，对于已知含有特定细菌(如MTb) 的样品而言，可添加候选抗生素到收集孔中的痰和培养基以测试抗生素的效力或细菌抗抗 生素的抗性；和4.用检测系统的传感器密封所述收集孔，并(例如，由细菌的代谢)产生了 气体液上空间。检测液上空间中的一种或多种挥发性有机化合物以诊断细菌的感染或抗生 素的效力。在图IB中描述了样品处理的第二个例示实施方式。在所述图中1.用重复物和匹 配的培养基对照制备培养的样品；2.将温育样品液上空间中的挥发性有机化合物吸收至 集中的固相微萃取(SPME)纤维；3.加热所述SPME纤维并将挥发性有机化合物吸收进一个 或多个检测系统(例如GC-MS检测系统、DMS检测系统或GC-MS/DMS双系统)，并获取数据；和4.针对区分样品中特定细菌的特征(例如一种或多种V0C)对输出数据进行分析。当采 用所述GC-MS/DMS双检测时，可利用从任一系统获得的数据库信息与从两个系统获得的数 据进行比较。可从包括生物、自然环境和工业来源的各种来源获得样品。生物的样品可包括，例 如直接来自个体或来自呼吸机(如通气机)的呼出气、来自呼出气或身体气体的冷凝物、 痰、尿、汗液、血液、血浆、血清、唾液、精液、组织液、脑脊液、在肾脏透析中获得的透析液、眼 泪、粘液、羊水、组织和粪便物。自然环境的样品可包括，例如土壤、水(如河水、池塘水、湖泊水、地下水、污水、饮 用水、游泳池水)、来自医院或公共建筑物表面的拭子、建筑物内或目的近点(例如空气管 道)的空气样品、来自空气过滤器、空调和通风系统、或通风系统的样品及尘埃样品。工业的样品可包括，例如食品、饮料或药物之类的工业产品、来自制造过程的废物 流及从制造表面或空间收集的拭子或气体。在某些实施方式中，传感器确定在气相中的液上空间VOC的有无、或浓度以确定 在样品中是否有存活的细菌。因此，设计样品容器以阻止样品容器气体的释放或周围气体 引入到样品容器内。如果也添加了已知的抑制或杀死细菌的抗生素到培养基，然后存活的 细菌可表明样品中抗性细菌的存在。因此，使用所述方法可筛选潜在的抗生素。可在培养基或培养物中培养样品中的细菌，且可选择性地使所述培养基-或培养 物-培养的细菌接受用于处理细菌的候选治疗(例如抗生素之类的候选药物)。可将样品 培养使产生VOC的任意时间。例如可培养样品少于2小时、2 4小时、4 6小时、6 10 小时、多于10小时或多于24小时。所述培养物可包括任何已知的细菌培养基，例如葡萄糖、 脂质、短链脂肪酸(如丙酸、胆固醇和/或棕榈酸)等。在某些实施方式中，检测到的VOC对 在特定的培养基中培养的特定细菌是特异性的。例如，所述方法可包括收集含有特定细菌 (如MTb)的样品、在特定的培养基(如丙酸盐培养基)上培养所述细菌，及检测指示在特定 培养基上生长的样品中细菌的存在的至少一种挥发性有机化合物。例如，当在丙酸盐中培 养结核分枝杆菌时，所述有机化合物可为或包括丙酸甲酯(CAS号554-12-1)、2_甲基丙 酸甲酯(CAS号547-63-7)、甲基-2-乙基己酸(816-19-3)和/或图22中的质谱代表的芳 香族化合物。此外，在生长培养基中可包括不同浓度的丙酸盐和/或丙酸盐与其他碳源的 混合物以优化用于检测样品中特定细菌(例如MTb)的存在或对其进行定量的特定VOC的 检测和/或产生。在其他的实施方式中，不论培养基的成分，检测到的VOC为相同的V0C。2.挥发性有机化合物检测可使用各种技术检测所述一种或多种V0C，其包括但不限于气相色谱法(GC)、光 谱测定法(例如质谱(包括四级子、飞行时间、串联质谱、离子回旋共振和/或扇区(磁性 和/或静电))、离子迁移谱、不对称场离子迁移谱和/或DMS)、燃料电池电极、光吸收光谱、 纳米粒子技术、弯曲板波(FPW)传感器、模拟自然发生的细胞机制的生物传感器、电化学传 感器、光声设备、基于激光的设备、电子鼻(生物来源的、表面涂层的)、各种电离技术和/或 受过训练的动物的检测。在某些实施方式中，本发明为对现有用于细菌检测的方法的改良。例如，MTb检测 的痰涂片方法依赖于镜检以检测MTb的存在，且具有较低的10，OOOMTb杆菌/mL的检测限， 而培养的方法具有较低的IO5 IO6杆菌/mL的检测限。然而，本发明的实施方式不需要镜检且具有低至IO3杆菌/mL的较低的检测限。本发明的实施方式超越标准培养方法的一特 有优势为用于分析的时间。使用目前培养的方法通常需耗时1 4周确定TB的存在或抗 性，而痰和呼吸样品的挥发性分析都可在数分钟至数小时内产生结果。为达到培养的样品 能在培养物表面上产生VOC的程度，无需与现有方法一样的几星期而可在几小时到几天左 右获得足够的培养物。此外，如果不管抗生素的添加而测量细菌生长，本发明的实施方式允 许药物抗性的快速检测。因为本发明的实施方式利用与活细菌有关的VOC的检测，其也具 有提高灵敏性和选择性的能力。所述选择性源自于仅活细菌可进行活性代谢的事实，因此 相对于血清学或其他类似的有敏感性的技术，其将提供标记但不区分过去的和本次暴露。 所述比其他方法(如涂片镜检)提高的灵敏性来自于目前的离子质谱分析仪的能力以检测 从百万分之几到万亿分之几的敏感性范围。因此，具有挥发性化合物的已知特征能利用所 述质谱分析仪的提高的灵敏性。在某些实施方式中，可使用床旁诊断化验诊断工具来鉴定细菌的VOC生物标记 物。优选床旁诊断化验诊断工具(如微型机械化DMS)为便携的且可检测VOC至低的检测 限。下述的实施例4描述了通过使用便携式的方法检测一种或多种的VOC和/或VOC的光 谱图样以鉴定复杂的临床样品中细菌的存在的方法。因此，在某些实施方式中，本发明包括 VOC的数据库和用于鉴定从一种或多种来源获得的样品中的细菌的床旁诊断化验诊断工具 的相关信息。2A.微分迁移率光谱法在某些实施方式中，用于检测一种或多种VOC的诊断工具为微分迁移率光谱仪 (Model SVAC, Sionex Corporation, Bedford, Massachusetts) ( “DMS” 或“DMS 装置”)。 DMS装置可在环境温度和压力下运行。已研发出微型机械化DMS作为可移动和手持的便携 单元。所述光谱仪可产生区别在GC-MS系统共洗脱的化合物的光谱，其通常产生提高的鉴 定样品中VOC的能力。对于基质辅助激光解吸电离/质谱法(MALDI-MS)而言，当以1. 5道 尔顿(Da)的范围对所述光谱质量进行分类时，统计模型已证明了区分类似于枯草芽孢杆 菌的大致10个物种的能力。这是由于每质量间隔的蛋白的大致相同的数量。最新的数据 也提示使用MALDI-MS有75%的正确鉴定率且没有假阳性。然而，因由于不同的离子迁移率 而使光谱比MS更易重叠合，使用所述DMS技术易于区别甚至更大量的物种。DMS装置为定量的，且具有极敏感的低至万亿分之几范围的检测限。DMS技术使用 依赖于高强度RF电场的离子的非线性迁移以用于离子的过滤且在处于大气压的空气中运 行。DMS能进行通过其他方法通常无法解析的化合物的快速检测和鉴定。DMS装置可很好 的按比例缩小，允许使用微型电子机械化(MEMS)制造的分析单元的小型化，同时保持灵敏 性和分辨率。DMS的这些和其他优势使其有作为在成本上足够低的定量检测器的吸引力从 而在所述领域(例如在临床环境下的床旁诊断化验诊断中)为实用的。从概念上讲，DMS的工作原理与四极质谱计的类似，但也有显著的区别即其在大气 压下运行，所以其测量离子迁移率而非离子质量。迁移率为应答作用力的离子能多容易的 移动通过空气的测量，且其依赖于离子的大小、电荷和质量。DMS光谱仪起可调离子滤器的 作用。可将气相样品导入到光谱仪以进行测量，在其中所述样品被电离，且通过载气将 所述离子经离子滤器后运向检测电极(法拉第平板)。所述DMS装置可基于不同的离子迁
12移率分离物质的化学成分。如图2A和2B所示，DMS装置的某些实施方式通过将箭头12所指的气体引入到电 离区18来运行。电离的气体经过流道26和构成离子滤器24的平行电极板20和22间的 通道。当气体经过板20和22间时，其暴露于由给板所施加的电压诱发的电极板20和22 间的电场中。在某些实施方式中，产生的电场在时间上为不对称的和振荡的。当离子流经滤器24时，一些被板20和22中和，而其他的经过离子探测器32并被 其感知。在某些实施方式中，所述检测器32包括在预设定电压下的顶部电极33和通常在 地面上的底部电极35。顶部电极33使离子向下偏转至底部电极35。因而，依赖于离子和 施加于电极的电压任一电极可检测离子。此外，可通过使用作为一检测器的顶部电极33和 作为第二检测器的底部电极35检测多离子。电子控制器30可包括，例如放大器34和微处理器36。放大器34放大了检测器32 的输出，其为电极35所收集的电荷的函数，并将所述输出提供给用于分析的微处理器36。 类似的，当也使用电极33作为检测器时，可提供在模型中所示的放大器34’。现在谈及图2B，当离子38通过对气流12为横向的交替不对称电场40时，电场40 导致所述离子沿路径42a、42b和42c摆动。随时间变化的电压V通常在+/-(1000 2000) 伏的范围内，并产生了有40，000V/cm的最高场强的电场40。特定离子所采取的路径为其质 量、大小、截面和电荷的函数。一旦离子到达电极20或22，其被中和。通过板20和22所使 用的偏压也通过图2A的电压发生器在28电极20和22间同时诱导由于+/-100伏直流电 压通常在+/-2000V/cm的范围内的第二、偏或补偿场44应答微处理器36以能使预选的离 子种类通过滤器24到检测器32。补偿场44为抵消交替的不对称场40的固定偏移以允许 预选的离子(如离子38c)通过检测器32。因此，当其遇到电极板20和22时，使用适当的 偏压，特定的离子种类将经过路径42c而不需要的离子将经过路径42a和42b而被中和。DMS光谱仪10的输出为有给定的偏置电场44的检测器32中的电荷数量的测量。 滤器24在给定的补偿偏压处固定越长时间，在检测器32中将积累越多的电荷。然而，通过 预定的电压范围扫描补偿压44可完成样品气体12的完整光谱。本发明某些实施方式的 DMS装置通常需要少于30秒和少至1秒以产生给定的气体样品的完整光谱。通过改变补偿 偏压44，可改变检测到的VOC以提供气体样品的完整光谱。在某些实施方式中，所述DMS装置包括用于推动由电离源产生的离子38经由离子 滤器24产生的不对称电场40并运向检测器32的离子流发生器。相反的电极对(例如环 电极对和/或平面电极对)可产生离子流发生器。另外，所述离子流发生器可在向例如检 测器32的移动方向中产生纵向电场。纵向电场强度可在时间和空间中恒定，也可随时间和 空间变化。纵向电场可推动离子38经过不对称电场40。在某些实施方式中，所述DMS装置 包括气相层析柱。在其他的实施方式中，将所述DMS装置连接到气相层析柱。