专利名称：类异戊二烯的制备的制作方法
技术领域：
本发明提供了有效制备类异戊二烯的组合物和方法等。本发明还提供了用于进行 该方法的核酸、酶、表达载体和遗传改良的宿主细胞。本发明还提供了从遗传改良的宿主细 胞以高产率制备类异戊二烯的发酵方法。
背景技术：
类异戊二烯在自然界中无处不在。它们组成了超过40，000个不同产物的多样化 家族，其中的许多产物对活生物体是至关重要的。类异戊二烯可以保持细胞流动性、电子传 递、和其他代谢功能。大量的天然和合成的类异戊二烯可用作药物、化妆品、香水、颜料和着 色剂、杀真菌剂、防腐剂、营养药品、和精细化工中间体。类异戊二烯产物典型地由重复的五碳异戊烯基焦磷酸(IPP)单元构成，尽管已经 报道了不规则的类异戊二烯和多萜。在自然界中，类异戊二烯通过它们的前体IPP及其异 构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的连续缩合而合成。这些前体的两条途径是已知的。除 了植物之外的真核生物一般使用甲羟戊酸依赖(MEV)途径来将乙酰辅酶A(乙酰-CoA)转 化成IPP，其随后异构成DMAPP。原核细胞(除了一些例外)通常仅使用甲羟戊酸-非依赖性 的或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径来生成IPP和DMAPP。植物同时使用MEV途径和DXP途 径。参见 Rohmer 等(1993) Biochem. J. 295 :517_524 ；Lange 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(24) :13172-13177 ;Rohdich 等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1158-1163。传统上，通过从自然资源例如植物、微生物和动物中的提取来制备类异戊二烯。但 是，由于许多显著的限制，通过提取获得的产量通常非常低。首先，大多数类异戊二烯在自 然界中仅以很少的量积累。其次，来源生物一般并不适合大规模培养，而大规模培养是制备 商业可接受数量的期望的类异戊二烯所必需的。第三，提取类异戊二烯所需的某些有毒溶 剂需要特殊的操作和处理程序，因此使得类异戊二烯的商业化制备变得复杂。MEV和DXP代谢途径的阐明使得类异戊二烯的生物合成制备变得可行。例如，已 经对微生物进行了工程改造以过量表达一部分或全部甲羟戊酸途径，用于制备命名为紫穗 槐-4，11- 二烯的类异戊二烯(美国专利号7，172，886和7，192，751)。其它努力集中在对 甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的整体的平衡，或增加1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs) 和 IPP 异构酶(idi)的表达。参见 Farmer 等(2001) Biotechnol. Prog. 17 :57_61 ；Kajiwara 等(1997)Biochem. J. 324 :421_426 ；和 Kim 等(2001)Biotechnol. Bioeng. 72 :408_415。然而，鉴于许多商业应用需要非常大量的类异戊二烯产物，对制备比当前技术可 得到的量甚至更多的类异戊二烯的表达系统和发酵程序仍然存在需求。实现微生物代谢向 类异戊二烯生成的最佳转向需要对引入的生物合成途径适当地进行工程改造，以有效地将碳导入类异戊二烯的生成并同时在持续时间段内防止代谢中间产物的有毒水平的形成。本 发明提供了符合该需要并提供了相关益处的组合物和方法。发明概述 本发明提供了高效制备类异戊二烯的组合物和方法。合适的类异戊二烯的非限制 性例子包括半萜(源自1个异戊二烯单元)，例如异戊二烯；单萜(源自2个异戊二烯单 元)，例如月桂烯；倍半萜(源自3个异戊二烯单元)，例如紫穗槐_4，11- 二烯；二萜(源自 四个异戊二烯单元)，例如紫杉烯；三萜(源自6个异戊二烯单元)，例如鲨烯；四萜(源自 8个类异戊二烯)，例如β _胡萝卜素；和多萜(源自多于8个异戊二烯单元)，例如聚异戊 -~ 火布ο一方面，提供了用于制备类异戊二烯化合物的方法，其中该方法包含(a)获得多个能够生成类异戊二烯化合物的宿主细胞，其包含了整合进染色体的 外源核酸序列，该序列编码MEV或DXP途径的酶；(b)在一定条件下，在培养基中培养该宿主细胞，其中该宿主细胞使用乙醇作为碳 源并生成类异戊二烯化合物；和(c)从该培养基中回收类异戊二烯化合物。在一些实施方案中，被宿主细胞作为碳源消耗的乙醇是由宿主细胞生成的。在其 它实施方案中，被宿主细胞作为碳源消耗的乙醇是外源提供给培养基的。另一方面，提供了用于制备类异戊二烯化合物的方法，其包含(a)获得多个能够生成类异戊二烯化合物的宿主细胞；(b)在乙醇含量等于或大于约1克每升培养基的培养基中，培养该宿主细胞至少 四小时；和(c)从该培养基中回收类异戊二烯化合物。又一方面，提供了用于制备类异戊二烯化合物的方法，其包含(a)获得多个能够生成类异戊二烯化合物的酵母细胞；(b)通过向培养基提供碳源，培养该酵母细胞以形成生物量；(c)将该细胞保持在一定条件下至少四小时，在该条件下，该酵母细胞的乙醇消耗 率等于或大于约0.01克乙醇每克细胞干重每小时；和(d)从该培养基中回收类异戊二烯化合物。在一些实施方案中，宿主细胞使用MEV途径生成类异戊二烯化合物。在其它实施 方案中，宿主细胞使用DXP途径生成类异戊二烯化合物。在其它实施方案中，宿主细胞在氧气限制条件下培养或维持至少一段时间。在又 一些实施方案中，宿主细胞在磷酸盐限制条件下培养或维持至少一段时间。通过引用的纳入本说明书中提及的所有公开物和专利申请都以相同的程度通过引用纳入本文，就 如同每个独立的公开物或专利申请被特别且单独地说明通过引用纳入本文一样。附图简要描述
图1是生成异戊烯基焦磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的示意图。图2是生成异戊烯基焦磷酸(“IPP”)和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)的1_脱 氧-D-木酮糖5-二磷酸(“DXP”)途径的图解说明。Dxs是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也称作IspC) ； IspD是4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspE是4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶； IspF是2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶；IspG是1-羟基-2-甲基_2_(E)-丁 烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；而且ispH是异戊烯基/ 二甲基烯丙基二磷酸合成酶。图3是异戊烯基焦磷酸(“IPP”)和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)转化成香 叶基焦磷酸(“GPP”)、法尼西基焦磷酸(“FPP”)、和香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)，以 及合成各种类异戊二烯的示意图。图 4 显示 了 DNA 片段 ERG20-PGAL_tHMGR(A)、ERG 13-PGAL_tHMGR(B)、 IDIl-PGAL-tHMGR(C)、ERG10-PGAL-ERG12(D)、ERG8-PGAL-ERG19 (E)、GAL745 1021-HPH-GAL11637 至 2587 (F)、GAL80—50 至—iNatR-GALSO1309 至 1358 (G)、和 GALl1 至 48-NatR-GALl1500 至 1550 (H)的图谱。