治疗肠炎性病症的组合物的制作方法

专利名称：治疗肠炎性病症的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗肠炎性病症的领域。本发明特别地涉及使用包括针对来自人类普 通饮食的食物抗原的人Trl细胞的药剂治疗炎性肠病和与食物不耐受或变态反应有关的 肠炎的方法。
背景技术：
如本文使用的肠炎性病症指炎性肠病和与食物不耐受或变态反应有关的炎症。炎性肠病(IBD)指一组疾病，包括克罗恩病(Crohn’ s disease)和溃疡性结肠炎 两者。这两种疾病经常被分为一组是因为它们具有相似的发病机制和临床表现。在缺少侵 入性影像学研究的情况下，不可能区分这两种疾病，在许多出版物和研究中这两种疾病经 常被认为是一种疾病。任一种疾病的明确诊断都需要影像学研究诸如内窥镜检查(乙状结 肠镜检查或结肠镜检查)、双重对比钡剂灌肠法和计算机体层摄影(CT)扫描；结合以实验 室试验，包括全血细胞计数以检测升高的白细胞水平、红细胞沉降率和血清白蛋白浓度。两种疾病均为慢性复发/缓解型胃肠道炎性疾病。克罗恩病最常累及的胃肠道区 域是小肠和大肠，后者也称为结肠，包括直肠；然而，克罗恩病可累及从口至肛门的整个胃 肠道。可存在单个或多个炎症斑。溃疡性结肠炎仅累及大肠。溃疡性结肠炎中的炎症和溃 疡限于粘膜和粘膜下层，它们是大肠的四个层中最内侧的两个层。克罗恩病中的炎症和溃 疡可蔓延至小肠和大肠两者中肠壁的所有层。疾病的常见症状包括腹泻、腹痛、直肠出血和 体重减轻。克罗恩病的并发症包括肠痈、瘘、从肠的一部分通向另一部分并允许液体或分泌 物通过的异常通道，以及肠梗阻。一般来说，两种疾病的病程是间歇性的，疾病的加重伴随 着缓解期。然而，溃疡性结肠炎可以是单发事件，或具有不间断症状的连续事件。尽管对于IBD的治疗干预有许多选择，但许多具有不合乎需要的副作用，使得对 于治疗慢性疾病是不太理想的。对于轻度的溃疡性结肠炎，一般一线治疗是经口或局部 (即，灌肠法)递送氨基水杨酸盐。氨基水杨酸盐类由含有5-氨基水杨酸(5-ASA)的药剂组 成，其是在IBD中采用的一种最古老的抗炎化合物。以高剂量使用时，5-ASA可诱导急性发 作的缓解。尽管通常用于维持治疗，但5-ASA已经证明不能有效地维持缓解。常用的5-ASA 制剂包括柳氮磺吡啶、口服和局部使用的美沙拉嗪(mesalamine)、奥沙拉秦(olsalazine) 和巴柳氮。各种制剂被修饰以将可获得的活性药物提供至目的部位(例如，小肠或大肠)。 然而，使用5-ASA，副作用很常见。皮质类固醇是诱导IBD发作缓解的最有效的药剂之一，并且一般是用5-ASA治疗 失败时的第二治疗选择。化合物首先经口或直肠递送，同时伴随或不伴随5-ASA的给药。在 口服递送失败时，该化合物经静脉内给药。理想地，皮质类固醇仅用于短程的治疗，并且疾 病缓解时逐步停药。通常用于治疗IBD的皮质类固醇包括泼尼松、布地奈德和氢化可的松。 与皮质类固醇的应用相关的许多严重和显著副作用限制了其应用。短期使用的常见副作用 包括失眠、盗汗、情绪变化和葡萄糖代谢改变。长期维持治疗一般仅保留用于严重的难治性 病例。长期治疗可导致肾上腺萎缩，而突然停药可导致肾上腺皮质功能不全、低血压、甚至
3死亡。其他副作用包括痤疮、异常脂肪沉积、毛发过度生长和骨质疏松症。在克罗恩病中， 皮质类固醇可妨碍瘘的愈合，加重疾病状态。对口服或直肠皮质类固醇制剂有反应的个体经常施以维持量的5-ASA。然而，一些 医生在缓解期期间不提供药物干预。需要静脉皮质类固醇治疗的个体一般以免疫抑制剂与5-ASA的组合来维持，上述 免疫抑制剂诸如6-巯基嘌呤和/或硫唑嘌呤。此类严重疾病一般考虑胃肠外营养。当患 者对上述治疗无反应时，可尝试施用免疫抑制剂环孢素A来避免手术去除患病的肠段。免 疫抑制剂干预不是没有不合乎需要的副作用。6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤可引起发热、皮疹、恶 心和头疼，更严重的副作用包括白细胞减少、胰腺炎、严重感染和骨髓抑制。环孢素A可具 有更严重的副作用，包括感觉异常(类似灼伤或麻刺感的异常感觉)、毛发过度生长、高血 压、震颤、肾功能不全、头痛和机会性感染。抗生素，一般为环丙沙星或双唑泰栓，用作5-ASA或皮质类固醇的添加治疗(add on therapy)，尤其是患有瘘管性或结肠疾病的患者。与所有其他治疗一样，施用抗生素长 期治疗也有副作用。英夫利昔单抗(Infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)是目前药物治疗炎性肠 病的最后手段。英夫利昔单抗是由75%人蛋白和25%鼠蛋白组成的嵌合单克隆抗体，而阿 达木单抗是全人源化抗体。英夫利昔单抗和阿达木单抗是α -肿瘤坏死因子(TNF-α )—— 一种强有力的炎性细胞因子——的抑制剂。该药物通过结合可溶性和膜结合的TNF-α而 用作槽(sink)。通过抑制在炎性级联反应中高的激活剂，可抑制许多炎性通路。如在产品 标签中所标明的那样，该药物首先经静脉给药治疗，随后每8周用作维持药物。然而，因为 其是生物药剂，因此免疫反应可限制该药物的实用性。因此，免疫抑制剂一般与英夫利昔单抗维持治疗联合施用。正如炎性肠病的所有 其他治疗一样，英夫利昔单抗也有严重的副作用。TNF-α在赘生性细胞的根除中具有重要 作用；因此，其抑制会导致机会性感染、恶性肿瘤和其他并发症，尤其是作为长期治疗策略 更是如此。手术干预是治疗炎性肠病的一种方法，但非根治性的。由于IBD的慢性性质和相 对早的发病年龄，在对药物干预无反应的患者的一生中可能需要多次手术。有可能去除几 段短的肠段而没有严重的副作用。然而，去除较大的或多段肠段可导致短肠综合征，患有短 肠综合征的个体不能吸收营养素。部分大肠的去除可导致需要进行结肠造口术或其他更进 一步的手术操作。因此，手术不是治疗炎性肠病的优选方法。治疗炎性肠病的手术干预会 导致更多的疾病。在完全去除结肠时，外科医生可从小肠建造回肠贮袋以允许粪便通过肛 门，而不需要永久的造口。贮袋炎(Pouchitis)是回肠贮袋的一种非特异性炎症，其一般在 重建后的前两年内发生。症状包括排便频率的不断增加，可伴有失禁、出血、发热和/或急 迫感。在具有溃疡性结肠炎的患者中，近20 30%经历至少一次发作。抗生素足以治疗贮 袋炎；然而，仍需要类似于IBD中使用的那些治疗的其他更积极的治疗方法。在近年来治疗炎性肠病的新治疗方式中，W02007/027132公开了一种治疗所述疾 病的方法，包括施用从患者的前哨淋巴结收集并在体外扩增的调节性CD4+CD25+T细胞。另一种类型的肠炎性病症是由于食物不耐受或变态反应弓丨起的。人类在消耗饮食 蛋白质后常常或多或少地遭受严重的变态反应或不耐受反应。在成人中食物变态反应或不耐受的流行率为大约1_2%，在儿童中为大约6-8%。食物变态反应或不耐受主要与有限范 围的食品有关，主要是花生、坚果(tree nuts)、鸡蛋、牛奶、小麦(谷蛋白)、大豆、鱼和贝壳 类。迄今，对于食物变态反应或不耐受没有有效的治疗方法。大多数过敏体质的或不 耐受的个体使自己适应于自身处境并避免摄入他们过敏或不耐受的食品。可使用涉及药 物，诸如抗组胺剂、解充血剂或类固醇的治疗方法，但这些方法仅可用于对抗不耐受或过敏 反应的症状。