在某些实施方式中，在电离源的下游在分析间隙中安置离子滤器24用于产生不 对称电场以过滤由电离源产生的离子。在名称为“Longitudinal Field Driven Field Asymmetric Ion Mobility Filter andDetection System”的美国专利No. 6，512，224和名 禾尔为“MicromachinedField Asym metric Ion Mobility Filter and Detection System，， 的美国专利No. 6，495，823、名称为“Longitudinal Field Driven Ion MobilityFilter and Detection System”的美国专利No. 6，815，669中用更详细描述了 DMS装置，将它们通过引用整体并入本文。2B.数据库在某些实施方式中，诊断装置(例如GC-MS装置、DMS装置、GC-MS/DMS双系统或 上述的任何装置)可包括能储存指示各种微生物的VOC的信息库的电子设备。另外，所述 电子设备允许连接至一个或多个远程数据库。在所述库或数据库中，可将先前收集和/或 已知的VOC数据(例如GC-MS和/或DMS光谱图样)与某些微生物相联系和/或包括与其 他的相关信息的联系。其他的相关信息包括，例如经历培养步骤的样品的培养条件(例如 培养基、培养基成分、温度和/或培养物上的液上空间气体)的有关信息、从身体获得的样 品(例如组织类型或身体流体类型)的身体来源的有关信息、从自然环境(例如土壤类型 或液体类型)获得的样品的自然环境来源的有关信息，及为样品(如可能的污染物和营养 源)来源的工业环境的有关信息。可在便携式装置中使用所述信息以用于鉴定样品中特定 微生物的结果的快速提供。例如，在下文的实施例4中，将从使用GC-MS进行的VOC同步检测中收集的数据与 DMS数据相比较。由DMS检测器所得的数据与GC-MS数据的比较允许使用DMS检测的便携 式装置的数据库的产生。
实施例实施例1描述了用于从与之匹配的培养基和从其他的分枝杆菌菌株中鉴定单独 的细菌类型MTb的方法及用于鉴定指示样品中MTb的VOC的方法。实施例2也描述了用于 鉴定和检测样品中例示挥发性有机化合物的例示方法。具体而言，实施例2描述了使用质 谱分析鉴定指示样品中MTb的挥发性有机化合物的色谱峰的方法。实施例3描述了从与之 匹配的培养基中鉴定单独的细菌类型Staph、Kleb和E. coli的例示方法及使用床旁诊断化 验诊断工具来鉴定样品中特定细菌的例示方法。实施例3也描述了产生工具的数据库以便 于样品中细菌的快速鉴定。实施例4描述了示与遇到不同培养基的特定细菌始终相关的或 与用特定类型、浓度或培养基成分的混合物培养的特定细菌始终相关的VOC的实验。实施 例5示可使用一种或多种VOC以鉴定样品中特定细菌的状态(例如存活、生长等)，例如接 触抗生素的细菌。实施例1 为评估用于检测细菌VOC的方法的能力，对MTb及作为对照株的其他两个分枝杆 菌-耻垢分枝杆菌(MSmeg)和鸟分枝杆菌(MAC)进行了两项研究。在第一项研究中，在 Bactec 12B培养基中以低浓度( 10~5杆菌/mL)培养MTb的两株和MAC的一株。所述 研究确定在所述低杆菌浓度进行细菌的鉴定是可能的且可确认所述方法能鉴定a)从其 匹配培养基所得的每个细菌；b)从另一 MTb株所得的一 MTb株；和c)从分枝杆菌对照株 (MAC)所得的MTb。在第二项研究中，提高从液上空间提取的VOC量以确定可通过质谱测量 鉴定所述化合物。la.上述图IB示用于获得所述两项研究的数据的一般方法。以每个处理八个重复在 Bactec 瓶中培养细菌。如Bactec 机器所测定的在选定的指数生长时收集所述两种菌株， 并使用只吸收和浓缩VOC的SPME纤维提取其液上空间。使VOC从SPME纤维脱附进入气相
14色谱仪，然后在低温捕集器中再浓缩。层析分离V0C，并在过柱后分离洗脱流。大致一半的 洗脱液被转移进四极质谱计(MS)，而另一半被转移至DMS装置。将MS用于化合物鉴定，并 确保两个探测器间的峰相关。在第二项研究中，所述杆菌浓度为IO8AiL或比第一项研究高约IO3倍，并提高液 上空间的培养时间至24小时。此外，在使用短链脂肪酸(丙酸)代替葡萄糖和甘油作为碳 源的Middlebrook 7H9培养基中培养MTb的一株和一对照株(MSmeg)。因为许多研究表明 MTb在体内可能利用脂质，预计脂肪酸代谢可产生更多的生理相关V0C。在含有葡萄糖和甘 油的Middlebrook 7H9培养基中制备MTb的第二培养物。使用上述相同方案在每次培养的 指数生长期间提取液上空间V0C。使用在每个细菌和其匹配培养基对照间及在MTb和对照分枝杆菌菌株间的两组 数据的比较分析由DMS检测产生的数据。基于在八个重复的平均值间的不同的峰完成特征 的选择。然后对特征进行逐个的研究以确认其在两组间有无。一旦鉴定了所述特征，其将 被使用以确定分类百分比。
_0] lb.结果DMS将MTb从培养某和对照分H干菌中区另I丨开对应于在MTb和匹配的培养基对照中存在的新或更强的峰的阳性特征为理想特 征，因为其代表MTb代谢物的产生，因此其在活动感染期间的患者的肺中存在。在图3A和 3B中显示了一组代表性的特征，其描述了 DMS输出的放大区以示对应于与匹配的培养基对 照相比在MTb样品中存在的峰的特征。然后将选定的特征用于在MTb和培养基间及MTb和 对照株间的类分。在图4显示了示MTb株1和其匹配培养基间区别的选定特征的代表性盒 式图。其为在生长指数900的MTb株1中发现的特征之一。使用两个或三个特征以使用 K最近邻域或支持向量机的标准算法区别细菌种类。在表A中显示了所得的分类效率的总 结。表A: 具体而言，表A显示了使用含有挥发性有机化合物的液上空间的DMS分析的结核分枝杆菌和匹配培养基或鸟分枝杆菌复合菌群的两组比较的结果。以IO5杆菌/mL的初浓 度培养细菌。最后一行为在脂质培养基中进行的独立实验；所述数据的提取和分析过程是 相同的。在使用SPME纤维进行液上空间的提取，并通过DMS分析后，通过用二维离散小波 变换(2D-DWT)变换所述数据来分析所述MTb、MAC和匹配的培养基数据。可将小波视为位 于补偿电压和时间的正交特征；其在滤波、去噪和基线消除任务上有用。然后通过将小波逼 近系数设置为零，而在信号上完成基线消除。通过从源自最高水平细节系数的重要特征移 除在信号上有效的进行滤波。使用费雪线性判定排列剩下的系数。自动的消去冗余系数。 最终，通过检查证实特征用于分类和用于作为生物标记物的考虑。然后将选定的特征提交 给使用交叉验证的K最近邻域分类器和支持向量机分类器。表A确认在MTb和培养基背景及MTb和MAC间有高分离性的MTb中检测到了特征。 在MTb株1和株2间所述特征子集相同，这提示其与来自MTb的VOC对应。应注意MS很少 甚至没有检测到所述特征的对应信号，提示在所述实验中DMS比MS有更低的检测限和/或 不同的选择性。然而，此研究证实，可使用具有高分离性和低细菌检测限(例如在低至IO5 杆菌/mL的杆菌浓度)DMS通过检测指示MTb (例如MTb V0C)的VOC来鉴定样品中的MTb。Ic.结果:ilH普鉴定MTb挥发丨牛有和,化合物在第二项研究中，提高从液上空间提取的VOC量。在图5A中示MTb和丙酸盐培养 基的代表性TIC。图5A描述了 MTb (线100)对比丙酸盐培养基(线102)总离子色谱图的 比较。使用SPME提取由纯化合物制备的标准溶液的液上空间，且所得的色谱和质谱数据确 定了指示MTb的V0C。从用包含丙酸盐的培养基培养的MTb鉴定出MTb特有的七个峰。在 图5A(箭头和持续时间)显示了七个峰中的四个。在下面的实施例2中更全面的描述用于 鉴定和进一步表征选定的VOC的例示方法。当在使用葡萄糖/甘油作为碳源的7H9培养基中生长相同的MTb株时，在色谱图 中只鉴定了两个特有的MTb峰(见在图5B左图的箭头)。图5B描述了 MTb (线103)和对 照培养基(线104)TIC(左图)对比耻垢分支杆菌(线105)和对照(线106)TIC(右图) 的比较。对于在脂相中培养的耻垢分支杆菌而言，相对于匹配的培养基只观察到了细菌的 一个特有的峰。在脂质培养基中在MTb VOC间也观察到了所述峰，其表明所述两种细菌共 用至少一种共同的代谢物，且可能共用代谢途径。总的来说，所述结果确定了特有的代谢分 布，其允许对不同的分枝杆菌和不同的生长环境的辨别。MTb特有的VOC的鉴定也为优化各 种检测方法(例如呼吸中所述化合物的DMS传感器检测)提供了机会。具体而言，在当其 从色谱柱洗脱时优选目的化合物的固定电压下保持RF和V。电场，以便将所需离子的最大 量传递到检测器以产生在信号上伴随的增强。使用所述方式，本文所述方法便于检测接触 各种细菌的个体呼吸中存在的所述化合物。在图5C中显示了含有由GC-MS鉴定的五种已知VOC的混合物的另一实施例的 优化。从纯化的标准物制备了五种鉴定的VOC的混合物，并在DMS上运行。图5C的左侧 示所述化合物在使用先前的运行参数的DMS上运行，而右侧示使用优化的温度参数的化 合物。如图5C所示，当传感器温度变至40°C时，在DMS中更容易鉴定出所述化合物。从 850C /1100V(图5C左侧)和40°C /1100V(图5C右侧)的传感器温度/色散电压组合收集 所述数据。当色散电压保持恒定时，在更高的温度(85°C)未观察到200秒左右的峰5。然而，当传感器温度降低至40°C时，对于在混合物中的所有分析物可观察到在峰值强度增强 的第五个代谢物峰。在所述两组实验中所述色散保持恒定。其他的温度/色散电压组合可 提高峰2和3的峰可分性。Id.结果和讨论总之，所述结果确定可从培养基或有高分类效率的其他细菌区分出特定细菌。此 外，串联检测系统能鉴定MTb的至少15种指示化合物。所述鉴定允许检测(例如DMS检 测)的优化以提高(例如在呼吸或痰样品)VOC生物标记物检测的灵敏性。实施例2 收集和分析从三组样品所得的数据。所述三组样品包括在具有添加的丙酸盐(也 称为脂相)的Middlebrook 7H9中的结核分枝杆菌、在Middlebrook 7H9中的结核分枝杆 菌及在脂相中的耻垢分枝杆菌。将仅有培养基和空气提取物用作每个数据集的对照。在指 数生长阶段使用SPME纤维通过将液上气体接触所述纤维30分钟以提取每个细菌样品液上 空间的挥发物，且脂质中的MTb、7H9中的MTb及耻垢分枝杆菌的OD值分别为0. 48,0. 48和 0. 63。以如以上的细菌所述的相同方式提取非细菌样品液上空间的挥发物，且应注意在相 同的容器和条件中在相同的时间段温育所述培养基。在表B中总结了相关的样品。表B :MTb脂质研究分析的样品的质谱分析