图5显示了质粒pAM404的图谱。图6显示了菌株Y337在碳限制下使用葡萄糖给料或葡萄糖/乙醇混合给料的细 胞生长和紫穗槐-4，11-二烯(AD)的生成。图7A显示了 CO2控制给料算法的图表。图7B显示了使用乙醇脉冲给料时菌株 Y293的二氧化碳演化速率、底物递送、生长、和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。图8显示了菌株Y293在碳限制下使用浓缩葡萄糖给料供初始生长，接着使用乙醇 给料供紫穗槐_4，11- 二烯生成的细胞生长和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。图9A到9E显示了菌株Y677在油酸甲酯存在或缺乏下在补料分批、仅用乙醇给料 的限碳发酵中的乙醇生成/消耗、给料速率、生长、碳演化和氧气利用率、以及法呢烯的生 成。图IOA到IOD显示了菌株Y283在不同程度的氧气限制下的溶解氧浓度、生长、乙 醇生成/消耗、和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。图IOE到IOG显示了菌株Y352在不同程度的氧气限制下的生长、乙醇生成/消耗、 和法呢烯的生成。图11显示了摇瓶中的菌株Y337在碳限制下在不同浓度的KH2PO4T每个细胞的紫 穗槐-4，11-二烯生成率。图12显示了菌株Y337在碳和磷酸盐限制下使用葡萄糖给料的补料分批发酵器给 料㈧和细胞生长⑶和紫穗槐_4，11-二烯生成(C)。图13显示了菌株Y337在碳和磷酸盐限制下使用葡萄糖/乙醇混合给料的细胞生 长㈧和紫穗槐_4，11- 二烯生成⑶。图14图示了长度为100个核苷酸的基因组位点特异性序列的生成，所述序列作 为启动子_基因-FRT-Kan-FRT盒的侧翼可用于异源核苷酸序列在大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中的整合。图15显示了质粒pAM618的图谱。发明详细描述定义除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员常规 理解的含义。在此提及的一些术语应被定义为具有以下含义
术语“可选的”或“可选地”指随后描述的特征或结构可以存在或不存在，或者随 后描述的事件或情况可以发生或不发生，且该描述包括特定特征或结构存在的情况和该特 征或结构不存在的情况，或者特定事件或情况发生的情况和该事件或情况不发生的情况。
本文使用的术语“代谢途径”指分解代谢途径或合成代谢途径。合成代谢途径涉 及自较小分子构成较大分子，是需要能量的过程。分解代谢途径涉及较大分子的分解，通常 释放能量。本文使用的术语“甲羟戊酸途径”或“MEV途径”指将乙酰辅酶A转化成IPP的生 物合成途径。MEV途径在图1中图示说明。本文使用的术语“脱氧木酮糖5-磷酸途径”或“DXP途径”指将甘油醛-3-磷酸和 丙酮酸转化成IPP和DMAPP的途径。DXP途径在图2中图示说明。
本文的词语“焦磷酸”与“二磷酸”可互换使用。术语“表达载体”或“载体”指核酸，其转导、转化或感染宿主细胞，从而导致该细 胞生成并非该细胞天然生成的核酸和/或蛋白，或以该细胞非天然具有的方式表达核酸和
/或蛋白。术语“内源性”指天然存在(例如存在于未重组的宿主细胞中)的物质或过程。术语“用于生成异戊烯基焦磷酸的酶途径”指任何能够生成异戊基焦磷酸的途径， 包括但不限于甲羟戊酸途径或DXP途径。术语“核酸”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的聚合形式。因 此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA, DNA-RNA杂合体， 或者包含嘌呤和嘧啶碱基或者其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或者衍生的 核苷酸碱基的聚合物。术语“操纵子”指两个或多个邻近的核苷酸序列，其各自编码基因产物例如RNA或 蛋白，并且其表达被一种或多种控制元件(例如启动子)协同调控。术语“基因产物”指DNA编码的RNA (反之亦然)，或者由RNA或DNA编码的蛋白， 其中基因将典型地包含一种或多种编码蛋白的核苷酸序列，并且可能也包含内含子和其它 非编码的核苷酸序列。术语“蛋白”指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包含编码和非编码氨基酸， 化学或生物化学修饰的或者衍生的氨基酸，以及具有修饰过的肽骨架的多肽。本文使用的术语“异源核酸”指符合以下条件中的至少一项的核酸(a)该核酸对 给定宿主细胞来说是外来的(“外源的”)(即，在该细胞中非天然存在的)；(b)该核酸包含 天然存在于给定宿主细胞中的核苷酸序列(即，对细胞是“内源性的”)，但该核苷酸序列在 细胞中以非天然数量(例如，多于预期或多于天然存在的数量)生成；(c)该核酸包含在序 列上与内源性核苷酸序列不同的核苷酸序列，但该核苷酸序列编码相同的蛋白(具有相同 或基本上相同的氨基酸序列)，而且在细胞中以天然数量(例如，多于预期或多于天然存在 的数量)生成；或者(d)该核酸包含两种或更多种核苷酸序列，这些核苷酸序列彼此在自然 界中未被发现具有相同的联系(例如，该核酸是重组的)。“转基因”指被外源引入到宿主细胞中的基因。其可以包含内源或外源、或异源性 核酸。术语“重组宿主”(也被称作“遗传修饰的宿主细胞”或“遗传修饰的宿主微生物”)指包含本发明提供的异源核酸的宿主细胞。术语“外源核酸”指被外源引入到宿主细胞中的核酸，且因此该核酸不是通常或天然地在自然界中的给定的细胞中发现和/或由其生成的。术语“调控元件”指转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号、 终止子、蛋白降解信号等，其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码的多 肽的生成。术语“转化”指在引入新核酸后，在细胞中引起的永久或短暂的遗传改变。遗传改 变(“修饰”)可以通过将新DNA整合进宿主细胞的基因组中，或者短暂或稳定地将新DNA 保持为游离元件来实现。在真核细胞中，永久的遗传改变一般通过将DNA引入到细胞基因 组中来实现。在原核细胞中，永久的遗传改变可以被引入到染色体中，或可借由染色体外元 件例如质粒和表达载体，其可以包含一个或多个选择标记，以帮助在重组的宿主细胞中维 持所述遗传改变。术语“可操作地连接”指一种并置，其中所描述的组成部分之间的关系允许它们以 其预期的方式发挥功能。例如，如果启动子影响一段核苷酸序列的转录或表达，则该启动子 是与该核苷酸序列可操作地连接的。本文的术语“宿主细胞”和“宿主微生物”可互换使用，用于指在其中可以插入或 已经插入异源核酸的任何古细菌、细菌或真核的活细胞。该术语也涉及原始细胞的后代，它 们由于自然的、意外的或蓄意的突变，在形态学上或在基因组或总DNA互补方面可与原始 的亲代不一定完全一致。术语“合成”在用于描述核酸时指化学合成的寡核苷酸结构单元退火形成基因片 段，其随后经酶组装构成完整的基因。通过“化学手段”合成核酸指核苷酸成分在体外组装。当术语“天然”被用于核酸、细胞或生物体时，指在自然界中发现的核酸、细胞或生 物。例如，存在于可从天然来源中分离且未被人在实验室中有意修饰过的非病源性(无病) 生物体中的多肽或多核苷酸序列是天然的。当术语“天然存在”被用于核酸、酶、细胞或生物体时，指在自然界中发现的核酸、 酶、细胞或生物体。例如，存在于可从天然来源中分离且未被人在实验室中有意修饰过的生 物体中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。当用于蛋白、多肽或酶时，术语“生物活性片段”指该蛋白或多肽或酶的功能性部 分。功能性等价物可能具有变体氨基酸序列，其可能是例如密码子冗余和功能对等的结果， 密码子冗余和功能对等已知天然发生在核酸序列和其编码的蛋白内。或者，功能性等价的 蛋白或肽可以通过应用重组DNA技术构建，其中，基于对被交换的氨基酸的性质考虑，可工 程改造蛋白质的结构变化。本文的术语“类异戊二烯”、“类异戊二烯化合物”、“类异戊二烯产物”、“萜烯”、“萜 烯化合物”、“萜类”和“萜类化合物”可互换使用。它们指能够源自于IPP的化合物。除非上下文另外明确指示，单数形式“一个”、“和”、以及“该”包含复数的指代。因 此，例如，提及“ 一个表达载体”时包含了单个表达载体和多个表达载体，而提及“该宿主细 胞”时包含了提及一个或多个宿主细胞，等等。进一步指出，撰写权利要求可以排除任何可 选的元素。就这点而言，本声明意在作为“唯一”、“仅”等这样的排他性术语与所引用的权 利要求元素联合使用，或使用“否定”限制的在先基础。