它们不预防未来接触变应原或饮食蛋白所导致新的变应原性反应或新的不耐受。在本发明中，由此，申请人的目的是提供一种基于使用Trl细胞的用于肠炎性病 症的治疗方法，该细胞不同于调节性CD4+CD25+T细胞。Groux等人(Nature 1997，389 :737_742)描述了在小鼠中抗原(卵清蛋白)特异 性Trl细胞的传递仅当所述Trl细胞在体内被抗原(在本例中，通过给小鼠饲以卵清蛋白) 刺激时，防止由致病性CD4+CD45RBST细胞诱发的炎性肠病。另外，Foussat等人(Journal of Immunology 2003，171 =5018-5026)描述了抗原(卵清蛋白)特异性Trl细胞和抗原 (饮用水中的卵清蛋白)的共同施用治愈了小鼠中持续发生的炎性肠病。抗原的共同施用 是Trl细胞发生效力的必要条件。根据本发明，本发明人的目的是提供一种治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的 方法，所述治疗基于单独施用针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞。特别地，本发 明人惊奇地发现所述针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞不需要与Trl细胞所针 对的抗原共同施用而发生效力。发明概述本发明涉及一种组合物，包含至少一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的人 Trl细胞群。所述来自人类普通饮食的食物抗原优选地选自包括下列的组牛抗原、钙结合的 S100、α-乳清蛋白、乳球蛋白诸如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、大西洋鲑鱼抗原、 鸡抗原、卵清蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清蛋白、虾抗原、小麦抗原、芹菜抗原、胡 萝卜抗原、苹果抗原、苹果脂质转运蛋白、苹果肌动蛋白抑制蛋白(profilin)、梨抗原、异黄 酮还原酶、鳄梨抗原、杏抗原、桃抗原、大豆抗原、花生、卵清蛋白，它们的片段、变体和混合 物。优选地，所述食物抗原是卵清蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白、大豆蛋白、麦醇溶蛋白、花生， 它们的片段、变体和混合物。本发明的另一个目的是提供包括本发明的组合物的药剂或药物组合物。本发明还涉及一种治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方法，包括向所述对象 施用有效量的本发明的药剂或药物组合物。在本发明的优选实施方案中，所述方法用于治疗炎性肠病。在本发明的一个实施 方案中，所述炎性肠病是克罗恩病。在本发明的另一实施方案中，所述炎性肠病是溃疡性结 肠炎。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述方法用于治疗与食物变态反应或不耐 受有关的肠炎。在一个实施方案中，所述食物不耐受是乳糜泻疾病。在另一个实施方案中， 所述食物变态反应是乳蛋白变态反应。在另一个实施方案中，所述食物变态反应是花生变态反应。在另一个实施方案中，所述食物变态反应是卵清蛋白变态反应。在一个优选的实施方案中，要施用于需要其的对象的药剂或药物组合物包括与所 述对象的细胞自体同源的人Trl细胞。在本发明的另一个实施方案中，治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方法包括 将有效量的本发明的药剂或药物组合物与用于治疗肠炎性病症的另一种治疗剂联合施用 于该对象。附图简要说明

图1 小鼠抗鱼蛋白Trl和小鼠抗大豆蛋白Trl淋巴细胞的细胞因子表达谱。(A) 由小鼠抗鱼蛋白Trl细胞产生的IL-4、IL-10和IFN-γ。(B)由小鼠抗大豆蛋白Trl细胞 产生的 IL-4、IL-10 和 IFN- γ。图2 小鼠抗鱼蛋白和小鼠抗大豆蛋白Trl细胞控制小鼠中的结肠炎。(Α和B)体 重减轻的分析。(C)由小鼠抗大豆蛋白Trl细胞产生的IFN-Y。图3:来自健康供体的卵清蛋白特异性Trl克隆的细胞因子和扩增谱。2种不同的 克隆的实例。(A)每周用人工果蝇来源的饲养细胞刺激一次，通过细胞计数每周评估卵清 蛋白Trl克隆的扩增量一次。(B)在存在抗原呈递细胞的两天期间评价特异性激活后Trl 克隆的卵清蛋白特异性。对被指定为质量控制测试实例的三个克隆，通过ELISA测定上清 液中卵清蛋白特异性的IL-10产量。结果表示为采用或不采用卵清蛋白的刺激条件之间 IL-10产量的增量(Δ )。(C)通过ELISA评价抗-⑶3+抗-⑶28激活的Trl克隆的上清液 中的Trl特异性细胞因子产生谱。图4 卵清蛋白特异性Trl克隆抑制活性。2个不同克隆的实例。㈧分级浓度的 卵清蛋白特异性Trl克隆对共培养中自体CD4+T细胞的增殖的抑制活性。(B)激活的卵清 蛋白Trl克隆的稀释培养上清液对自体⑶4+Τ细胞的抑制活性。(C) IL-10和TGF-β单克 隆抗体对Trl上清液介导的T-细胞增殖的阻断。图5 卵清蛋白特异性Trl克隆的表型。㈧通过流式细胞术评价激活的卵清蛋白 特异性Trl克隆上的表面⑶25、GITR和细胞内Foxp3和CTLA-4表达。(B)评价在激活后 (第0天)和缺少刺激物时培养14天期间的标志物表达的动力学。图6 体外用果蝇来源的饲养细胞扩增并已经进行了 30次以上倍增的卵清蛋白特 异性Trl克隆的核型检查。图7 来自克罗恩病患者的卵清蛋白特异性Trl克隆的细胞因子和扩增谱。㈧评 价在存在抗原呈递细胞的两天期间抗原特异性激活后Trl克隆对卵清蛋白的特异性。对被 指定为质量控制测试实例的三个克隆，通过ELISA测定上清液中卵清蛋白特异性的IL-10 产量。结果表示为采用或不采用卵清蛋白的刺激条件之间IL-10产量的增量(△)。(B)通 过ELISA评价抗-⑶3+抗-⑶28激活的Trl克隆的上清液中的Trl特异性细胞因子产生谱。 (C)每周用人工果蝇来源的饲养细胞刺激一次，通过细胞计数每周评估两个Trl克隆的卵 清蛋白扩增量一次。图8 患者缓解的分析。CDAI (A)、腹痛⑶或每周的液体粪便或软便(C)，以及舒 适度评分(well being score) (D)的分析。发明详述定义