空气提取物对于每个条件，收集各条件的多个气相提取物样品，并用唯一的标示符(例如 13_4)标识。例如脂相中的MTb，列出了九个重复。对于耻垢分枝杆菌，未鉴定其空气提取 纤维。 检查空气、脂相和MTb样品的重复，并收集峰持续时间的详细列表及空气、丙酸盐 培养基和脂质培养基中的MTb的鉴定。使用ChemStation NIST库将选定的峰与已知的化 合物相比较。一般而言，选择峰的最高百分比匹配，提供的百分比匹配为彡30%。而在MS 峰鉴定中为不可接受的阈值，其中通常使用> 70%的匹配。在所述数据中的大多数色谱峰 没有实质的峰值强度(即> 10000的总离子丰度)。然而，在未了解MTb液上空间中存在什 么分析物的情况下，采用较低的阈值百分比匹配是合理的。计算每个峰持续时间的平均值、标准偏差(sd)和百分比相对标准偏差(％ rsd)。 对于稳健的色谱系统，需要< 2. 0% rsd的样品分析物，优选< 1. 0%。所述结果的评估确 定了脂质培养基和MTb色谱持续时间中的持续时间上的再现性。计算MTb样品第一峰(平 均持续时间=3. 18分钟)的最大％ rsd为1.7%，而相应的脂质培养基峰(平均持续时间 =3. 19分钟)有0.71%的相对误差。在所有情况中，其为宽硅氧烷峰且基于其短持续时 间、宽峰宽度和分析有用性的缺乏，可将其忽视。其他所有剩下的峰有对于MTb的0. 064 0. 40% rsd的相对误差值，及对于脂质培养基的0. 035 0. 36% rsd的相对误差值。最后 使用标准即所述峰必须在代表样品处理的八个重复的八个色谱图中的三个出现来确定在 脂质培养基和MTb色谱图中峰的总数。因此，发现脂质培养基有39个峰而MTb有38个峰。用评估的峰鉴定和再现性叠加脂相中MTb和只有脂相的TIC。只比较了在同一天 经GC-MS分析的细菌和培养基以简化比较。这使任何色谱技术固有的分析物持续中的日 间浮动最小化。基于确定的分析物持续时间的再现性，通过所述选择未引入解释误差。图 6A 6E示与匹配培养基对照的色谱图叠加的例示MTb色谱图。在图6B 6E中通过如下 文所确定的峰数量和化合物的鉴定对MTb的六个例示指示峰进行鉴定。表C =MTb特有的TIC峰的平均持续时间 基于色谱图的优点、质谱评估和与NIST库的比较来鉴定了七个色谱峰中的六个。 随后的部分提供了色谱和质谱数据的详细分析，而表D总结了基于与OTST库的匹配的总离 子丰度和峰特性。简言之，NIST库搜索机制采用了三种方法进行化合物鉴定正向搜索、反 向搜索和匹配概率。正向和反向搜索都基于在未知谱和库谱间完美匹配的事件中的理想得 分1000。在实际中使用的基准参数为彡900的值是优匹配，800至900间的值为良，700至 800间的值为中，而任何低于600的值为差。在正向搜索中，所述软件将未知的质谱与已知 化合物的质谱相比较，且所得分反映了未知的质谱能以何种程度匹配已知化合物的质谱。 在已知质谱中缺无的未知质谱中的额外峰导致了两种化合物间匹配的更低得分。相反，反 向搜索尝试在未知质谱中发现已知的化合物，并假定在未知中存在但在库谱中缺无的峰为 杂质。表D 在TIC中特有的MTb峰的峰a丰度和库匹配 a =以持续时间增加排列的峰。见表C* =峰6为2-乙基己酸甲酯以百分比报告匹配概率值且所述得分体现了未知质谱与数据库中的已知化合物 正确匹配的可能性。因而，质谱可与多个数据库条目匹配的未知化合物比具有高特有离子 分布的未知化合物得分更低。因此，一给定的质谱可在正向和反向搜索中获得有利的分数， 但在匹配概率范畴中仍获得较低的分数。概率值的解读类似于正向和反向搜索，但基于理 想得分100。最后，应了解使用OTST库(同一化合物通常有多个条目)在分数赋值上很大 变化。主库为由NIST人员判定的为最优谱的条目，然而重复的库中包含由其他人提交的其 他条目。因而，当为给定的质谱提供得分时，可将不同的重复与主库质谱或提供的任何重复 库比较。在本文提供的分析物中，在匹配的参照质谱(即主库或重复库条目)间无区别。尽 管在库条目间有一些变化，但假定在谱解读中未引入可观的错误。因为许多外部因素在质谱所得分上具有有害的影响，给定的色谱峰的各种OTST得分的理解是相关的。通常而言，基于差的信噪比具有低的总离子丰度的峰趋于获得更低 的分。如果所述色谱峰不是特别的大(即总离子丰度为5000或更大)，峰的纯度会有点不 可靠，且在可测量的强度处所述质谱不包括所有的离子片段峰。此外，在数据的评估中应注 意MTb文件13_4、6、9、10和14_4、6的所有质谱在40和44的m/z值处包含异常大的峰。 在一些情况下，所述峰在质谱中有最大的绝对丰度，从而相比于NIST库参照谱其更重。无 论在色谱图的何处选定了峰，基于氩气(m/z = 40)和二氧化碳(m/z = 44)在每个质谱中 的普遍性认为所述峰由所述氩气和二氧化碳所引发。所述两种化合物应来源于样品的外 部，因为其在与仪器系统的无效时间(非残留溶质从柱上洗脱所需的时间)相同的时间洗 脱。因为在每个谱中都出现了所述峰，因此必须有持续的来源，而其明显不源于所述SPME 纤维。在所有的可能中，氩气的来源为氦载气，而可能由质量选择性检测器中的漏气引入二 氧化碳。无论如何，六个文件中所述两个峰的持续存在可起到降低与NIST库的匹配质量的 作用。因此，在下述结果中考虑所述峰的影响。尽可能的经在MTb分析中所用的相同方法并在相同的条件下运行已知标准物，以 确认各种色谱峰的特性。标准化合物的持续时间不应与MTb色谱峰的持续时间具有显著差 异，并产生与库质谱几近匹配的质谱。此外，可将以所述方式获得的标准物的质谱与未知化 合物的质谱相比较以确定峰鉴定的完整性。除在两种分析物从柱上共洗脱的罕见情况外， 所述确认方法允许正确的峰鉴定。为此，可经不同区域的色谱峰查看MTb样品的质谱以确 定所述峰是否为色谱纯。在下述的分析中未发现共洗脱的迹象。2b.鉴定丙酸甲酯作为样品中MTb的指示化合物使用NIST库初步鉴定峰IMTb重复物，并返回在每个情况下的丙酸甲酯的特有匹 配值。没有其他的库谱与化合物的质谱有意义地匹配，并在表E中总结搜索结果。OTST库 包含丙酸甲酯的总共五个质谱条目(主库加四个重复库)。表E =MTb峰1 (tr = 4. 433士0. 007)与丙酸甲酯的NIST库匹配 除文件13_6的正向搜索外，所有的正向和反向搜索得分为中至良。反向搜索得分 始终比所述正向得分高。甚至更令人鼓舞的是概率匹配得分，其中八个文件中的六个匹配 好于70%，即用于确定相对于所述库的化合物质谱的独特性的阈值。所述结果表明峰1为 丙酸甲酯。将个别的MTb重复物质谱与库谱比较，且特别感兴趣的为特征性的m/z峰的相对 峰丰度。因为在NIST库中有丙酸甲酯的五个参照谱，在相对峰丰度上有一些变化。此外，大 多数参照谱有5 6个m/z值小于39的峰；用于此实验的仪器方法无m/z值小于39。因为在MTb谱中缺无特征性峰，这影响了峰的得分。使用所述NIST参照谱，预期的m/z值以相 对丰度的降序排列为57 > 88 59 > 45 55。作为主峰，m/z = 57的相对丰度为100%， 而在88和59处的峰约为20 35%，且剩下的两个峰只有约4 6%的相对丰度。因而， 只能进行相对丰度值的有限的比较。用在表F中提供的相对峰强度的详细比较，在图7中 示MTb和丙酸甲酯参照谱的代表性的头-尾比较。表F 在MTb重复物中丙酸甲酯的相对离子丰度 * =由星号指明的离子疑似由氩气(m/z = 40)和二氧化碳(为m/z = 44)引发。 因此，所述离子的丰度可能与化合物特性无关。图7的检查示在参照谱中m/z值< 30处的额外峰为可见的。在参照谱中缺无的 小峰遍及在MTb样品的质谱中。如先前所指，对于大多数MTb文件，氩气和二氧化碳的相对 离子丰度是相当基本的(在表F中用星号指明)且其还掩盖了匹配的质量。如果可忽视作 为系统性错误的所述值，然后很显然所述相对离子丰度可与参照质谱的相对离子丰度能相 当好的匹配。在所有情况下，所述m/z = 57峰为最丰，在59和88处的峰一般为20 35% 的相对丰度，而m/z = 45和55的明显更低(所有都少于8%)。总的来说，所述数据表明 丙酸甲酯为所述化合物的特性。使用已知的丙酸甲酯对其进一步证实。在乙醇(Sigma-AldriCh，200prOOf)中制 备约20ppmv丙酸甲酯(Aldrich，99% )的溶液，以便在TIC中的所得总离子丰度与在MTb 文件中观察到的相当。使用SPME纤维提取溶液的液上空间5分钟，且一式三份地进行所 述实验。相关数据文件为24_7、8和9，且在图8中示TIC的相关部分。发现丙酸甲酯的平 均持续时间为4. 427士0. 004 (% rsd = 0. 10% )，其可与MTb结果中峰1的平均持续时间 (4. 433士0. 007)顺利的比较。在两组平均值上进行的t检验显示，两组持续时间上以95% 可信度无统计学显著差异，其还表明了峰1作为丙酸甲酯的鉴定。将标准物的质谱与OTST谱库的相比较，并在表G中列出所述搜索结果。所述标准 丙酸甲酯溶液的质谱都产生了良的正向和反向搜索，且匹配概率值是优。
表G 丙酸甲酯标准物的NIST库匹配 标准物的相对离子丰度也确定了 NIST库和MTb峰的质谱。具体而言，所述m/z = 57峰有100%的相对丰度值，而在88和59处的m/z峰是相当的，且为30 43%。丙酸甲 酯标准物的m/z = 45相对峰丰度明显比MTb样品的高(大致25%对比5% )，可是在表F 中列出的除去m/z = 40和44的所有剩余峰有与MTb样品相当的相对丰度值。总的来说， 所述数据明确表明了峰1的特性为丙酸甲酯。2c.检测2- 丁酮作为样品中MTb的指示化合物根据NIST库评估了峰2重复物，且八个重复物中的五个与2- 丁酮最佳匹配。将 剩余峰大部分的匹配于6，10-二甲基_(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮(C14H24O)。在表H中 示库搜索的结果。NIST库有2-丁酮的总共四个条目主库质谱及三个重复表H :MTb 峰 2(tr = 4. 643 士0. 009)的 NIST 库匹配 表H检查的2-丁酮的正向和反向搜索结果显示在所有但除去一个的情况下，所述 搜索匹配为中到优。只有一个正向搜索结果为差。C14H24O的正向和反向搜索结果都是有效 的良。对于这两种化合物而言，反向搜索总获得比正向搜索更高的分，这如预期，因为正向 搜索对在已知谱中缺无而在未知中出现的额外峰罚分。无论使用2-丁酮的哪一个库条目， 结果是相同的。在任何重复中两种化合物的概率匹配不超过所需的70%的阈值。在甲醇(Sigma,M1770-1L)中制备约 20ppmv 的 2_ 丁酮(Sigma-Aldrich, 99+% )标准溶液以鉴定MTb峰2。