除非另外指出，本文提供的实施方案不限定于特定的序列、表达载体、酶、宿主微 生物或过程，因为它们可以依照本领域普通技术人员基于本文教导的理解而变化。本文使 用的术语的目的仅仅是描述特定的实施方案，而不意在进行任何限定。IPP 途径 本发明提供的宿主细胞包含或利用MEV途径、DXP途径或两者同时，以合成IPP和 它的异构体DMAPP。本文提供的是包含至少一种整合进染色体的异源核酸序列的宿主细胞， 该异源核酸序列编码MEV或DXP途径的酶。在其它实施方案中，该宿主细胞包含至少一种 异源核酸序列，该异源核酸序列编码多个MEV或DXP途径的酶。在另一些实施方案中，该宿 主细胞包含多种异源核酸序列，该异源核酸序列编码MEV途径的全部酶。在又一些实施方 案中，该宿主细胞包含多种异源核酸序列，该异源核酸序列编码DXP途径的全部酶。一般而言，除植物以外的真核生物仅使用MEV类异戊二烯途径将乙酰辅酶A转化 成IPP，IPP随后异构成DMAPP。原核生物(除了一些例外)，使用甲羟戊酸非依赖性或DXP 途径经由分叉点来分别生成IPP和DMAPP。植物同时使用MEV和DXP途径来合成IPP。MEV 途径MEV途径的示意图如图1所示。一般而言，该途径包含六个步骤。在第一步中，两分子的乙酰辅酶A经酶催化结合形成乙酰乙酰辅酶A。已知催 化该步骤的酶是，例如，乙酰辅酶A硫解酶(也被称作乙酰辅酶A乙酰基转移酶)。核 苷酸序列的示例性例子包括但不限于以下GenBank登录号以及该序列所源自的生物 (NCC_00913 区域2324131. · 2325315 ；大肠杆菌(Escherichia coli))、(D49362 ；脱氮副球 菌(Paracoccus denitrificans))、禾口(L20428 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在MEV途径的第二步中，乙酰乙酰辅酶A与另一分子的乙酰辅酶A经酶催化缩合 形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA合 成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(NC_001145，补体19061. . 20536 ；酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae))、(X96617 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、 (X83882;拟南芥(Arabidopsisthaliana))、(AB037907 ；浅灰北里孢菌(Kitasatospora griseola))、(BT007302 ；智人(Homo sapiens))、和(NC_002758，位点标签SAV2546，基因 ID 1122571 ；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。在第三步中，HMG-CoA经酶催化转化成甲羟戊酸。已知催化该步骤的酶是，例 如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的示例性例子，包括但不限于(NM_206548 ；黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster))、(NC_002758，位点标签 SAV2545，基因 ID 1122570 ；金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、(NM_204485 ；原鸡(Gallus gallus))、(AB015627 ； 链霉菌属(Sti^ptomyces sp. )K03988)、(AF542543 ；渐尖烟草(Nicotiana attenuata))、 (AB037907 ；浅灰北里孢菌(Kitasatospora griseola))、(AX128213，提供的序列编码截短 的HMGR ；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、和(NC_001145 补体(115734. . 118898 ； 酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第四步中，甲羟戊酸被酶催化磷酸化，形成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤 的酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(L77688 ；拟南芥 (Arabidopsis thaliana))禾口(X55875 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第五步中，第二个磷酸基团经酶催化添加到甲羟戊酸5-磷酸上，形成甲羟戊酸5-焦磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性 例子，包括但不限于(AF429385 ；巴西橡胶树(Heveabrasiliensis))、(NM_006556 ；智 人(Homo sapiens))、和(NC_001145，补体 712315. . 713670 ；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第六步中，甲羟戊酸5-焦磷酸被酶催化转化成IPP。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(X97557 ；酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)) > (AF290095 ；屎肠球菌(Enterococcus faecium))、禾口 (U49260 ；智人(Homo sapiens))。如果IPP要被转化成DMAPP，那么需要第七步。已知催化该步骤的酶是，例如，IPP 异构酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(NC_000913，3031087. . 3031635 ；大肠杆 菌(Escherichia coli))禾Π (AF082326 ；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。如果 需要转化成DMAPP，IPP异构酶的增加表达将确保IPP向DMAPP的转化不成为整个途径的限