本文使用的术语“Trl细胞”指静息时具有⑶4+⑶25-FoxP3-表型并且在激活时 能够分泌高水平IL-10和低至中等水平的TGF-β的细胞。Trl细胞的特征部分在于其独 特的细胞因子谱它们产生高水平的11^-10，显著水平的16 -0和中等水平的IFN-γ，但表 达很少或不表达IL-4或IL-2。细胞因子的产生典型地在用T淋巴细胞的多克隆激活物诸 如抗-⑶3+抗-⑶28抗体或白介素-2、PMA+伊屋诺霉素(ionomycin)激活后的培养细胞中 评价。可选地，细胞因子的产生在用由抗原呈递细胞呈递的特异性T细胞抗原激活后的培 养细胞中评价。高水平的IL-10对应于至少约500pg/ml，典型地大于约1、2、4、6、8、10、12、 14、16、18、或20纳克(IOOOpg)/ml或更高。显著水平的TGF-β对应于至少约100pg/ml，典 型地大于约200、300、400、600、800或1000pg/ml或更高。中等水平的IFN-γ对应于包括 0pg/ml 至少 400pg/ml (典型地大于约 600、800、1000、1200、1400、1600、1800 或 2000pg/ ml或更高)之间的浓度。很少或无IL-4或IL-2对应于小于约500pg/ml，优选地小于约 250,100,75 或 50pg/ml 或更少。本文使用的术语“抗原”指被本发明的细胞的使用所调节的或用于本发明的任何 一种方法中的蛋白质或肽。在一个实施方案中，术语“抗原”可以指合成来源的分子，或天然 来源的分子，它们与目的抗原具有一定的序列同源性，或与目的抗原具有一定的结构同源 性，或其组合。在一个实施方案中，抗原可以是模拟抗原表位(mimetope)。抗原的“片段” 指抗原的任何亚组，如短肽。抗原的“变体”指与整个抗原或其片段基本上相似的分子。变 体抗原可使用本领域熟知的方法通过变体肽的直接化学合成来方便地制备。 本文使用的术语“对象”指人。本文使用的术语“有效量”指足以引起有益的或所需的临床结果(例如，临床状况 改善)的量。本文使用的术语“克隆”或“克隆群”指来源于单个分化细胞的分化细胞群。本文使用的术语“治疗”(treatment或treating)通常指试图改变被治疗的个体 的自然病程的临床干预，并且可在临床病理病程期间进行。所需的作用包括，但不限于，减 轻症状，压制、减小或抑制疾病的任何直接或间接的病理后果，减慢疾病进展的速度，改善 或减轻疾病状态，以及引起缓解或较好的预后。本发明本发明涉及一种治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方法，包括向所述对象施 用包含针对来自人类普通饮食的食物抗原的人Trl细胞的组合物。根据本发明，本发明人的目的是提供一种治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的 方法，所述治疗基于针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞的单独施用。特别地，本 发明人惊奇地发现所述针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞不需要与Trl细胞所 针对的抗原共同施用而发生效力。本发明因此表现的优点是不需要共同施用或共同治疗，就调节事件而言共同施用 或共同治疗是复杂的。术语“来自人类普通饮食的食物抗原，，指免疫原性肽，其来自常见的人类食品，诸 如下列非限制性列举的食物抗原牛抗原诸如脂质转运蛋白(lipocalin)，Ca结合S100， α-乳清蛋白，乳球蛋白诸如乳球蛋白，牛血清白蛋白，酪蛋白。食物抗原还可以是大 西洋鲑鱼抗原诸如小清蛋白(parvalbumin)，鸡抗原诸如类卵粘蛋白(ovomucoid)，卵清蛋白，Ag22，伴清蛋白，溶菌酶或鸡血清蛋白，花生，虾抗原诸如原肌球蛋白，小麦抗原诸如凝 集素或麦醇溶蛋白，芹菜抗原诸如芹菜肌动蛋白抑制蛋白，胡萝卜抗原诸如胡萝卜肌动蛋 白抑制蛋白，苹果抗原诸如索马汀(thaumatin)、苹果脂质转运蛋白、苹果肌动蛋白抑制蛋 白，梨抗原诸如梨肌动蛋白抑制蛋白，异黄酮还原酶，鳄梨抗原诸如内切壳多糖酶，杏抗原 诸如杏脂质转运蛋白，桃抗原诸如桃脂质转运蛋白或桃肌动蛋白抑制蛋白，大豆抗原诸如 HPS、大豆肌动蛋白抑制蛋白或(SAM22)PR-10蛋白。不希望受理论的约束，本申请人设想注射的针对来自人类普通饮食的食物抗原的 Trl细胞群将在摄入普通食物后在体内被肠组织中存在的食物抗原激活，然后能够控制肠 炎性病症诸如炎性肠病和与食物变态反应或不耐受有关的炎症。本发明涉及一种组合物，包含至少一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的人 Trl细胞群。在本发明的一个实施方案中，人Trl细胞可通过下列步骤获得a)从对象中分离祖细胞群，b)通过在IL-10的存在下培养所述祖细胞群获得树突状细胞群，c)将步骤b)的细胞与从所述对象分离的CD4+T淋巴细胞群在食物抗原的存在下 接触，以允许针对所述抗原的CD4+T细胞分化为Trl细胞群，以及d)回收来自步骤c)的Trl细胞群。在步骤b)中，IL-10在培养基中的存在量为50 250U/ml，优选为100U/ml。所 述获得Trl细胞的方法描述在Wakkach等人(Immunity 2003May ； 18 (5) 605-17)中。所述方法还可使用地塞米松和维生素D3，或致耐受性(tolerogenised)或不成熟 的DC代替步骤b)中的DC来进行。在本发明的另一个实施方案中，人Trl细胞可通过下列步骤获得a)在含有适当量的IFN-α的培养基中培养从对象分离的针对食物抗原的CD4+T 细胞群，以及b)回收该Trl细胞群。IFN-α优选地以5ng/ml存在于培养基中，在步骤a)中，培养基可进一步包括适当 量的IL-10，优选为100U/ml。在步骤b)中，Trl细胞群培养在包括IL-15的培养基中以使其增殖，IL-15优选地 在培养基中为5ng/ml。所述用于获得Trl细胞的方法描述在专利US6746670中。还在本发明的另一个实施方案中，人Trl细胞可通过以下步骤获得a)由人工抗原呈递细胞呈递，在食物抗原的存在下体外激活CD4+T细胞群，以及b)回收包括至少10%的Trl细胞的激活⑶4+T细胞。优选地，人工抗原呈递细胞表达HLA II系统分子和人LFA-3分子，并且不表达共 刺激分子(co-stimulation molecule) B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23 和 ICAM-1。所述用于获得Trl细胞的方法描述在专利申请W002/092793中。还在本发明的另一个实施方案中，人Trl细胞可通过以下步骤获得a)在食物抗原和适当量的IL-10的存在下体外激活⑶4+T细胞群，以及b)回收该Trl细胞群。优选地，IL-10在培养基中的存在量为100U/ml。所述方法描述在Groux等人(Nature 1997,389(6652) :737_42)中。还在本发明的另一个实施方案中，人Trl细胞可通过以下步骤获得a)用食物抗原刺激白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群，b)从刺激的细胞群中回收抗原特异性Trl细胞群，c)任选地扩增所述抗原特异性Trl细胞群。白细胞包括几种类型的细胞，它们通过其重要性、其分布、其数目、其寿命和其潜 能来表征。这些类型如下多核或粒性白细胞，其中有嗜酸性、嗜中性和嗜碱性白细胞，以及 单核细胞或外周血单核细胞(PBMC)，其为很大的白细胞并且是免疫系统的细胞类型(淋巴 细胞和单核细胞)。白细胞或PBMC可从外周血中通过本领域技术人员所知晓的任何方法分 离。有利地，对于PBMC的分离，可使用离心，优选密度梯度离心，优选不连续密度梯度离心。 替代方法是使用特异性单克隆抗体。