选择所述浓度以产生与MTb文件所获得的总离子丰度相当的总 离子丰度。使用SPME纤维一式三份地提取所得溶液的液上空间5分钟。在提取后，使用双 检测器GC-MS捕冲系统分析所述样品，而相关的数据文件为16_3、4和5。在图9中示所得 的TIC，且2- 丁酮的平均持续时间为4. 652士0. 009 (rsd = 0. 20% )0 2- 丁酮持续时间与 MTb峰2持续时间的比较显示，在持续时间上以95%可信度无显著差异。所述结果表明MTb 峰2为2-丁酮。然后将标准物2- 丁酮质谱与2- 丁酮和C14H24O的NIST谱库条目相比较，且在表1 中显示所述结果。表I :2_ 丁酮标准物的NIST库匹配 如用MTb重复物所观察，2-丁酮标准物的正向和反向搜索一般为良至中的匹配。 虽然概率匹配未达到70%的阈值，但对于2-丁酮，所述匹配显示了比MTb重复物提高的谱 独特性，而C14H24O的匹配是差。同样，除了一例外文件16_5，标准物和C14H24O的正向和反向 搜索都为中。反向搜索总返回比正向搜索更高的分。总的来说，所述结果表明NIST库谱匹 配无法预测2- 丁酮和NIST库间所需的最小匹配概率。毫无疑问，在TIC中观察到的标准 物( 1600 2800)和MTb重复物(6000 10000)的低总离子丰度导致了较低质量的匹 配。然而，对2- 丁酮标准物和MTb重复物都良的匹配概率对于C14H24O显然更差。比较在各种已知化合物的库条目中的m/z值的相对丰度以帮助未知化合物的鉴 定。在表J中总结所述结果。表J =NIST库条目的相对离子丰度a a =基于2- 丁酮以相对丰度的降序列出的离子m/z值。b = 2-丁酮的NIST参照谱。主库来源为(.0拍1~狀&，重复物1为化学的概念，重 复物2为日本AIST/NIMC数据库，及重复物3为DowChemical Company。
c = 6，10-二甲基-(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮(C14H24O)的 NIST 参照谱。主 库来源为 Insect Chem. Ecol. Lab如表J所指，很显然四个2-丁酮库质谱的每个都有相同的相对丰度值顺序43 >72 >57 >42 >44。四个谱间的相对丰度相当可比。观察到了具有相当的相对丰度的 C14H24O谱的几乎一致的顺序；因为m/z = 58具有稍微更高的相对丰度，只有m/z = 44在顺 序外。所述数据表明2- 丁酮质谱实际上为C14H24O主离子峰的子集，且经两个库谱的头_尾 比较在图10中对其进行了图示的描述。因为所述质谱本身实质上不是特有的，所述现象为 造成MTb峰的差概率匹配值的部分原因。然后评估2- 丁酮标准物和MTb重复物的主离子的相对丰度。对于八个重复的六 个，在m/z = 40和44处反常大的峰引入了一些误差到NIST库的谱解读和与NIST库的比 较。为此，对没有包含所述两个峰的所有MTb和2-丁酮标准重复物计算主离子的相对丰度。 在表K中示所得值。在表K中，相对离子丰度与2-丁酮和C14H24O NIST库谱在很大程度上 匹配良好(见表J)。然而，将相对离子丰度的可比性进一步证明峰2为2- 丁酮或C14H24O15表K :2- 丁酮和MTb重复物的相对离子丰度 a =以如表J确定的相对丰度的降序列出的离子m/z值。b = MTb 重复物。
。= 2-丁酮标准物。色谱证据表明峰2作为2-丁酮的特性。此外，C14H24O不可能与2-丁酮共洗脱。 C14H24O的制剂重量为208，而2-丁酮的为72。因C14H24O的沸点是未知的，认为其与2-丁酮 的沸点是相同的和/或在色谱柱中其经历相同的持续特征是不切实际的。然而，评判其他 有助于少于理想匹配的MS特征是有益的。如果未知化合物为C14H24O,在m/z = 58、55、41和71处可预期有额外的峰。特别 感兴趣的为大于72的m/z值的存在，因为其为2- 丁酮的分子量，且2- 丁酮谱中未观察到 更大的峰。对于C14H24O而言，按照相对丰度的顺序记录的峰为85、83、84和98。所述峰的 相对丰度约为1 3%。评判2- 丁酮标准物的质谱，除在m/z = 85处具有绝对丰度12的 文件16_4中的小峰，未观察到任何所述峰。在所述MTb文件中，文件13_4和14_6在m/z =85处具有绝对丰度分别为11和17的小峰。具有计算的标准物2- 丁酮的1. 0%相对丰 度的所述值与0. 25% 1. 0%间的相对丰度相对应，其不包含C14H240。总之，在质谱中没有 有意义的证据以支持峰2作为C14H24O的鉴定。虽然注射所述化合物的标准物是最有说服力 的，但在NIST库中为未提供所述化合物的CAS号，且不可能商品化。因此，上述实验表明峰 2为2-丁酮。在质谱数据中的最终关注区为脂质培养基TIC中存在4. 6分钟左右的小峰，然而 峰的总丰度不显著。整体而言，在培养基中峰的平均持续时间为4. 644士0. 007 (% rsd = 0. 16% )，其与MTb样品中2- 丁酮峰的平均值以95%可信度无显著差异。所述数据提示 培养基峰也为2-丁酮。对于由于高色谱背景信号而反常的大于5500的峰，在培养基峰中 所见的绝对离子丰度值的范围为1200 5500。相比之下，在MTb样品中所述峰为5700 10200。因此，最高的培养基峰具有比最不丰的MTb峰更低的丰度。总体而言，培养基的平 均峰丰度为3400 士 1300，而MTb峰的平均峰丰度为8600 士 1900。所述两组平均值以95%可 信度具有显著差异，所以可推断MTb样品比仅培养基含更多的2- 丁酮。然后评估培养基峰的质谱以确定其特性，并在表L中显示所述结果。如反向匹配 的一半，所有与2-丁酮的正向匹配得分差。2-丁酮的匹配概率得分也差，而在所有类中培 养基峰得分有益为6，10-二甲基_(E，E)-5，9-十二碳二烯-2-酮。质谱的评估显示，峰错 误辨识的主要问题为在培养基质谱中假峰的存在。除来自其他来源(柱，SPME等)的其他 反常，其包括在13_和14_文件中在m/z = 40和44处的峰。因为所述质谱峰不强，在质谱 中所述假峰重量不成比例，且降低了匹配的质量。所述数据表明当2-丁酮在脂质培养基中 出现时，在MTb中有所述化合物的更多再现性。表L 脂质培养基的谱匹配 a = 2-丁酮的谱匹配值。b =在所述峰的最优100个匹配中未列出出现的2-丁酮。。=所述化合物为6，10-二甲基_(E，E)-5，9_十二碳二烯_2_酮。2d.检测3-戊酮作为样品中MTb的指示化合物MTb峰3产生了有利为3-戊酮的NIST库的比较。所述库包含所述化合物的总共 四个条目主库加三个重复，并在表M中总结匹配的结果。表M:MTb峰3(、= 5.6740.01》与3_戊酮的NIST库匹配 表M显示了七个质谱产生了 3-戊酮的中至良的正向匹配，而所有的反向匹配为中 至优。如往常一样，由于质谱中假峰的存在，反向匹配得分比正向匹配得分更高。独特性 的概率匹配通常都差(即< 70% )，然而八个中的五个在60 70%的范围，且一个几乎为 80%。因此，所述结果表明峰3的特性为3-戊酮。然后与NIST库谱比较质谱相对丰度，然而四个库条目有不同的谱。所有四个谱都 还有在m/z值< 39处发生的10个最强峰中的4个，其为在MTb质谱中所测最小离子值。 毫无疑问的是，因为其为用于在匹配算法中确定化合物特性的谱特性，其导致了低质量的 匹配。此外，MTb和NIST质谱在m/z = 57和86处都有两个大峰，并有相对丰度非常相当 (即1. 5 6. 5% )的七个额外峰。所述七个额外峰中，只有一个峰(m/z = 58)以最优前 十的相对丰度出现在所有四个标准谱中。最后，文件13_4、6、9、10和14_4、6的MTb质谱在 m/z = 40(氩气)和m/z = 44 ( 二氧化碳)处有异常大的峰。所述文件的氩气峰的相对丰 度值为47 89%，而15_5、7的仅 2. 5%。在13_和14_文件上获得的文件的二氧化碳 峰为14 22%，而15th的为6 8%。无论使用何种策略，大的假峰产生更低的得分和概率匹配。在乙醇(Sigma-Aldrich，200proof)中制备约30ppmv 的 3-戊酮(Sigma-Aldrich， ReagentPlus, ^99%)溶液以确认峰3的特性为3-戊酮。选择所述浓度以便标准物色谱 峰的总离子丰度与MTb样品中所测量的大致匹配。使用SPME纤维一式三份地提取溶液的 液上空间，随后使用双检测器GC-MS捕冲系统对其进行分析。相关的数据文件为25_4、5和 6，并在图11中示TIC的相关部分。3-戊酮标准物的平均持续时间为5. 696士0. 006(%rsd =0.11% )，其与MTb文件的平均持续时间(s.e^io.oii)似乎保持良好的吻合。对所述 两组平均值的标准偏差进行了 F检验，且它们以95%可信度无显著差异。然而基于t检验 结果，标准物和MTb文件的平均持续时间以95%可信度有差异。叠加MTb和3-戊酮标准物的代表性TIC，并在图12中显示以理解持续时间上的差 异。在图12中很显然MTb 3-戊酮峰比标准物更窄，且有更大的总离子丰度。峰形(即高 度宽度比和峰对称性)可影响峰值偏移的作为质量中心的化合物的整体持续时间。在标准 物和MTb文件中的3-戊酮峰在平均持续时间上有约1.4秒的差异，其可由仪器的因素(如 流量上的小变化)轻易的造成。如果在这种情况下，预计在其他的色谱峰中由大致相同的 时间差造成的系统偏差是合理的。因为所述3-戊酮为相当纯的标准物，在色谱图中没有许 多的额外峰用于比较(因为在3-戊酮色谱图中乙醇峰为不成比例的大，不可使用所述峰)。 在约4. 9分钟处的硅氧烷峰为仅有的用于比较的合理的峰并在图12中将其进行标记。在图12中，很显然MTb文件的硅氧烷峰(八个MTb重复的平均值4.908分钟 士0. Ol1)具有比在3-戊酮标准物色谱图中硅氧烷峰(三个标准物重复的平均值4. 933分 钟士0.01。)的持续时间更短的持续时间。所述两组平均值以95%可信度具有显著差异，且 两组平均值间的时间差大致为1. 5秒。所述结果与在3-戊酮峰中观察到的时间差是明显 相当的，因此其提示所述差异是系统性的、因此根源于仪器。总体而言，持续时间上的差异 相当小，因此3-戊酮的持续时间表明MTb峰3的鉴定为3-戊酮。下一步比较库、3-戊酮标准物和MTb重复物的质谱，并在表N中显示所述结果。伴 随在m/z = 86的下一个最大丰度离子处的母离子峰(即无分段的3-戊酮的+1离子的m/ ζ值)，在所有情况下主峰为m/z = 57。有趣的是，对于四个库条目，在m/z = 45未观察到 峰，且在八个MTb重复物质谱的六个中所述峰几乎不可测量到。然而3-戊酮标准物每个在 大致11 %的所述值处都有峰。