速步骤。DXP 途径DXP途径的示意图如图2所示。一般而言，DXP途径包含七个步骤。在第一步中， 丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的酶 是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子，包括但不限于 (AF035440 ；大肠杆菌(Escherichia coli))、(NC_002947，位点标签 PP0527 ；恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)KT2440)、(CP000026，位点标签 SPA2301 ；肠道副伤寒沙门氏菌 (Salmonella entericaParatyphi)，参见 ATCC 9150)、(NC_007493，位点标签 RSP_0254 ；球 形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、(NC_005296，位点标签 RPA0952 ；沼泽红假 单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) CGA009)、(NC_004556，位点标签 PD1293 ；蒂梅丘拉 苛养木杆菌 l(Xylella fastidiosa Temeculal))、和(NC_003076，位点标签 AT5G11380 ；拟
(arabidopsis thaliBriB))。在第二步中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化成2C-甲基-D-赤藓糖 醇-4-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。 核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AB013300 ；大肠杆菌(Escherichiacoli)), (AF148852 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(NC_002947,位点标签 PP1597 ；恶臭 假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440)、(AL939124，位点标签 SC05694 ；天蓝色链霉 菌(Sti^ptomyces coelicolor) A3 (2))、(NC_007493，位点标签 RSP_2709 ；球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、和(NC_007492，位点标签 Pfl_1107 ；荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)PfO-l)。在第三步中，2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲 基-D-赤藓糖醇。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成 酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AF230736 ；大肠杆菌(Escherichia coli))、 (NC_007493,位点标签 RSP_2835 ；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、 (NC_003071，位点标签AT2G02500 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、和(NC_002947，位点 标签 PP1614 ；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)。在第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲 基-D-赤藓糖醇激酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AF216300;大肠杆菌 (Escherichia coli))和(NC_007493，位点标签 RSP_1779 ；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)。在第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸被转化成2C-甲 基-D-赤藓糖醇2，4_环二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藓糖 醇2，4_环二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AF230738 ；大肠杆 菌(Escherichia coli))、(NC_007493，位点标签 RSPJO7I ；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、和(NC_002947，位点标签 PP1618 ；恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida)KT2440)。 在第六步中，2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4_环二磷酸被转化成1_羟基_2_甲 基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)_ 丁 烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AY033515 ；大肠杆 菌(Escherichia coli))、(NC_002947，位点标签 PP0853 ；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)、和(NC_007493，位点标签 RSP_2982 ；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)。在第七步中，1-羟基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸被转化成IPP或它的异构 体DMAPP。已知催化该步骤的酶是，例如，异戊基/ 二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列 的示例性例子包括但不限于(AY062212 ；大肠杆菌(Escherichia coli))和(NC_002947， 位点标签 PP0606 ；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)。在一些实施方案中，宿主细胞的自身代谢过程和本发明提供的IPP生成所涉及的 过程之间的“串扰”(或干扰)被最小化或完全消除。例如，当宿主微生物仅依靠DXP途径 来合成IPP，且引入MEV途径来提供额外的IPP时，串扰被最小化或完全消除。这样的宿主 生物将不会改变MEV途径的酶的表达或加工与MEV途径相关的中间产物。仅依赖或主要依 赖DXP途径的生物包括，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，宿主细胞仅通过MEV途径或者通过MEV途径与DXP途径的结 合来生成IPP。在其他实施方案中，宿主的DXP途径是功能失活的，因此宿主细胞仅通过异 源引入的MEV途径生成IPP。可以通过阻止DXP途径中的一种或多种酶的基因表达或将所 述酶灭活使得DXP途径功能失活。宿主细胞本发明提供的供使用的合适的宿主细胞的示例性例子包括所有古细菌、原核或真 核细胞。古细菌细胞的例子包括但不限于属于以下属的细菌气火菌属(Aeropyrum)、古 丸菌属(Archaeoglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、甲烧球菌属(Methanococcus) > ψ'^ 杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、和热原 体属(Tgermoplasma)。古细菌菌株的示例性例子包括但不限于敏捷气火菌(Aeropyrum pernix)、发光古丸菌(Archaeoglobus fulgidus)、詹氏甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)、口誉& [=I ff ￥ !^υ If lif (Methanobacterium thermoautotropgicum) > | 火球菌(Pyrococcusabyssi)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜酸热原体 (Thermoplasmaacidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)。