在某些实施方案中，PBMC典型地从全血产品中通过聚 蔗糖-泛影钠(Ficoll-Hypaque)使用标准步骤分离。在其他实施方案中，PBMC通过白细 胞去除术(Ieukapheresis)而回收。所述方法描述在专利申请W02007/010406中。还在另一个实施方案中，人Trl细胞可通过以下步骤获得a)在食物抗原的存在下将白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群与间充质干细胞 一起培养，b)回收Trl细胞群。所述方法还可使用初始或记忆T细胞代替PBMC或白细胞来进行。由此获得的Trl细胞群可进一步通过在细胞因子诸如白介素_2和白介素_4的存 在下培养而扩增。可选地，在Trl细胞扩增培养中也可使用白介素-15和白介素-13。在上述的方法中，人Trl细胞可通过W02005/000344中所述的鉴定方法来表征。所 述Trl细胞的鉴定方法基于检测这样的基因的表达产物的同时存在，所述基因编码CD4分 子和选自包括⑶18和/或⑶Ila与⑶49b的组的分子。Trl细胞可通过Elisa、流式细胞 术或免疫亲和法，使用针对所述标志物的抗体来鉴定和/或纯化。Trl细胞还可使用流式细胞术或磁珠通过阳性选择或阴性选择来富集。这些方法 也描述在W02005/000344中。在本发明的另一个实施方案中，针对来自人普通饮食抗原的食物抗原的Trl细胞 可以通过W02006/108882中所述的体外方法来扩增。所述方法包括a)在低于35°C的温度Tl下，在培养基Mf中培养饲养细胞诸如昆虫饲养细胞，所 述温度Tl允许饲养细胞增殖，并且所述饲养细胞表达与下列细胞表面蛋白相互作用的因 子-CD3/TCR 复合物，-CD28 蛋白，-IL-2 受体，-CD2 蛋白，-IL-4 受体，b)将在步骤a)中获得的去掉或不去掉其培养基Mf的饲养细胞与包含在培养基 Mp中的Trl细胞群接触，其中所述培养基Mp初始不含有步骤a)中提到的因子，从而获得含有Trl细胞群、饲养细胞和培养基Mp的混合物，c)将步骤b)中获得的混合物在至少为35°C的温度T2下培养，选择所述温度使得 Trl细胞群增殖且饲养细胞不增殖，d)回收这样扩增的Trl细胞群。与上面提到的细胞表面蛋白相互作用的因子的实例包括-修饰的抗CD3抗体，其中CD3重链的抗CD3胞浆内结构域被跨膜结构域替代，-CD80 或 CD86 蛋白，-由饲养细胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-选自包括IL-4和IL-13的组的白介素。在本发明的一个优选的实施方案中，所述针对来自人类普通饮食的食物抗原的 Trl细胞可通过使用克隆T细胞的常规方法来克隆。在本发明的优选实施方案中，包含至少一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的 人Trl细胞群或针对来自人类普通饮食的食物抗原的人Trl细胞的至少一个克隆的所述组 合物可被冷冻保存。在本发明的优选实施方案中，所述来自人类普通饮食的食物抗原选自包括下列的 组牛抗原，Ca结合S100，α-乳清蛋白，乳球蛋白诸如β _乳球蛋白，牛血清白蛋白，酪蛋 白，大西洋鲑鱼抗原，鸡抗原，卵清蛋白，Ag22，伴清蛋白，溶菌酶或鸡血清蛋白，虾抗原，小 麦抗原诸如谷蛋白麦醇溶蛋白，芹菜抗原，胡萝卜抗原，苹果抗原，苹果脂质转运蛋白，苹 果肌动蛋白抑制蛋白，梨抗原，异黄酮还原酶，鳄梨抗原，杏抗原，桃抗原，大豆抗原，花生， 它们的片段、变体和混合物。优选地，食物抗原是重组或合成的抗原。优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗 原不是麦醇溶蛋白。优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗原是卵清蛋白，酪蛋白，β -乳球蛋白，大 豆蛋白，麦醇溶蛋白，花生，它们的片段、变体和混合物。更优选地，所述来自人类普通饮食 的食物抗原是卵清蛋白，其片段和变体。更优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗原是麦醇溶蛋白，其片段和变体。更优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗原是酪蛋白，其片段和变体。更优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗原是β -乳球蛋白，其片段和变体。更优选地，所述来自人类普通饮食的食物抗原是花生，其片段和变体。术语来自人类普通饮食的食物抗原的“变体”在本文中指几乎与天然抗原相同并 具有相同的生物活性的抗原。天然抗原和其变体之间的最小差异可在于，例如，氨基酸置 换、缺失和/或添加。此类变体可含有例如保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被具有相似侧 链的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经被确定，包括碱 性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的 极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性 侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分 支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 组氨酸)。
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本发明的另一个目的是提供包括如上文所述的组合物的药剂。本发明还意欲提供包括如上文所述的组合物和一种或多种药学可接受的载体的 组合的药物组合物。本文可用的药学可接受的载体是常规的。雷明登氏制药科学 (Remington' sPharmaceutical Sciences),第 16 版，Osol, Α·编辑(1980)描述了适合用 于药学递送本发明的组合物的组合物和制剂。通常，载体的性质将取决于要采用的给药模 式。例如，胃肠外制剂通常包括可注射液体作为载体，该可注射液体包括药学和生理学可接 受的液体诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、芝麻油、甘油、乙醇、其组合等。载体 和组合物可以是无菌的，并且制剂适合于给药模式。除了生物学中性载体以外，要给药的药 物组合物可包含最小量的无毒性辅料物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等， 例如，乙酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。该组合物可以是液体溶液、混悬液、乳液。在本发明的一个实施方案中，如上文所述的所述药剂或药物组合物基本上由至少 一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞群组成。在本发明的另一个实施方案中，如上文所述的所述药剂或药物组合物基本上由针 对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞群的至少一个克隆组成。如本文使用的“基本上由......组成”指药剂或药物组合物，其中该药剂或药物