因为在NIST标准库中其基本上无法测量，不清楚在标准物中 所述片段的来源是什么。具体而言，重复物2和3在它们的参照谱中有无可测量的峰，而在 主库和重复物1库条目的谱中可观察到平凡峰。在所有情况下，所述峰不超过1 %的相对丰 度。因此，标准物的所述峰可为杂质，且其在任何的MTb标准物条目中未观察到。除MTb文 件13_6和14_6在m/z = 39处没有峰之外，在合理地相当的相对强度值处出现所有其他剩 余峰。这与所述观察即所述峰为通过质谱仪测量的最低m/z值是一致的，且其有时不出现。 此外，所述峰相当小，且在四个库重复的三个中缺无。因此，所述质谱数据支持峰3的特性 为3-戊酮。表N 在NIST库、标准物和MTb文件中的3_戊酮质谱的相对离子丰度 NR =未对所述标准物进行报告；只报告了库中前十大相对丰度值的片段匪=未对所述MTb重复物进行测量；这表示在m/z值处未出现峰。2e.检测2-戊酮作为样品中MTb的指示化合物MTb质谱与NIST库的比较未产生2-戊酮的强(即彡70%)概率匹配。另外，正向 和反向搜索结果通常产生与NIST库谱的差匹配。八个重复物的质谱通常产生2-甲基-N， N-二异丙基-丙酰胺的更好的概率匹配。在甲醇(Sigma，M1770-1L)中制备约20ppmv的 2-戊酮(Aldrich，HPLC级)标准溶液，以确定峰特性。选择所述浓度，以产生与MTb样品 测量的丰度大致相等的标准物的总离子丰度。使用SPME提取所述溶液的液上空间5分 钟，然后在双检测器GC-MS捕冲系统上运行。所述2-戊酮标准物文件为12_7、8和9。在 图13中示所得的所述标准物的TIC，且2-戊酮的平均持续时间为5. 786士0. 003 (% rsd = 0. 052% )。峰4的平均持续时间的结果的比较(5. 785士0. Ol2)显示，2-戊酮标准物和MTb 样品峰4的持续时间间以95%可信度无统计学显著差异。所述结果支持鉴定峰4为2-戊 酮。基于2-戊酮的沸点为101 105°C (Aldrich产品目录)，且有86的制剂重量，而酰胺 有171的制剂重量，2-戊酮和酰胺共洗脱是极不可能的。
也将标准物2-戊酮质谱与NIST库的相比较。对于2-戊酮而言，除了主库条目外， 有2-戊酮的至少三个重复条目，且其足够不同以在与已知的2-戊酮比较时产生不同的得 分。因此已知谱的变化性不被认为是需关心的原因。对于标准物2-戊酮的三个重复，在表 0中示2-戊酮和2-甲基-N，N-二异丙基丙酰胺的库匹配的谱。2-戊酮在NIST库中的正 向和反向搜索都显示了所述谱间的良匹配，然而反向搜索始终比正向搜索获得更高的分。 因为每个标准质谱包含假峰，可预期所述结果。当在库中将标准物2-戊酮与酰胺质谱相比 时，可观察到相同的趋势；其中搜索得分为微小至差。表0 :2_戊酮标准物的库匹配 a = 2_ 戊酮b=酰胺然而，甚至当已知2-戊酮存在时，NIST库概率匹配不能始终识别出具有所需可信 度的化合物(图14)。标准物2-戊酮质谱与2-甲基-N，N-二异丙基丙酰胺的比较(图15) 显示所述两种化合物间的差相关，其可通过差的概率匹配反映出来。在图15中很显然因在 m/z值41、42、43、44、58、71、86和87观察到的峰，所述2-戊酮的质谱为2-甲基-N，N-二 异丙基丙酰胺的子集。这可解释MTb峰4常被鉴定为酰胺而非酮的原因。因2-戊酮的质 谱包含在酰胺的质谱内，合理预计其“独特性得分”不会高。此外，预计在正向搜索中2-戊 酮得分差，但在反向搜索中更有利。进一步复杂化的质谱鉴定为在八个MTb重复的六个中 氩气和二氧化碳峰的存在。最后，各种MTb和2-戊酮标准样品的质谱的评估显示了来自任何数量来源的额外 的假峰确实规则地出现。经注射器的2-戊酮的直接注射产生了好于90%的概率匹配。所 述假峰不足够普通(即可重复性)或足够一致(即相同的m/z比)以提示在同一时间多于 一种的分析物洗脱。然而，基于在所述峰中的低离子丰度，任何异常的峰可对谱匹配具有有 害的影响。在图15中谱的评估显示在2-戊酮标准物中在m/z = 114处可观察到较小的峰。 在相当的相对丰度的2-甲基-N，N-二异丙基丙酰胺中发现所述峰，并因此降低了匹配的质 量。
如果MTb峰4为2-戊酮，无超过86的m/z峰，因为其为制剂的分子量。如图15， 如果峰4为酰胺，在酰胺的母离子的m/z值100、114、128和171处可预期特征峰。基于所 述峰的相对丰度，应始终观察到所述峰中的至少两个。然而，所有八个MTb重复的评估显示 在100、114或128处没有峰。只有MTb文件13_9在m/z = 171处显示了较小的峰(总离 子丰度为10)，且只有2-戊酮标准物文件12_7在114处显示了较小的峰。因此，质谱中特 性的缺无、更高重量的离子表明峰4不是2-甲基-N，N- 二异丙基丙酰胺。表P 在标准物和MTb文件中的2-戊酮质谱的相对离子丰度 下一步，将MTb质谱与标准物的相比较，并在表P中总结所述结果。以降序安排 2-戊酮的m/z值。很显然酰胺的m/z值的相对强度不以相同的顺序下降，其允许了区别MTb 样品峰中的所述两种化合物的一种机制，并进一步表明峰4为2-戊酮。2f.检测甲氧,某苯(苯甲醚)作为样品中MTb的指示化合物部分由于在TIC中的弱信号((4000总离子丰度)，在化合物鉴定中峰5存在多 种挑战。五种库参照化合物与TB峰有不同程度的匹配甲氧基苯(AKA苯甲醚；丽=108)、 7-脱氧-1-甘油-d-甘露-庚苯酰胼(MW = 300)、1-氨基-2-甲基吡啶氢氧化物(MW = 108)、α，d-gala-辛基苯酰胼(MW = 346)及甲基苯基碳酸(MW = 152)。质谱的初步评估 提示所述化合物为甲氧基苯，并在表Q中总结NIST库结果。表Q :MTb峰5(tr = 8. 87。士0. Ol3)与甲氧基苯的NIST库匹配 除文件15_5和7外，TB质谱的几乎所有正向、反向和概率匹配都是差。基于低峰 值强度、假峰的存在及其他的匹配质谱的相当大量的库条目，所述结果是不出人意料的。鉴定了从其他的库化合物中区分甲氧基苯的特有质谱特征。基于此并考虑其巨大 的制剂重量，排除α，d-gala-辛基苯酰胼和7_脱氧甘油-d_甘露-庚苯酰胼作为可 能的匹配。最令人注意的是，对于这两种苯酰胼化合物，m/z = 77和78的相对峰丰度分别 为约28%和15%。在MTb质谱未观察到此。同样，对于所述苯酰胼，m/z = 92和93的相 对丰度值分别约为38% 40%和14 23%。在MTb质谱未观察到所述比率。甲基苯基碳酸的NIST库条目表明在m/z = 65和108处的峰分别有100%和42% 的相对丰度。在MTb峰中，所述丰度为64%和100% (基本相反)。另外，甲基苯基碳酸的 母离子峰在m/z = 152处以约37%的相对丰度发生。在MTb质谱中其将明显可见，然而在 所述比率处八个重复物的五个未观察到峰。在152处确实显示峰的三个文件有13 17间 的绝对离子丰度值。使用m/z = 108的绝对离子丰度值和m/z = 152的估计的相对离子丰 度37%，在所述质谱中所述峰应有90 200的绝对丰度。在MTb文件中的丰度值太低不足 以支持与甲基苯基碳酸的匹配。甲基苯基碳酸的最终特性为在m/z = 59处具有21%相对 丰度的峰的存在。在八个重复中的六个中完全无所述峰。不具有所述峰的谱有远未达到预 期值的5. 3和9. 0%的相对丰度值。所述数据未为峰作为甲基苯基碳酸的特性提供有说服 力的支持。区分甲氧基苯和吡啶盐的质谱更具挑战性，尤其根据两种化合物都是芳香族的且 具有相同分子量的事实。因此，如在图16中所见，两种化合物以相当的相对丰度产生大部 分相同的离子碎片。在图16中两种质谱间的主要、有用的差异为甲氧基苯在m/z = 39处峰的存在和 在m/z = 92和93处峰的相对丰度。对于吡啶盐，所述峰的相对丰度值分别为60%和27%; 在14%处甲氧基苯值为m/z = 93，而在 5%处m/z = 92。MTb质谱的评估显示八个重复 的六个有在m/z = 39处具有28% (范围13 40% )平均相对丰度和在参照谱中约20% 的峰。因为m/z = 39为由仪器测量的最低离子比率且在每个质谱中不总出现(即通常χ 轴在m/z = 40，而非39处开始)，所述谱中的两个不显示所述峰。下一步，如果所述MTb峰 为所述盐，m/z = 92应是m/z = 93峰的约2倍丰度。如果所述峰为吡啶盐，MTb重复物的 m/z = 93的平均相对丰度为14% (范围=7. 5 20% )，所以应没有测量92的峰的困难。 其在任何的MTb质谱中未被观察到，其中在m/z = 92处八个重复的五个没有峰，三个确实 有以2. 8% 5. 6%相对丰度的峰范围。所述数据表明MTb峰5不是1-氨基-2-甲基吡啶 氢氧化物。
在甲醇(LC-MSChromasolv, Sigma-Aldrich)中制备约 30ppmv 浓度的甲氧基苯 (无水，99. 7%, Sigma-Aldrich)以验证峰5的特性。所述溶液浓度产生了约18，000的总离 子浓度，其远大于在MTb文件中所见的2000 4000范围。在较低的范围下，与MTb文件的 观察一致，甲氧基苯标准物不产生与NIST库的良匹配。所述数据文件为24_3、4和5，并在 图17中示所得文件的TIC。甲氧基苯的平均持续时间为8.886士0.014(%1^(1 = 0. 15%)。 具有8. SliO. Ol3平均持续时间的所述结果可更有利地与峰5的比较，且两组持续时间间 以95%可信度无统计学显著差异。所述结果表明峰5为甲氧基苯。下一步将甲氧基苯的标准谱与NIST库条目相比较，并在表R中总结所述结果。标 准物的正向和反向谱匹配是优，而匹配概率是良。表R 甲氧基苯标准物的NIST库条目匹配 然后将标准物的质谱与MTb文件的相比较(见表S)，且两组数据集间的相对丰度 值非常吻合。相对峰丰度显示下面的趋势108 > 78 ^ 65 > 39 > 77 ^ 51 ^ 79 ^ 93，因 此提供了额外的证据以支持所述峰的鉴定。表S 在标准物和MTb文件中甲氧基苯质谱的相对离子丰度 在表S中，值得注意的是对于两个MTb文件而言，在m/z = 39处未测量到峰。因 为所述值为通过所述方法测量的最低m/z，且在质谱中通常不出现，其不是不常见的。基于 所述数据，鉴定峰5为甲氧基苯(苯甲醚)。2g.检测2-乙某P1酸甲酯(甲某2-乙某P1酸酯)作为样品中MTb的指示化合物在表T中显示甲基2-乙基己酸酯(MW= 158)的MTb峰6与NIST库匹配。所有 的正向搜索和大部分的反向搜索获得差的得分，而约一半的质谱获得中概率匹配分数。所 述库包含所述化合物的三个总条目(主条目加两个重复)。