原核细胞的例子包括但不限于属于以下属的细胞土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属 (Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、 短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆 菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、士矣希氏菌 属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、中个曼生丰艮瘤菌 属(Mesothizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席 蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞 菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)JH 氏菌属(Salmonella)、栅列蓝细菌属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌 属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球蓝细菌属 (Synnecoccus)、禾口发酵单胞菌属(Zymomonas)。原核细菌菌株的示例性例子包括但不限于枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、 角军淀粉芽胞杆菌(Nacillus amyloliquefaciens)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪山奇氏肠 If 胃(Enterobacter sakazakii)、大肠 If 胃(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、 恶臭假单胞菌(Peudomonas putida)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形 ^lMM (Rhodobacter sphaeroides) Λ if H H M M (Rhodospirillum rubrum) λ it ^ 门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏 菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺 氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)等0一般而言，如果使用细菌宿主细胞，优选非致病性菌株。非致病性菌株的示例性例 子包括但不限于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜 酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)、 卷士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、铜 參录(Pseudomonas aeruginosa) Kl^Ifi^ (Pseudomonas mevalonii)、H 假单胞菌(Pseudomonas putida)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌 (Rodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)等。真核细胞的例子包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的例子包括但不限于属于以 下属的那些曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、金孢属(Chrysosporium)、隐球 菌属(Cryptococcus)、镰孢属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌属 (Neotyphodium)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、 酵母属(Saccharomyces)、木霉属(Trichoderma)、禾口法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(以 前称作Phaffia)。真核菌株的示例性例子包括但不限于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲 霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、 拉氏金抱菌(Chrysosporium lucknowense)、禾谷键抱菌(Fusariumgraminearum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、粗糙脉 孢菌(Neurospora crassa)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、芬兰毕赤酵母 (Pichia finlandica)、儿玉氏毕赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、珀氏毕赤酵母(Pichiapi jperi)、栎树毕 赤酵母(Pichia quercuum)、千屈菜毕赤酵母(Pichia salictaria)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、嗜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) >ikfeIjl^Iif (Streptomyces aureus) > JJlf^fiJ (Saccaromyces bayanus)、^: 酒酵母(Saccaromyces boulardi)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、杀真菌素链霉 菌(Streptomyces fungicidicus)、灰色产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、 灰色链霉菌(Str印tomycesgriseus)、变铅青链霉菌(Sti^ptomyces lividans)、橄榄 灰链霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉 菌(Streptomycestanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、里氏木霉 (Trichodermareesei)、禾口红法夫酵母(Xanthophy 1 lomyces dendrorhous)(以前称作 Phaf f i arho do ζ yma)。 