组合物中存在的细胞的至少70 %，优选75 %、80 %、85 %或90 %是针对来自人类普通饮食 的食物抗原的Trl细胞。在本发明的一个实施方案中，如上文所述的所述药剂或药物组合物包括针对除麦 醇溶蛋白以外的来自人类普通饮食的食物抗原的Tr 1细胞群。在本发明的另一个实施方案中，如上文所描述的所述药剂或药物组合物由至少一 个针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞群或针对来自人类普通饮食的食物抗原 的Trl细胞群的至少一个克隆组成。在本发明的另一个实施方案中，如上文所描述的所述药剂或药物组合物由至少一 个针对除麦醇溶蛋白以外的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞群或针对除麦醇溶 蛋白以外的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞群的至少一个克隆组成。本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗肠炎性病症的药剂或药物组合物的 制备中的应用。根据本发明，如上文所述的药物组合物或药剂用于治疗肠炎性病症。根据本发明，如上文所述的药物组合物或药剂在治疗肠炎性病症中的应用。根据本发明，所述药物组合物或药剂不与来自人类普通饮食的可溶性食物抗原组 合使用。根据本发明，所述药物组合物或药剂不与来自人类普通饮食的可溶性食物抗原一 起或组合施用于对象。根据本发明，不需要与Trl细胞所针对的来自人类普通饮食的可溶性食物抗原的 共同治疗。在一个实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗炎性肠病的药剂 或药物组合物的制备中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗克罗恩病的药剂或药物组合物的制备中的应用。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗溃疡性 结肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。在另一个实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗与食物变态反 应或不耐受有关的肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗与乳蛋白 变态反应有关的肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。优选地，所述用于治疗与乳蛋 白变态反应有关的肠炎的所述药剂或药物组合物包括针对酪蛋白或乳球蛋白、其片段 和变体的人Trl细胞。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗与乳糜 泻疾病有关的肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。优选地，所述用于治疗与乳糜泻 疾病有关的肠炎的所述药剂或药物组合物包括针对麦醇溶蛋白、其片段和变体的人Trl细 胞。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗与鸡蛋 变态反应有关的肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。优选地，所述用于治疗与鸡蛋 变态反应有关的肠炎的所述药剂或药物组合物包括针对卵清蛋白、其片段和变体的人Trl 细胞。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的组合物在用于治疗与花生 变态反应有关的肠炎的药剂或药物组合物的制备中的应用。优选地，所述用于治疗与花生 变态反应有关的肠炎的所述药剂或药物组合物包括针对花生、其片段和变体的人Trl细 胞。本发明的一个目的还在于一种治疗需要该治疗的对象的炎性肠病——优选克罗 恩病或溃疡性结肠炎的方法，包括将有效量的如上文所述的药剂或有效量的如上文所述的 药物组合物施用于所述对象。本发明的另一个目的是一种治疗需要该治疗的对象的与食物变态反应或不耐受 有关的肠炎一一优选乳蛋白变态反应、乳糜泻、鸡蛋变态反应或花生变态反应的方法，包括 将有效量的如上文所述的药剂或有效量的如上文所述的药物组合物施用于所述对象。该组合物可被配制用于胃肠外、肌内、静脉内、腹膜内、注射、鼻内吸入、肺吸入、皮 内、关节内、鞘内，或经消化道的制剂。在另一个实施方案中，该组合物可被配制用于经内镜 途径以组织内或粘膜内施用以将该组合物直接递送至结肠内或小肠内。优选地，本发明的药剂或药物组合物可通过肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直 接注射至患者的淋巴结中而施用，优选地通过静脉内注射而施用。有效地治疗肠炎性病症诸如炎性肠病和与食物变态反应或不耐受有关的肠炎的 针对来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞的量将取决于炎症的性质，并且可通过标准 的临床技术来确定。在制剂中要采用的精确剂量也将取决于施用途径和疾病或功能紊乱的 严重性，并且应该根据医生的判断和各个个体的情况来决定。有效剂量可从由体外或动物 模型测试系统得到的剂量响应曲线推算出来。在本发明的一个实施方案中，104/kg 109/kg细胞施用于对象。优选地105/kg 107kg细胞并且更优选地约106/kg细胞施用于对象。
在本发明的一个实施方案中，在通过对象的临床状态的减退证明疾病突发时或在 例如通过内窥镜检查可看到炎性病变时用该药剂施用于对象。在本发明的一个实施方案中，使用本发明的药剂或药物组合物施用于对象一次。在本发明的第二个实施方案中，使用本发明的药剂或药物组合物施用于对象一月一次。在本发明的第三个实施方案中，使用本发明的药剂或药物组合物施用于对象一季
度一次。在本发明的第四个实施方案中，使用本发明的药剂或药物组合物施用于对象一年