尤其值得注意的是，对于八个重 复的每一个，所述峰通常有最低总离子丰度4500)中的一个，因此在质谱中的总信号强 度比所需的要更弱。表T :MTb峰6(tr = 12.536士0.02》与甲基2_乙基己酸酯的NIST库匹配 库质谱的评估显示了主m/z值的相对丰度值的下列顺序102 87 > 57 > 41 > 55 > 43 101 130。如表U所示，MTb峰与所述值相当好的吻合，其支持峰6作为甲基 2-乙基己酸酯的鉴定。此外，没有其他的化合物始终和/或接近地匹配所述质谱。表U 在MTb文件中甲基2-乙基己酸酯质谱的相对离子丰度 在所述研究的过程中确定甲基2-乙基己酸酯有手性中心。某些生物(如MTb)可 产生所述化合物的单独手性形式，而非所述化合物的消旋混合物。因此，依赖于各种因素 (例如生物的来源、样品中的各种生物、所述生物的代谢状态和可选的培养条件)，所述化 合物的单独手性形式的有无可指示样品中MTb的有无。2h.检测其他芳香族化合物收集样品并进行如上通常所述的分析以鉴定指示样品中MTb存在的其他挥发物， 其包括2-甲基丙酸甲酯(CAS :547-63-7)、2，4_ 二甲基-1-庚烯(CAS 19549-87-2)、甲基 异丁基酮(CAS 108-10-1)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(CAS 110-93-0)、二甲基亚砜(CAS 67-68-5)、二 甲基硫(CAS :75-18-3)、1_ 乙氧基-2-甲基丙烧(CAS :627-02_1)、1-乙氧 基-丁烷(CAS 628-81-9)、叔丁基乙醚(CAS :637_92_3)、异丁醇(CAS :78_83_1)和图 22 中 的质谱代表的芳香族化合物。在下文的实施例4中详述图22中用于获得质谱的具体分析 条件。实施例3 本实施例描述了用于使用从GC-MS分析和DMS分析所得的数据鉴定样品中特定细 菌(例如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌)的方法。因此，本实施例也描述了用 于床旁诊断化验诊断工具产生数据库的数据库和方法以便于样品中细菌的快速鉴定。微机 械化DMS装置为床旁诊断化验诊断工具的例子。DMS装置是便携的，且所述检测方法能够分 析物的低检测限。具体而言，使用由GC-MS和DMS的同时分析以鉴定样品中医学重要的细菌(包括 金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌)。双系统平台允许在DMS中细菌VOC的光谱图 样与用GC-MS的各化合物结构的鉴定相关联，和DMS数据库的生成以允许基于仅DMS数据 的细菌鉴定。所述处理也导致了各特定细菌的生物标记物的多种VOC的发现。鉴定的金黄 色葡萄球菌生物标记物的利用能使鉴定在与其他医学重要的细菌的混合培养物中其的存 在。所述系统代表有力的平台，其中新型VOC的发现可适用于用DMS的检测。快速鉴 定和形成医学重要的细菌病原体的能力为所述平台的一项应用，并可加强生命威胁感染的 医疗护理。3a.背景目前的用于鉴定医学重要细菌的临床实验室方法依赖于较好建立的相对慢的微 生物技术，通常需要许多天用于物种形成。已很好的研究和开发不同类型细菌的独特生物 化学途径以用于细菌物种形成测试。这形成了临床鉴定平台(如API测试条(bioMerieux Vitek, Inc^Marcy-IEtoile，法国))的基础，其常用于形成细菌分离物。用于形成细菌的更多最新技术很大程度上依赖于基于核酸的检测方法，如聚合酶链式反应(PCR)，其为昂贵 的、需要有效的专业人员来执行、通常限于在多重格式内可检测生物的类型，并有产生由核 酸污染所致的假阳性结果的危险。因此，有将基于传统培养的技术的简单性、特异性和广泛 适用性与PCR的快速性和灵敏性结合的新技术的必要。由不同的细菌物种使用的不同组代谢途径导致了一组独有化合物的产生，其为它 们代谢的副产品。所述代谢副产品的子集，VOC为用于诊断检测的强候选生物标记物。VOC 是具有低蒸汽压和低水溶性的化合物。可通过各种技术(包括易被人嗅觉途径轻易感觉到 的那些)检测V0C，并代表医学技术人员能通过它们的气味鉴定细菌的基础。然而，由于(1) 灵敏性和(2)使用关于质量或质量片段的光谱信息以确定分子结构，GC-MS保持检测VOC的 黄金标准。不幸的是，在所述领域中或甚至在控制环境的外部(如先进的临床实验室)，目 前的GC-MS技术对于床旁诊断化验的应用是不可行的。这尤其由于便携性的相对缺乏、明 显的功耗和先进的维修需求。所述DMS装置为已显示检测选定的低至万亿分之几的VOC的微机械化传感器。然 而，与GC-MS相比，其为便携和相对不昂贵的。先前的用DMS的研究已显示了识别化合物、 使用图样识别区分细菌的种类和检测有高可靠性的化学或生物试剂的能力。然而，基于可 以痕量检测到V0C，有假阳性检测的明显忧虑。此外，基于当比较来自不同细菌和背景分析 物的DMS标记时足够特异性的缺乏，识别共用的DMS标记的图样识别算法难以适用于临床 诊断。在各种实施方式中，通过研制和开发同时用DMS和GC-MS鉴定化合物的双检测系 统，本发明成功使用了 DMS以鉴定样品中的特定细菌。因此，通过GC-MS可快速鉴定为细菌 或其他过程的生物标记物的V0C，并可同时确定相应的DMS谱图样且储存在库中以用于随 后的参照。一旦在DMS数据库中收集所述鉴定，然后只通过DMS将DMS谱图样用于细菌形 成。随后的方案描述了用于确定生物标记物的双检测系统的开发，并显示了使用只由床旁 诊断化验诊断工具所得的数据，所述平台如何被用于检测包含多种不同细菌物种的复合临 床样品中特定细菌和/或相关细菌株的存在、量和/或状态(例如存活、生长等)。此外，使 用下面的方案以鉴定和表征特定细菌的新型标记物。3b.方法与材料3b 1.仪器使用配备有Rtx _200MS三氟丙基甲基聚硅氧烷柱(30mX0. 32mm I.D.，1μπι厚 WII ；Restek Corporation ；Bellefonte, PA)白勺 Agilent 6890N(Agilent Technologies ； Palo Alto, CA)气相色谱仪完成VOC的色谱分离。通过标准溶液的使用每天监测多次色谱 性能的一致性。以2分钟清洗延迟的无分流模式在250°C的固定温度下操作沿SPME注射 套管(0. 75mm I. D. ； Supe Ico，Bellefonte，PA)排列的 GC 注射口。用 _125°C 的液氮低温冷 却 GC 柱(Cryogenic EnrichmentSystem CTE ；GERSTEL ；Baltimore, MD)的前端 2 分钟，而 在50°C维持所述GC炉。随后以20°C /秒提高低温冷阱至240°C，而最初以10°C /分钟提 高炉至67°C。经6分钟的保持后，以10°C /分钟升高炉温度至100°C，然后以20°C /分钟 升高至230°C的最终温度，其被保持3分钟。经0.25mm I. D.禾P0.5mm I. D 的保护柱使用 Press-Tight Y-connector (Restek Corporation ；Bellefonte, PA)将柱洗脱物引至 Agilent 5975 四极质谱仪(AgilentTechnologies ；Palo Alto, CA)和微分迁移光谱仪(SVAC-V 型，Sionex Corporation ； Bedford,MA)。不管两个检测器操作压上的不同，选择不同的保护柱以确保洗脱物的进一步 分开。加热DMS传感器的传输线至180°C以防止沿GC炉和DMS传感器间区段的冷凝。以 5. 25循环/秒的速度扫描39 300m/z值的电子碰撞电离模式操作质谱仪。每天都使用 PFTBA(AglientTechnologies ；Palo Alto, CA)在质谱仪上进行调节。以 0. 65 扫描 / 秒通 过从-26V至+8V的补偿电压的扫描来进行DMS分析，而色散电压维持在1100V，并在85°C 设置传感器温度。以400mL/分钟的流量使用氮作为漂移气。3b2.细菌培养物的制备在胰酶解大豆酪蛋白琼脂5%羊血平板(Remel,Lenexa，KS)上37°C过夜培养大肠 杆菌的ATCC株(ATCC#25924)、金黄色葡萄球菌的ATCC株(ATCC#25923新青霉素敏感型) 和肺炎克雷伯菌的ATCC株(ATCC#13883)。在补充1 %葡萄糖的肠发酵基础培养基(EFM， Becton Dickinson, Sparks, MD)中悬浮菌落，并将其稀释以获得指定光密度(OD6tltl = 0. 1) 的液体培养物。将其在37°C振荡(200rpm)培养直到细菌生长达到中对数期(约2小时)。3b3.提取过稈在40°C炉中预平衡固相微萃取纤维/支座集合至提取温度。以2mL的等分物将所 述培养物分配至IOmL SPME液上空间瓶(Supelcolnc. ；Bellafonte, PA)，并用具有隔的螺 帽密封，以制备各细菌的六个重复样品。通过吸取2mL的纯EFM培养基进六个液上空间 瓶的每个来制备对照样品。混合的样品由有相同光密度(0D_ = 0. 3)的等量细菌组成。在 轨道摇床(中等速度)上室温摇动所述瓶15 20分钟，然后将其取出并放在用户定制的 瓶支架上，所述瓶支架被设计为支持在提取期间的纤维集合。使SPME纤维去盖并穿透各瓶 的隔。一旦在40°C炉中安置所述支架，所述纤维接触培养物/对照的液上空间1小时。在 提取期的最后阶段，将所述纤维收回、从瓶中移出，并盖上盖。在2 8°C储存纤维集合，直 到通过GC/MS和DMS分析。使用组装于TuffSyringe 支架(Field Forensics ；St. Petersburg, FL)的 50/30 μ m 二乙烯基苯 /Carboxen/ 聚 二甲基硅氧烷(DVB/Carboxen/PDMS) SPME 纤维 (Supelco Inc. ；Bellefonte，PA)进行液上空间的提取，以便于操作。用用户定制的PTFE 尖安置纤维针，以限制运输和储存期间的污染。依据制造商的建议，初次使用前在250°C 270°C时使所述纤维适于GC注射口 1小时，以防止后遗作用。3c.结果3d.双系统的装备依据图IB中的流程图实施双检测系统，以在确定DMS特定光谱图样时便于细菌特 异性VOC的快速确定。在GC柱的近端使用冷冻调焦装配以便于复合混合物的快速鉴定。这 能使其有收集的VOC的更好分辨率。基于所述能力可用选择的30米Restek柱装备气相色 谱仪器以分离V0C。用Y连接器分开柱的末端，以同时转移柱洗脱物至DMS和MS。当在大 气压下运行所述DMS时，将较窄的ID保护柱用于转移所述洗脱物至MS，以减弱来自MS的真 空拉力。