一般而言，如果使用真核细胞，优选非致病性菌株。非致病性菌株的示例性例子 包括但不限于禾谷德抱菌(Fusarium graminearum)、,廉抱霉(Fusarium venenatum)、 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、果酒酵母(Saccaromyces boulardi)、和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0另外，一些菌株已经被食品和药物管理局确定为GRAS或一般认为安全的。这些菌 株包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactibacillusacidophilus)、 瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、禾口酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。类异戊二烯化合物本发明提供的宿主细胞被用于制备类异戊二烯。具体的类异戊二烯化合物由IPP 或DMAPP制备，而且可能需要额外的酶处理。合适的类异戊二烯的非限制性实施例包括半 萜(源自1个异戊二烯单元)，例如异戊二烯；单萜(源自2个异戊二烯单元)，例如月桂 烯；倍半萜(源自3个异戊二烯单元)，例如紫穗槐_4，11- 二烯；二萜(源自四个异戊二烯 单元)，例如紫杉烯；三萜(源自6个异戊二烯单元)，例如鲨烯；四萜(源自8个类异戊二 烯)，例如胡萝卜素；和多萜(源自多于8个异戊二烯单元)，例如聚异戊二烯。在一些 实施方案中，类异戊二烯不是类胡萝卜素。在其它实施方案中，类异戊二烯是C5-C2tl类异戊 二烯。具体的C5-C2tl类异戊二烯化合物的示例性例子以及它们各自的处理酶在下面进一步 描述。C5化合物本发明提供的C5化合物一般源自IPP或DMAPP。这些化合物也被称作半萜，因为 它们源自单个异戊二烯单元(IPP或DMAPP)。异戊二烯在许多植物中发现异戊二烯，其结构为 异戊二烯是用异戊二烯合成酶由IPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于(AB198190 ；银白杨(Populus alba))和(AJ294819 ；银白杨(Populus alba) X 欧洲山杨(Populus tremula))。C10化合物本发明提供的Cltl化合物一般源自香叶基焦磷酸(GPP)，GPP由IPP与DMAPP缩合制备。已知催化该步骤的酶是，例如，香叶基焦磷酸合成酶。这些Cltl化合物也被称作单萜， 因为它们源自两个异戊二烯单元。图3图解显示了 IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可以被进一步加工成单萜。香叶基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AF513111 ；北 美 7令杉(Abies grandis))、(AF513112 ；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513113 ；北 美冷杉(Abies grandis))、(AY534686 ；金鱼草(Antirrhinummajus))、(AY534687 ；金 鱼草(Antirrhinum ma jus)), (Υ17376 ；拟南芥(Arabidopsisthaliana))、(ΑΕ016877, 位点 ΑΡ11092 ；赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus) ；ATCC14579)、(AJ243739 ；甜橙 (Citrus sinensis))、(AY534745 ；伯惠绣衣(Clarkiabreweri)), (AY953508 ；美松齿 小蠹(Ips pini))、 (DQ28693O;番茄(Lycopersiconesculentum))、 (AF182828 ；辣薄 荷(MenthaXpiperita))、(AF182827 ；辣薄荷(MenthaXpiperita))、(MPI249453 ；辣薄 荷(MenthaXpiperita))、(PZE431697，位点 CAD24425 ；产玉米黄质副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens))、 (AY866498 ；胡黄连(Picrorhiza kurrooa))> (AY351862 ；葡 萄(Vitis yinifera))、和(AF203881，位点 AAF12843 ；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。GPP随后被转化成多种Cltl化合物。Cltl化合物的示例性例子包括但不限于^M在许多树特别是松树的树脂中发现蒈烯，其结构为 蒈烯是用蒈烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限 于(AF461460,区域 43. · 1926 ；欧洲云杉(Picea abies))和(AF527416,区域78. · 1871 ； 狭叶鼠尾草(Salvia stenophylla))。胧牛儿醇栊牛儿醇(也被称作香叶醇)，其结构为 其是玫瑰油和玫瑰草油的主要成分。它也存在于天竺葵、柠檬和香茅中。栊牛儿 醇是用栊牛儿醇合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于 (AJ457070 ；细毛樟(Cinnamomum tenuipilum))、(AY362553 ；罗勒(Ocimum basilicum))、 (DQ234300 ；紫苏(Perilla frutescens)品系 1864)、(DQ234299 ；柠檬紫苏(Perilla citriodora)品系 1861)、(DQ234298 ；柠檬紫苏(Perilla citriodora)品系 4935)、和 (DQ088667 ；柠檬紫苏(Perilla citriodora))。芳樟醇 在许多花和香料植物例如芫荽籽中发现芳樟醇，其结构为 芳樟醇是用芳樟醇合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于(AF497485 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AC002294,位点 AAB71482 ； 拟南芥(Arabidopsis thaliana))、 (AY059757 ；拟南芥(Arabidopsisthaliana))、 (NM_104793 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AF154124 ；黄花蒿(Artemisia annua))、 (AF067603 ；伯惠绣衣(Clarkia breweri))、(AF067602 ；矮送春花(Clarkia concinna))、 (AF067601 ；伯惠绣衣(Clarkia breweri))、(U58314;伯惠绣衣(Clarkia breweri))、 (AY840091 ；番茄(Lycopersicon esculentum))、(DQ263741 ；薰衣草(Lavandula angustifolia))、(AY083653 ；柠檬薄荷(Menthacitrate))、(AY693647 ；罗勒(Ocimum basilicum))、 (XM_463918 ；稻(Oryzasativa))、 (AP004078,位点 BAD07605 ；稻(Oryza sativa))、(XM_463918,位点 XP_463918 ；稻(Oryza sativa))、(AY917193 ；柠檬紫苏 (Perilla citriodora))、(AF271259;紫苏(Perilla frutescens))、(AY473623 ；欧洲云 杉(Picea abies))、(DQ195274 ；北美云杉(Picea sitchensis))、和(AF444798 ；回回苏 (Perillafrutescens var. crispa)品禾中号 79)。