一至两次。在本发明的另一个实施方案中，要施用于需要其的对象的药剂或药物组合物包括 与所述对象的细胞自体同源的人Trl细胞。这意味着Trl细胞要施用于它们所来源的对象或用于产生Trl细胞的前体来自将 施用该Trl细胞的对象。本发明还涉及一种用于治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方法，所述方法包 括以下步骤-收集所述对象的血液样品，_获得针对选择的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞，-克隆所述针对选择的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞，-进一步扩增在前面步骤中获得的Trl克隆，-将由此获得的Trl克隆重新注射进所述对象中，优选地通过静脉内途径。优选地，针对选择的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl克隆的克隆和扩增采用 下列的方法进行a)在低于35°C的温度Tl下，在培养基Mf中培养饲养细胞诸如昆虫饲养细胞，所 述温度Tl能够使饲养细胞增殖，并且所述饲养细胞表达与下列细胞表面蛋白相互作用的 因子-CD3/TCR 复合物，-CD28 蛋白，-IL-2 受体，-CD2 蛋白，-IL-4 受体，b)将在步骤a)中获得的去掉或不去掉其培养基Mf的饲养细胞与包含在培养基 Mp中的Trl细胞群接触，其中所述培养基Mp初始不含有步骤a)中提到的因子，从而获得含 有Trl细胞群、饲养细胞和培养基Mp的混合物，c)将步骤b)中获得的混合物在至少为35°C的温度T2下培养，选择所述温度使得 Trl细胞群增殖且饲养细胞不增殖，f)回收这样扩增的Trl细胞群。与上面提到的细胞表面蛋白相互作用的因子的实例包括-修饰的抗CD3抗体，其中CD3重链的抗CD3胞浆内结构域被跨膜结构域替代，-CD80 或 CD86 蛋白，
-由饲养细胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-选自包括IL-4和IL-13的组的白介素。在本发明的另一个实施方案中，用于治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症，诸如 炎性肠病或与食物变态反应或不耐受有关的肠炎的方法包括将有效量的本发明的药剂或 药物组合物与用于治疗肠炎性病症的一种或多种治疗剂联合施用于所述对象。本发明涉及本发明的药物组合物或药剂的应用，其中有效量的本发明的药剂或药 物组合物与用于治疗肠炎性病症的一种或多种治疗剂联合施用于所述对象。通常用于治疗肠炎性病症的治疗剂的实例如下-人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，具体而言，抗-TNF诸如英夫利昔单抗 (infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)；抗-IL1、抗 IL-6、抗 IL-12、抗IL-17和抗IL-23 ；IL-I受体拮抗剂类似物(阿那白滞素(anakinra))；-细胞表面分子的抗体诸如抗α4整合素(那他珠单抗(natalizumab))、抗⑶2、 抗 CD3 (visiluzumab)、抗 CCR9、抗 LFAl 和抗 ICAMl ；-5-氨基水杨酸和类似物诸如美沙拉嗪(mesalamine)、sulfazaline、奥沙拉秦 (olsalazine)禾口巴柳氮(balsalazide)；-皮质类激素诸如泼尼松、布地奈德、氢化考的松、强的松龙、甲泼尼龙、倍他米松、 倍氯米松、替可的松；-益生菌诸如布拉氏酵母菌(saccharomyces boulardii)；-甲氨蝶呤、沙利度胺、来氟米特，和嘌呤类似物诸如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤。在本发明的一个优选实施方案中，用于治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方 法包括将有效量的本发明的药剂或药物组合物与选自下列组中的一种或多种治疗剂联合 施用于所述对象抗TNF、那他珠单抗、抗IL1、抗IL-6、抗IL-12、抗IL-17和抗IL-23 ；IL-I 受体拮抗剂类似物(阿那白滞素)；5-氨基水杨酸和类似物诸如美沙拉嗪、sulfazaline、奥 沙拉秦、巴柳氮；皮质类激素诸如泼尼松、布地奈德、氢化考的松、强的松龙、甲泼尼龙、倍他 米松、倍氯米松、替可的松。本发明涉及本发明的药物组合物或药剂在治疗需要该治疗的对象的肠炎性病 症中的应用，其中有效量的本发明的药剂或药物组合物与选自下列组中的一种或多种治 疗剂联合施用于所述对象抗TNF、那他珠单抗、抗IL1、抗IL-6、抗IL-12、抗IL-17和抗 IL-23;IL-1受体拮抗剂类似物(阿那白滞素)；5-氨基水杨酸和类似物诸如美沙拉嗪、 sulfazaline、奥沙拉秦、巴柳氮；皮质类激素诸如泼尼松、布地奈德、氢化考的松、强的松 龙、甲泼尼龙、倍他米松、倍氯米松、替可的松。在另一个实施方案中，本发明还涉及一种治疗肠炎性病症的方法，其中本发明的 药剂或药物组合物施用于需要该治疗的对象，其中所述对象对下列组中的一种或多种治疗 剂不充分地应答，或不可能充分地应答抗TNF、那他珠单抗、抗IL1、抗IL-6、抗IL-12、抗 IL-17和抗IL-23 ；IL-I受体拮抗剂类似物(阿那白滞素)；5-氨基水杨酸和类似物诸如美 沙拉嗪、sulfazaline、奥沙拉秦、巴柳氮；皮质类激素诸如泼尼松、布地奈德、氢化考的松、 强的松龙、甲泼尼龙、倍他米松、倍氯米松、替可的松；益生菌诸如布拉氏酵母菌，甲氨蝶呤、 硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、沙利度胺、来氟米特。
本发明涉及本发明的药物组合物或药剂的应用，其中所述对象对下列组中的一种 或多种治疗剂不充分地反应，或不可能充分地反应抗TNF、那他珠单抗、抗IL1、抗IL-6、抗 IL-12、抗IL-17和抗IL-23 ；IL-I受体拮抗剂类似物(阿那白滞素)；5-氨基水杨酸和类似 物诸如美沙拉嗪、sulfazaline、奥沙拉秦、巴柳氮；皮质类激素诸如泼尼松、布地奈德、氢化 考的松、强的松龙、甲泼尼龙、倍他米松、倍氯米松、替可的松；益生菌诸如布拉氏酵母菌，甲 氨蝶呤、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、沙利度胺、来氟米特。“不充分应答”，“对......不充分应答”或“不可能充分应答”指就所关心的对象而
言，指示治疗已经，或可能是，无效的、毒性的或耐受差的对象产生的实际的或可能的应答。
实施例在下面的描述中，所有不给出详细试验方案的试验均根据标准试验方案进行。下面的实施例被包括用于示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解 的是下面实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在实施本发明中工作良好的技术，并 且由此可被认为构成其实施的优选方式。然而，本领域技术人员应该理解，按照本公开内 容，对公开的具体实施方案可作出许多改变，并且在不背离本发明的精神和范围的前提下 仍能获得类似或相似的结果。试验1实验步骤小鼠7 周龄雌性 Balb/c 小鼠获自 Janvier (Le Genest-St-Isle，France)。TRl细胞分化在普通小鼠饲粮(SAFE)中发现的大豆或鱼蛋白的存在下，Balb/c脾细胞首先以 2. 5 IO6 个细胞 /ml 在添加了 IL-2(100UI/ml)加 IL-4 (20ng/ml)的 Yssel 培养基中培养。 细胞在37°C、5% C02下培养，并当需要时在相同的培养基中分开。