测量流量以确认所述分流可均勻的分布洗脱物至两个传感器平台。加热至DMS的 传输线，以确保样品洗脱液中不发生冷凝。在样品导入期间实行MS和DMS的同时起动以确 保在MS和DMS软件的收集参数间同步化启动时间。尽管由于在传输线长度上的差异而发生了轻微的变化，导入的分析物的持续时间是大约相同的。两个传感器输出间持续时间上的差异总是低于5%，因此能确定相应的DMS 峰禾口 MS峰。3c2.提取参数的优化一旦建立了双检测平台的参数，与SPME联合使用系统，以鉴定细菌特异挥发性有 机化合物。因为有许多类型的SPME涂层，测试许多类型以鉴定优化的涂层。事先鉴定三相 纤维以能提取最广泛范围的VOC(包括极性、非极性和半挥发性化合物)。当与其他的SPME 涂层比较时，测试通过显示所述纤维有更大量的提取的不同化合物来证明这一点。例如，与 200的PDMS/DVB纤维相比，所述PDMS/DVB/Carboxen纤维有平均为350的特有挥发物。对 提取温度和时间进行了进一步的优化，其显示在37°C的1小时的提取产生了与更高温度和 更长提取时间约相同数量的峰。甚至尽管高于70°C的温度也可提高化合物的挥发性，但因 为其可破坏细菌从而产生与稳健的新陈代谢无关的V0C，并未这样操作。3c3.细菌牛物标记物的鉴定一旦优化了样品制备和仪器参数，用双GC-MS/DMS系统进行了细菌生物标记物的 鉴定。在有葡萄糖碳源的肠发酵培养基上培养医学重要细菌。制备每个细菌的六个重 复来控制样品间的变化并获得足够数量的样品以用于准确丰度的计算。由菌落培养三种不 同物种的医学重要细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌)至0. 6的0D_以使 其在对数生长期。用培养基对照进行所有的实验。此外，在工作空间中也利用了空白纤维 以控制可能污染纤维的环境来源的V0C。然后使用有随机进入区域的样品的GC-MS和DMS 仪器提取和分析VOC以避免混淆错误。分析细菌培养物中存在但仅培养基或空气对照中不 存在的特有化合物的输出。图18A和18B分别示三种不同细菌和对照的例示DMS及DMS和 GC-MS的例示色谱输出。在所述图中，以圆圈(图18A)或通过箭头(图18B)显示指示代 表性细菌的例示VOC峰。依赖于围绕或叠加候选化合物信号的噪音或其他信号，DMS数据 (图18A)和GC-MS数据(图18B)输出的比较显示样品中特定细菌的指示峰在一个分析中 对比在其他的分析中更明显。因此，在各种实施方式中，可通过仅一种分析技术(如DMS或 GC-MS)或多于一种分析技术检测样品中特定细菌(例如MTb、Staph、Kleb或E. coli)的指 示 V0C。一旦使用匹配统计及正向和反向分析(类似于先前描述的实施例的方法)由NIST 确定候选化合物，排序候选标准物，并在相同的条件下通过运行所述标准物来确认它们的 特性。表V列出了在鉴定中有中等或高可信性的三种不同类型细菌的例示挥发性生物标记 物。表V 特定细菌的例示VOC-生物标记物 3c4.复合混合物实验对于复合混合物(如痰或血液)中特定细菌的检测，重要的是显示了从可能污染 样品的不同细菌中检测特定细菌的能力。例如，痰样品通常可被口腔微生物丛(如草绿色 链球菌(Sti^ptococcis viridans)、非致病奈瑟菌(Neisseria)和各种厌氧菌)污染(见， 例如 Manual ofClinical Microbiology, 9th Edition)。为了显示特定细菌的 VOC 和 / 或 VOC的组合能鉴定在细菌混合物中的细菌，制备有或无需要在临床环境中快速鉴定的攻击 性病原体_金黄色葡萄球菌的含肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的等量混合物的培养物，以优化 患者结果。图19A和19B分别示(i)大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的混合物、(ii)金黄色葡萄 球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的混合物、(iii)仅金黄色葡萄球菌和(iv)培养基对照的 例示DMS及DMS和GC-MS的例示色谱输出。在所述图中，以圆圈(图19A)或通过箭头(图 19B)显示例示VOC峰。所述混合物的分析显示甚至通过生物标记物特异性DMS数据(见图 19A和19B，及表W)的视查，可从大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中区分出金黄色葡萄球菌。随后 使用DMS数据区分含金黄色葡萄球菌的培养物的多种算法的准确性分析显示100%的准确 性，其提示使用便携式DMS传感器所述生物标记物能直接在临床分离物中进行金黄色葡萄球菌的鉴定。表W 复合混合物中细菌的检测 具体而言，可重叠合在复合样品中检测到的VOC以鉴定样品中的特定细菌。如在 表X中所示，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的复合混合物中，通过检测样品 中的2，3- 丁二酮、3-羟基-2- 丁酮和/或苯乙醛来鉴定出金黄色葡萄球菌。通过检测样品 中的2-庚酮和/或2-壬酮鉴定出肺炎克雷伯菌。简言之，可确定复合样品中无特定细菌。 例如，样品中无甲硫醇表明所述样品中无大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。在图20和21中显示了 示大肠杆菌特异性、肺炎克雷伯菌特异性和金黄色葡萄球菌特异性VOC的GC-MS色谱的例 示区段。具体而言，依赖于样品中的其他生物，对大肠杆菌(或肺炎克雷伯菌)甲硫醇是特 异性的；对肺炎克雷伯菌2-庚酮或2-壬酮是特异性的；对金黄色葡萄球菌3-羟基-2- 丁 酮、苯乙醛或2，3_ 丁二酮是特异性的。此外，样品中无所述化合物可指示样品中无相应细 菌。表X 复合样品中的细菌特异性VOC Y =可检测到的；ND =未检测到的3d.讨论3dl.挥发件牛物标记物方法所述实验部分描述了用于细菌VOC生物标记物鉴定的双检测系统的建立和应用。 因为与需要核酸或蛋白的分离和鉴定的传统方法相比，气体(例如样品中的液上空间气体)的检测需要少得多的样品处理时间和专业知识，VOC为有力的诊断生物标记物。然而， 因为VOC通常以痕量(万亿分之几及更低)存在，有污染和/或错误鉴定的潜在性。因此， 尤其对于复合样品技术的应用，只使用没有化合物结构的之前、同时和/或随后鉴定的图 样识别算法可引入错误，尤其对复合样品的技术的应用中。为了解决所述问题，可用GC-MS 同时鉴定用DMS传感器检测到的化合物，以确定化合物的特性，并产生可被参照的DMS床旁 诊断化验装置的数据库，以鉴定只使用DMS床旁诊断化验装置的随后的样品。床旁诊断化 验装置的能力在于便携性、准确性和速度。使用双检测平台以建立床旁诊断化验装置的数 据库允许了使用的床旁诊断化验形式并在临床和/或野外环境中直接给出结果。3d2.应用，包括体外诊断、呼吸分析和环境监控上述数据显示了 DMS系统的能力以鉴定医学重要细菌(金黄色葡萄球菌)的生物 标记物。此外，使用所述生物标记物以高准确性的鉴定多种细菌混合物中金黄色葡萄球菌 的存在。这显示了使用床旁诊断化验装置鉴定混合样品中细菌的能力。因此，如果检测限是 低的，且从背景挥发物中区分VOC的能力为足够的，所述技术能进行各种来源(例如血液、 痰、土壤、水、工业产品和/或工业废物流)中细菌的快速物种确定。例如，将本发明的实施 方式用于肺部感染的呼吸分析。已知金黄色葡萄球菌为在医院获得性或呼吸机有关的肺炎 中涉及的重要病原体。如果能检测所述细菌的挥发性生物标记物的存在或增多，然后早期 干预可拯救生命，且节省与所述感染和污染相关的大量医疗费用。可通过本文所述方法进行模拟临床样本中细菌的挥发性生物标记物的进一步表 征和细菌标记物库的验证。因为所述DMS装置的便携性，在不需要中央微生物实验室的情 况下，所述检测平台的野外应用是可行的。例如，小诊所或老人护理站可使用本文所述方法 诊断细菌特异性肺炎。此外，因为临床医生可开发和使用床旁诊断化验数据库以检测宿主 和病原特异性VOC的广泛种类，对样本或呼吸样品的DMS生物标记物分析的应用能使平台 同时检测宿主疾病进程。实施例4 本实施例显示某些VOC始终与在不同类型培养基中的特定细菌有关。此外，本实 施例显示在某些情况下，细菌VOC表达可依赖于培养基的组成。所述方法对用于检测和/ 或定量样品中细菌及用于鉴定培养基特异性的VOC和非培养基特异性的VOC的改良方法是 有用的。4. 1 培养在均用10% OADC富集物补充的Middlebrook 7H10琼脂或7H9肉汤中维持结核 分枝杆菌株H37Rv。以4000rpm沉淀所述细胞5分钟，用磷酸盐缓冲液洗涤，并在包含棕榈 酸(0. w/v)、甘油(0. )、胆固醇(0.01% )或丙酸钠(0. 10% )的最小培养基 (0. 5g/L 天冬酰胺、lg/L KH2PO4,2. 5g/L Na2HPO4、50mg/L 枸橼酸铁铵、0. 5g/LMgS04 · 7H20、 0. 5mg/L CaCl2,0. lmg/L ZnSO4)中重悬。以ImL的等分将所得的培养物分配至液上空间瓶 以建立五或六个各重复。通过吸取纯培养基进入瓶中产生未经接种的对照培养物。在37°C 过夜培养全部样品且使其在37°C经受30分钟的SPME液上空间提取。4. 2 样品分析使用配备有Rtx _200MS三氟丙基甲基聚硅氧烷柱(30mX0. 32mm I.D.，1μπι厚 WII ；Restek Corporation ；Bellefonte, PA)白勺 Agilent 6890N(Agilent Technologies ；Palo Alto，CA)气相色谱仪完成色谱分离。用 Merlin Microseal (Supelco Inc.； Bellefonte, PA)配置 GC 注射 口，并沿 0. 75mm I. D. SPME 注射套管(Supelco Inc.)排列 GC注射口。用4. 75psig的固定操作压将所述输入部设置在270°C (DVB/Carboxen/PDMS纤 维)或300°C (Carboxen/PDMS纤维)的温度；在分析物脱附(2分钟)期间以无分流模式 运行，随后以分流模式(20mL/分钟分流)运行GC程序的剩余部分。始终维持2. OmL/分钟 的柱流量。使用经SGT三重滤器(Restek Corp.)净化的瓶装氦气(99. 99%纯度)作为载 气。在脱附期间用的液氮低温冷却GC柱(Cryogenic Enrichment System CTE ；GERSTEL ； Baltimore, MD)的近端至_125°C，然后经2分钟的维持从20°C /秒提高至240°C。