柠檬烯在柑橘属水果的外皮和薄荷中发现柠檬烯，其结构为 柠檬烯是用柠檬烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于(+)-柠檬烯合成酶(AF514287，区域47. .1867;柠檬(Citrus Iimon))和 (AY055214，区域48. · 1889 ；藿香(Agastache rugosa))，和(_)_柠檬烯合成酶(DQ195275, 区域1. . 1905 ；北美云杉(Picea sithensis))、(AF006193，区域73. . 1986 ；北美冷杉 (Abies grandis))、和(MHC4SLSP,区域29. · 1828 ；绿薄荷(Mentha spicata))。
月桂烯在许多植物包括月桂树、马鞭草和月桂叶的香精油中发现月桂烯，其结构为 月桂烯由月桂叶而得名。月桂烯是用月桂烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷 酸序列的示例性例子包括但不限于(U87908 ；北美冷杉(Abies grandis))、(AY195609 ； 金鱼草(Antirrhinum ma jus)) > (AY195608 ；金鱼草(Antirrhinummajus)) > (NM_127982 ； 拟南芥(Arabidopsis thaliana)TPS10)、(NM_113485 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN)、(匪 113483;拟南芥(Arabidopsisthaliana)ATTPS-CIN)、(AF271259;紫苏 (Perilla frutescens))、(AY473626 ；欧洲云杉(Picea abies))、(AF369919 ；欧洲云杉 (Picea abies))、和(AJ304839 ；冬青栎(Quercus ilex))。罗勒烯在多种植物和水果包括罗勒(Ocimum basilicum)中发现α -和β -罗勒烯，它们
的结构分别是 且它们是用罗勒烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括 但不限于(AY195607 ；金鱼草(Antirrhinum ma jus)), (ΑΥ195609 ；金鱼草(Antirrhinum ma jus)), (AY195608 ；金鱼草(Antirrhinum ma jus)), (AK221024 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(NM_113485 ；拟南芥(Arabidopsisthaliana) ATTPS-CIN)、(NM_113483 ；拟南 芥(Arabidopsisthaliana)ATTPS-CIN)、(NM_117775 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana) ATTPS03)、(NM_001036574 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATTPS03)、(NM_127982 ；拟 南芥(Arabidopsis thaliana) TPS10)、(AB110642;柑橘(Citrus unshiu) CitMTSL4)、禾口 (AY575970 ；光叶百脉根(Lotus corniculatus var. japonicus))。α -蒎烯在松树和桉树中发现α -菔烯，其结构为 α -菔烯是用α -菔烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于⑴α -菔烯合成酶(AF543530,区域1. · 1887 ；火炬松(Pinus taeda))、(-) α -菔烯合成酶(AF543527，区域32. · 1921 ；火炬松(Pinus taeda))、禾口 (+) / (-) α -菔烯 合成酶(AGU87909，区域6111892 ；北美冷杉(Abies grandis))。β -蒎烯
在松树、迷迭香、欧芹、莳萝、罗勒、和玫瑰中发现β-菔烯，其结构为 β -菔烯是用β -菔烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于(-)β _菔烯合成酶(AF276072,区域1. · 1749 ；黄花蒿(Artemisiaannua))禾口 (AF514288，区域26. . 1834 ；柠檬(Citrus Iimon))。 在黑胡椒、胡萝卜种子、鼠尾草和茶树中发现桧萜，其结构为 桧萜是用桧萜合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限 于 AF051901，区域26. · 1798，来自药用鼠尾草(Salvia officinalis)。Y-萜品烯Y-萜品烯，其结构为 其是来自柑橘属水果的香精油的组成成分。生物化学上，Y-萜品烯是用Y-萜 品烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括(AF514286，区域 30. · 1832，来自柠檬(Citrus Iimon))和(ABl 10640,区域 1. · 1803，来自柑橘(Citrus unshiu))ο萜品油烯在黑醋栗、柏树、番石榴、荔枝、番木瓜、松树和茶叶中发现萜品油烯，其结构为 萜品油烯是用萜品油烯合成酶由GPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限于 AY906866，区域10. . 1887，来自花旗松(Pseudotsugamenziesii)。
C15化合物本发明提供的C15化合物一般源自法尼西基焦磷酸(FPP)，FPP是由两分子IPP与一分子DMAPP缩合制备的。已知催化该步骤的酶是，例如，法尼西基焦磷酸合成酶。这些C15 化合物也被称作倍半萜，因为它们源自三个异戊二烯单元。图3图解显示了 IPP和DMAPP如何结合以生成FPP，FPP可以被进一步加工成倍半