然后小鼠T细胞在24孔 板中在4. IO5照射的自体脾细胞和大豆蛋白或鱼蛋白的存在下一周刺激一次。T-细胞群在 两周或五周期间再刺激一周一次。细胞因子测定对在存在或不存在照射的自体脾细胞(4. IO5)的情况下用特异性抗原(鱼或 大豆蛋白)刺激的T细胞群(5.105细胞)的48小时上清液进行夹心ELISA。使用抗 IL-4 (IlBll)、抗 IL-IO (2A5)、抗 IFN- y (XGM1. 2)、生物素抗 IL_4(24G2)、抗 IL-IO (SXC 1)、 抗 IFN-γ (R4-6A2)(Pharmingen Becton Dickinson)进 亍 ELISA。结肠炎的诱发对于结肠炎的诱发，从第0天至第5天在小鼠的饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(DSS， ICN, Biomedicals)。结果针对食物抗原的小鼠Trl在治疗小鼠结肠炎中的应用在这些试验中，使用针对鱼蛋白和大豆蛋白的小鼠Tr 1细胞，因为来自鱼粉的蛋 白和大豆蛋白是用于饲养小鼠的常见食物抗原。图1显示对鱼蛋白(图1A)和大豆蛋白(图1B)特异的Trl细胞的细胞因子表达谱在5天期间小鼠用水中的5% DSS处理以诱发急性结肠炎，并且在第5、6和7天测
量小鼠的体重。在图2A中，第一组小鼠未处理，第二组在第1天注射IO6个小鼠抗鱼Trl细胞。在图2B中，第一组小鼠未处理，第二组在第1和3天时用4. IO5个小鼠抗大豆Trl 细胞处理，在第6天用3. IO5个小鼠抗大豆Trl细胞处理。图2C显示在第8天由结肠细胞产生IFN- γ也被小鼠抗大豆Trl细胞的施用所抑 制。这些试验的结果显示针对来自普通小鼠饮食的食物抗原的Trl细胞的施用抑制 了体重减轻，并能够控制小鼠中由DSS诱发的结肠炎。试验2试验步骤卵清蛋白特异性Trl克隆的产生卵清蛋白特异性Trl克隆从健康供体或克罗恩病患者的外周血单核细胞(PBMC) 中产生。在通过Ficoll梯度密度离心(GE Healthcare,Uppsala, Sweden)分离PBMC后，细胞 在X-Vivol5(Cambrex，East Rutherford,NJ)中的天然的照射的卵清蛋白(Sigma Aldrich, St-Louis, MO, USA)和富含细胞因子的果蝇饲养细胞上清液的存在下在37°C、5% CO2中培 养。几天培养后，细胞通过有限稀释法在果蝇饲养细胞层上在X-Vivol5中在37°C、5% CO2 下克隆。然后收获生长的克隆并检查抗原特异性和Trl细胞身份，然后在果蝇饲养细胞上 扩增至50亿。果蝇饲养细胞果蝇饲养细胞由TxCell改造以便提高对Trl细胞克隆的刺激和生长作用。 Schneider果蝇细胞用鼠抗人⑶3抗体的跨膜形式、人⑶80、人⑶58、人IL-2和人IL-4转 染。细胞常规地生长在获自PAA实验室(Pashing，Austria)的Expressfive培养基中。细胞因子测定对于抗原特异性的测定，对在存在或不存在特异性抗原(卵清蛋白)的情况下 在抗原呈递细胞(4. IO5)的存在下，刺激的T细胞克隆的48小时上清液进行夹心ELISA。 对于细胞因子产生谱的测定，卵清蛋白特异性Trl细胞克隆用抗CD3+抗CD28单克隆 抗体包被珠(Invitrogen. Carlsbad, CA)刺激，48小时后收获上清液。使用市售的获自 Diaclone (Besancon, France)的试齐[J盒进行 ELISA0抑制作用测定对于共培养中的抑制作用研究，分级数量的卵清蛋白特异性Trl克隆与自体 CD4+T淋巴细胞共培养。共培养物用抗CD3+抗CD28单克隆抗体包被珠刺激。3天后，使用 获自 Roche (Roche Applied. Science, Basel, Switzerland)的 WST-1 增殖试剂盒评价总细 胞增殖。也使用在48小时期间用抗CD3+抗CD28单克隆抗体包被珠激活的Trl细胞的稀 释上清液评价自体CD4+T细胞增殖的抑制作用。抗IL-10和抗TGF β单克隆抗体购自R&D systems 并以 10 μ g/ml 使用。毒理学研究Trl 克隆的核型分析在 “ laboratoire Genazur" (Nice, France)进行。端粒长度测量根据标准步骤(13)由 G.Butler brown 的团队(Institute of mycology, InsermU787, Paris)进行。通过将Trl细胞以1细胞/孔接种在96孔板的含有或不含有生长因子(IL-2， 200UI/ml 和 IL-4，20ng/ml ；购自 R&D systems, Minneapolis, MN)的 X_Vivol5 中或以 40 000细胞/ml接种在含有或不含有生长因子的基于半固体琼脂的培养基中进行集落生成评 价。克隆生长的评价一周进行一次，连续进行8周。结果首先用来自健康供体的外周血细胞开发抗卵清蛋白特异性Trl细胞的生产方法。 第一步涉及用天然卵清蛋白、IL-2和IL-4培养外周血单核细胞以便富集/扩增卵清蛋白特 异性T淋巴细胞。在此步骤结束时，细胞通过有限稀释法克隆。通过将富含卵清蛋白特异性 T细胞的PBMC接种在用抗⑶3单克隆抗体的跨膜形式、人⑶80、人⑶58、人IL-2和人IL-4 稳定转染的果蝇来源的饲养细胞层(Schneider细胞)上来实现T细胞的克隆以及T细胞 克隆的进一步扩增。此策略导致有效地增殖T细胞克隆(图3a)。该方法允许在12 15 周内产生50亿以上的单克隆Trl细胞群。在扩增步骤期间，评价生长的克隆的卵清蛋白特 异性和其Trl特异性身份。通过ELISA检测在由照射的自体PBMC呈递的卵清蛋白的存在 下培养的细胞克隆的上清液中的IL-10产量来观察卵清蛋白特异性。也通过ELISA在用抗 CD3+抗CD28包被珠多克隆激活这些克隆后来观察Trl细胞身份。选择的克隆的实例在图 3的图板B和C中给出。重要的是，在此方法中，果蝇饲养细胞的使用使得Trl细胞在完全 没有动物或人血清的存在下扩增。在50名以上的健康供体上开发此方法的结果显示可以 采用此方法在绝大多数个体(90%以上)中分离卵清蛋白特异性Trl细胞。这表明对卵清 蛋白的耐受以及更多地对饮食抗原的耐受部分是由涉及Trl细胞的抑制性机制所引起的， 由此表明此抑制性细胞群为口服耐受性的主要调节效应器。为了更深入地表征选择的Trl细胞克隆，我们在常规抑制测定中分析了其体外的 抑制功能。为此，在分级数量的选自相同供体的Trl克隆的存在下，纯化的CD4+T淋巴细胞 在体外用抗⑶3+抗⑶28单克隆抗体包被珠激活。图4显示，在这些试验中，Trl细胞甚至 在每16个靶细胞1个的定量下仍能抑制自体CD4+T淋巴细胞的增殖(图4，图板A)。在相 同类型的增殖测定中，在体外用抗CD3和抗CD28单克隆抗体包被珠激活的Trl克隆的培养 上清液也显示抑制活性，尽管一直观察到比接触介导的抑制作用更多的离散值(图4，图板 B)，表明Trl细胞对T细胞增殖的抑制作用部分地由可溶性因子介导。并不奇怪，这些上清 液的抑制作用通过IL-10和TGF-β的阻断抗体而被抑制(图4，图板C)。这些不同的试验 显示经我们的方法分离的细胞显示的抑制性能力让人回想起对Trl细胞所述的能力。