主要的 炉温程序如下50°C的初始温度，保持2分钟后以10°C /分钟处提高至67°C，保持6分钟 后，以10°C /分钟升高至100°C，然后以20°C /分钟升高至230°C并保持3分钟。分另Ij经 0. 25mm I. D.和 0. 5mm I. D 的保护柱使用 Press- Tight Y-connector (Restek Corp.)以同时将GC柱洗脱物引至Agilent 5975四极质谱 仪(Agilent Technologies ；Palo Alto, CA)和微分迁移光谱仪(SVAC-V 型，Sionex Corporation ；Bedf0rd，MA)。选择所述保护柱以补偿在检测器操作压上的巨大差异(DMS单 元在大气压下运行而MS检测器在约5X 107torr处工作)。经验的流量测量确认可均勻分 配柱洗脱物至两个传感器平台。使用弹性加热带和调压变压器加热DMS的传输线至180°C 以防止冷凝。液氮充当DMS偏流气，其具有400mL/分钟的流速。随着以1.28秒/扫描的 速度扫描从-26V至+8V的补偿电压，进行DMS数据收集。在1100V维持DMS色散电压，并 在85°C操作63Ni源。以5. 25循环/秒的速度用在39 300m/z范围内的全扫描模式记录 MS谱。在分析物脱附的起始处同时引发MS和DMS数据收集以确保与时域的同步化。4. 3 不同样品培养基中细菌VOC表汰在一组实验中，样品培养基各包含一种不同脂质-类型的碳源，即胆固醇、棕榈 酸或丙酸钠。在每个培养基中培养MTb，并摇动所述细胞以提高细胞对氧气的利用能力。使 用上文所述方法检测提取的V0C。在表Y中显示所得数据。在三个培养基类型的每一个都 可检测甲基-2-乙基己酸酯和具有图22所示的MS谱的额外的芳香族化合物。如图23所 示，在培养基中未观察到具有图22中所示的MS谱的芳香族化合物，也未在相同的条件下制 备的耻垢培养物中观察到。具体而言，使用上述的分析方法图23显示了具有图22中所示 的MS谱的、具有约18. 44分钟持续时间的芳香族化合物的峰。所述峰在所述Mtb样品中存 在，但在样品对照或耻垢样品中不存在。所述实验显示某些VOC (如甲基-2-乙基己酸酯和具有图22中所示的MS谱的额外 的芳香族化合物)与不同培养基中的特定细菌有关。另外，某些V0C(如丙酸甲酯和3-戊 酮)与在单独培养基中的细菌有关。(即在培养基中存在丙酸盐时存在)表Y 在三种不同培养基脂质上摇动的MTb培养物 *=未确定总体而言，由所述实验所得的VOC数据显示了在有基于丙酸盐的培养基的MTb培 养物中可检测到特定VOC (即丙酸甲酯、3-戊酮、甲基-2-己酸乙酯和具有图22中所示谱图 样的额外的芳香族化合物)。用振荡选择胆固醇、棕榈酸盐和丙酸盐的特定培养基源，以模拟身体细胞内隐蔽的典型MTb细菌的细胞内环境。因此，除了显示不管改变培养基和/或 来源条件，某些VOC可始终鉴定特定细菌之外，可在从身体(例如从个体的呼吸)直接获得 的样品的VOC数据库中使用所述数据。4. 4 不同浓度丙酸盐中MTb VOC表汰在另一组实验中，用含浓度0. 10%的丙酸钠的培养基培养MTb。使用上述的 方法检测提取的V0C。提取的某些VOC (丙酸甲酯、3-戊酮、2-甲基丙酸甲酯和2-乙基己酸 甲酯)量依赖于培养基中的丙酸盐浓度。在图24A和24B中描述了培养基浓度对丙酸甲酯 的表达的影响。4. 5 培养干不同鉬合脂类中的MTb VOC表汰在另一个实验中，在含有一种或多种碳源(即丙酸盐(0. 3% )、甘油(0. )和 /或胆固醇(0.01%))的培养基的组合上培养MTb。使用上述方法检测提取的V0C。提取 的某些VOC(丙酸甲酯、3-戊酮、2-甲基丙酸甲酯和2-乙基己酸甲酯)量依赖于培养基的 成分。在一种情况下，如图25中的GC-MS总离子色谱所示，在含丙酸盐和甘油或丙酸和胆 固醇的培养基中极大的提高了由MTb表达的丙酸甲酯量。实施例5 所述实验显示可使用一种或多种VOC以鉴定样品中特定细菌的状态(例如存活、 生长等)。特别的是，MTb培养物接受了抗生素的处理，且可检测到所述V0C。在表Z中显 示所得结果。表Z 接触抗生素后的MTb VOC 表AA中的结果显示经VOC检测可鉴定MTb的有效抗生素处理。援引并入本文将本文涉及的每个出版物、专利文件和其他参考文献的整个公开内容通过引 用整体并入本文以用于通过弓I用并入单独指定每个个体来源的相同程度的所有目的。等同发明
在未背离本发明的精神或基本特征的情况下，可以其他的具体形式实施本发明。 因此要以所有的说明性方面考虑上述的实施方式而非限制在本文所述的发明上。因此通过 附加的权利要求而非通过上述的说明指明本发明的范围，并希望等量权利要求的含义和范 围内的所有变化被包含在其中。权利要求为
权利要求
用于鉴定样品中结核分枝杆菌细菌的方法，所述方法包括a.收集疑似包含结核分枝杆菌细菌的样品；及b.检测一种或多种挥发性有机化合物，●所述一种或多种挥发性有机化合物指示■所述样品中所述结核分枝杆菌细菌的存在、或者■对所述样品中所述结核分枝杆菌细菌的治疗或抗性的应答，●所述一种或多种挥发性有机化合物选自甲氧基苯(苯甲醚)、2 丁酮、2 乙基己酸甲酯、手性形式的2 乙基己酸甲酯、丙酸甲酯、2 戊酮、3 戊酮、2，4 二甲基 1 庚烯、甲基异丁基酮、6 甲基 5 庚烯 2 酮、二甲基亚砜、二甲基硫、2 甲基丙酸甲酯、1 乙氧基 2 甲基丙烷、1 乙氧基丁烷、叔丁基乙醚、异丁醇和图22中的质谱代表的芳香族化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含甲氧基苯(苯甲 醚)。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含2-丁酮。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含2-乙基己酸甲酯。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含丙酸甲酯。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含2-戊酮。
7.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含3-戊酮。
8.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含2，4-二甲基-1-庚火布。
9.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含甲基异丁基酮。
10.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含6-甲基-5-庚 烯-2-酮。
11.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含二甲基亚砜。
12.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含二甲基硫。
13.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含2-甲基丙酸甲酯。
14.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含1-乙氧基-2-甲基丙烧。
15.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含1-乙氧基丁烷。
16.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含叔丁基乙醚。
17.权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含异丁醇。
18 .权利要求1的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物包含图22中的质谱代 表的芳香族化合物。
19.权利要求1的方法，其中两种或多种挥发性有机化合物的组合指示所述样品中结 核分枝杆菌的存在、或对所述样品中所述结核分枝杆菌的治疗或抗性的应答。
20.权利要求1的方法，其中所述样品经历用于处理结核分枝杆菌的候选治疗。
21.权利要求1的方法，其中所述样品包含来自个体的呼出气。
22.权利要求1的方法，其中所述样品选自痰、血液、尿液、胸膜液和胸膜的活体检查 组织。
23.权利要求1的方法，其中一种或多种挥发性有机化合物的量被检测。
24.权利要求1的方法，其中所述检测使用便携式装置进行。
25.权利要求1的方法，其中所述检测使用微分迁移率光谱仪进行。
26.鉴定样品中结核分枝杆菌细菌的装置，所述装置包含a.接受疑似包含结核分枝杆菌细菌的样品的输入部；和b.用于检测一种或多种挥发性有机化合物的工具， 所述一种或多种挥发性有机化合物指示■所述样品中所述结核分枝杆菌细菌的存在、或者 ■对所述样品中所述结核分枝杆菌细菌的治疗或抗性的应答， 所述一种或多种挥发性有机化合物选自甲氧基苯(苯甲醚)、2_ 丁酮、2-乙基己 酸甲酯、手性形式的2-乙基己酸甲酯、丙酸甲酯、2-戊酮、3-戊酮、2，4_ 二甲基-1-庚烯、 甲基异丁基酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二甲基亚砜、二甲基硫、2-甲基丙酸甲酯、1-乙氧 基-2-甲基丙烷、1-乙氧基丁烷、叔丁基乙醚、异丁醇和图22中的质谱代表的芳香族化合 物。
27.用于鉴定样品中结核分枝杆菌细菌的方法，所述方法包括a.收集疑似包含结核分枝杆菌细菌的样品；b.使用包含丙酸盐的培养基培养所述样品；及c.检测一种或多种挥发性有机化合物， 所述一种或多种挥发性有机化合物与包含丙酸盐的培养基上的结核分枝杆菌代谢 有关，且 所述一种或多种挥发性有机化合物指示■所培养样品中所述结核分枝杆菌细菌的存在、或者■对所培养样品中所述结核分枝杆菌细菌的治疗或抗性的应答。
全文摘要
在各种实施方式中，本发明涉及用于鉴定样品中特定细菌存在的方法。所述方法包括收集包括或已与特定细菌接触的样品，及在样品中检测指示细菌存在的至少一种挥发性有机化合物。
文档编号C12Q1/04GK101918583SQ200880117761
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月17日 优先权日2007年10月19日
发明者J·M·特雷韦霍, P·瑞尔登, S·霍尼格曼 申请人:查尔斯斯塔克德雷珀实验室公司