实际 上，由激活的Trl克隆产生的IL-10和TGF- β的作用是抑制T细胞增殖，并且阻断两种细胞 因子完全地阻断了 Trl细胞上清液的抑制作用，显示这些可溶性因子协同作用以减少T细 胞增殖。为了基于表型进一步确认所选择的克隆的Trl身份，我们评价了它们的调节性细 胞标志物⑶25、Foxp3、GITR和CTLA-4的表面表达。所有这些分子都为大多数激活的Trl 细胞所表达，并且将细胞置于没有刺激物的培养中几天后在静息状态下它们是下调的(图 5)。由于开发此制造方法的目标是产生用于注射给患者的细胞，因此进行试验以显示 在产生的T细胞克隆中没有遗传异常或细胞生存/增殖特性的反常。对来自不同供体的4 个克隆进行核型分析，并且总显示正常的谱型(图6)。我们还通过评价在衰老之前进行的最大倍增数以及评价这些克隆在液体和半固体培养基中的集落生成潜力，分析了在用果蝇 饲养细胞慢性刺激条件下Trl克隆的生存能力(表1)。最后，比较已经倍增30次的克隆 (相当于IO9细胞)和再倍增10次的细胞之间的倍增时间和端粒长度(表1)。所有这些 试验显示，扩增的Trl细胞克隆中增殖和衰老的正常调节与这些调节性Trl淋巴细胞在细 胞治疗中的应用是相容的。表1 卵清蛋白特异性Trl克隆在倍增潜力、集落形成和端粒长度调节方面的特征。

最后，为了证明该制造方法使用患者血细胞的可行性，从克罗恩病患者的PBMC中 成功地产生了卵清蛋白特异性Trl细胞克隆并扩增至10亿(图7)。结论是，我们建立了一种制造方法，该方法能够产生达到10亿个卵清蛋白特异性 Trl细胞克隆用于治疗严重的难治性克罗恩病患者。我们假设这些细胞将归巢至发炎的肠 道，并将在遇到其特异性抗原卵清蛋白后释放炎性细胞因子。在2008年3月在严重的难治性克罗恩病患者中已经开始了验证此假设并评价该 治疗的耐受性的I/IIa期临床试验。越来越多数量的克罗恩病患者对常规治疗诸如非留体抗炎药(NSAID，例如，颇得 斯安(Pentasa))、皮质类激素(强的松龙间磺苯酸钠(solupred)，强的松龙)、免疫抑制剂 (硫唑嘌呤，甲氨蝶呤)和基于抗TNF的药剂(Remicade，Humira，Cimzia)没有疗效。这些 患者可被分组为慢性活动性克罗恩病患者(Chronic ActiveCrohn' s Disease patients) (CACD)的术语名下，因为消化道持久的炎性状态导致生活质量和舒适度下降。CACD患者显 示克罗恩病活动指数(CDAI)超过或等于220持续至少6个月的病史。克罗恩病活动指数或CDAI是用来对患有克罗恩病的患者的症状定量的研究工 具。这在对用来治疗克罗恩病的药剂所完成的研究来说是非常重要的；大多数对新药的主 要研究均使用CDAI以便确定疾病的反应或缓解。评分超过220说明患者具有活动性的病 理学，CDAI低于或等于150表明患者处于疾病的缓解期。
CDAI 计算器 *并发症关节痛、眼葡萄膜炎、结节性红斑、口疮性溃疡、坏疽性脓皮病、肛裂、新 瘘、脓肿(每项评1分)。难治性CACD患者通过静脉方式施用对抗原卵清蛋白特异的Trl细胞克隆。图8显示在用卵清蛋白特异性Trl细胞治疗后5周，CA⑶患者中的CDAI减小(图 板A)所诱导的缓解。CDAI的减小部分地是通过腹痛减少(图板B)、每周液体粪便或软便 的次数减少(图板C)和总舒适度评分减小(图板D)来达到的。
权利要求
一种药剂，其包含至少一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的人Trl细胞群。
2.一种药物组合物，其包含至少一个针对来自人类普通饮食的食物抗原的人Trl细胞 群与一种或多种药学可接受的载体的组合。
3.根据权利要求1或2所述的药剂或药物组合物，其中所述人Trl细胞群是人Trl克隆群。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的药剂或药物组合物，其中所述来自人类普通饮 食的食物抗原选自卵清蛋白、酪蛋白、β -乳球蛋白、大豆蛋白、麦醇溶蛋白、花生及其片段、 变体和混合物。
5.根据权利要求1-3中任何一项所述的药剂或药物组合物，其中所述来自人类普通饮 食的食物抗原是卵清蛋白及其片段、变体和混合物。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的药剂或药物组合物在治疗肠炎性病症中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述肠炎性病症是炎性肠病。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述炎性肠病是克罗恩病。
9.根据权利要求7所述的应用，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
10.根据权利要求6所述的应用，其中所述肠炎性病症是与食物变态反应或食物不耐 受有关的肠炎。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述肠炎与乳蛋白变态反应有关。
12.根据权利要求10所述的应用，其中所述肠炎与乳糜泻有关。
13.根据权利要求10所述的应用，其中所述肠炎与鸡蛋变态反应有关。
14.根据权利要求10所述的应用，其中所述肠炎与花生变态反应有关。
15.根据权利要求6-14中任何一项所述的应用，其中要施用于需要所述药剂或药物组 合物的对象的所述药剂或药物组合物包含与所述对象的细胞自体同源的人Trl细胞。
16.根据权利要求6-15中任何一项所述的应用，其中104/kg 109/kgTrl细胞施用 于需要其的对象。
17.根据权利要求6-16中任何一项所述的应用，其中有效量的本发明的所述药剂或药 物组合物与用于治疗肠炎性病症的一种或多种治疗剂联合施用于所述对象。
18.根据权利要求6-16中任何一项所述的应用，其中所述对象对下列组中的一种或 多种治疗剂不充分地应答，或不可能充分地应答抗-TNF、那他珠单抗、抗-IL1、抗-IL-6、 抗-IL-12、抗-IL-17和抗-IL-23 ；IL-I受体拮抗剂类似物；5-氨基水杨酸和类似物；皮质 类激素、益生菌、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、沙利度胺、来氟米特。
19.一种治疗需要该治疗的对象的肠炎性病症的方法，所述方法包括以下步骤-获得针对选择的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞，所述Trl细胞获自所述对 象的血液样品，-克隆所述针对选择的来自人类普通饮食的食物抗原的Trl细胞， -进一步扩增在前面步骤中获得的Trl克隆，-将由此获得的Trl克隆重新注射进所述对象中，优选地通过静脉内途径。
全文摘要
本发明涉及包含针对来自人类普通饮食的食物抗原的人Tr1细胞的组合物，以及治疗肠炎性病症的方法。
文档编号C12N5/0783GK101874108SQ200880117667
公开日2010年10月27日 申请日期2008年11月26日 优先权日2007年11月26日
发明者阿尔诺·福萨特 申请人:特克赛尔公司