ISo法尼西基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(ATU80605 ； 拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(ATHFPS2R ；拟南芥(Arabidopsisthaliana))、 (AAU36376 ；黄花蒿(Artemisia annua))、(AF461050 ；牛(Bos taurus))、(D00694 ；大 肠杆菌(Escherichia coli)K_12)、(AE009951，位点AAL95523 ；具核梭杆菌具核亚种 (Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN ；藤仓赤霉 (Gibberella fujikuroi))、(CP000009，位点 AAW60034 ；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)621H)、(AFO19892 ；向日葵(Helianthusannuus))、(HUMFAPS ；智人(Homo sapiens))、(KLPFPSQCR ；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)), (LAU15777;白羽 扇豆(Lupinus albus))、(LAU20771 ；白羽扇豆(Lupinus albus))、(AF309508 ；小家鼠 (Mus musculus))、(NCFPPSGEN ；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(PAFPS1 ；银胶菊 (Parthenium argentatum))、(PAFPS2 ；银胶菊(Parthenium argentatum))、(RATFAPS ；褐 MU (Rattusnorvegicus)) > (YSCFPP ；酉良胃—(Saccharomyces cerevisiae)) > (D89104 ； 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、(CP000003，位点 AAT87386 ；酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes))、(CP000017，位点 AAZ51849 ；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、(NC_008022，位点 YP_598856 ；酿脓链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)MGAS 10270)、(NC_008023，位点 YP_600845 ；酿脓链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)MGAS2096)、 (NC_008024,位点 YP_602832 ；酿脓链球菌(Sti^ptococcus pyogenes) MGAS 10750)、和 (MZEFPS ；玉米(Zeamays))。或者，FPP也可以通过将IPP添加到GPP上制备。编码能够用于该反应的 酶的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(AE000657，位点AAC06913 ；风产液菌 (Aquifex aeolicus)VF5), (NM_202836 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、 (D84432, 位点 BAA12575 ；枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis))、(U12678，位点 AAC28894 ；大豆 慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110)、(BACFDPS ；嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus))、(NC_002940,位点 NP_873754 ；杜克雷嗜血杆菌 (Haemophilus ducreyi) 35000HP)、(L42023，位点 AAC23087 ；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) Rd KW20)、(J05262;智人(Homo sapiens))、(YP_395294 ；清酒乳杆菌清酒 亚种(Lactobacillus sakei subsp. sakei) 23K)、(NC_005823，位点 YP_000273 ；问号钩端 螺方iH本哥本哈根血清型 Fiocruz 菌株(Leptospira interrogans serovarCopenhageni str. Fiocruz)Ll-130), (AB003187 ；藤黄微球菌(Micrococcusluteus))、(NC_002946, 位点 YP_208768 ；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)FA 1090)、(U00090,位 点 AAB91752 ；根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234)、(J05091;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(CP000031，位点 AAV93568 ；波氏硅杆菌(Silicibacter pomeroyi)DSS-3)、 (AE008481，位点 AAK99890 ；肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) R6)、和(NC_004556、位点 NP 779706 ；蒂梅丘拉苛养木杆菌 l(Xylella fastidiosa Temeculal))。FPP随后被转化成多种C15化合物。C15化合物的示例性例子包括但不限于紫穗槐二烯紫穗槐二烯，其结构为 其是由黄花蒿(Artemisia annua)生成的青蒿素的前体。紫穗槐二烯是用紫穗槐 二烯合成酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子是美国专利号7，192，751的 SEQ ID No. 37。α -法昵烯在多种生物资源(包括但不限于蚂蚁的杜氏腺，以及苹果和梨的果皮)中发现 α-法呢烯，其结构为 α-法呢烯是用α-法呢烯合成酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性 例子包括但不限于来自西洋梨品种安久梨(Pyrus communis cultivar d' Anjou)的 DQ309034 (梨；基因名AFS1)和来自苹果(Malus domestica)的AY182241 (苹果；基因 AFS1)。Pechouus 等，Planta 219(1) :84_94(2004)。β -法昵烯在多种生物资源(包括但不限于蚜虫和香精油，例如来自薄荷的香精油)中发现
β-法呢烯，其结构为 在某些植物例如野生土豆中，β _法呢烯被合成作为天然的驱虫剂。β _法呢烯是 用β -法呢烯合成酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于GenBank 登录号 AF024615，来自辣薄荷(MenthaXpiperita)(薄荷；基因 Tspal 1)和 ΑΥ835398，来 自黄花蒿(Artemisia annua)。Picaud 等，Phytochemistry66 (9) :961_967 (2005)。法昵醇在多种生物资源(包括昆虫和香精油，例如来自香茅、橙花、仙客来、柠檬草、晚香 玉和玫瑰的香精油)中发现法呢醇，其结构为 法呢醇是用羟化酶例如法呢醇合成酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于GenBank登录号AF529266，来自玉米(Zea mays)和YDR481C，来自酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(基因 Pho8)。 Song，L.，AppliedBiochemistry and Biotechnology 128:149-158(2006)。橙花叔醇橙花叔醇，也被称作橙花油醇，其结构为 在多种生物资源(包括如香精油，例如来自橙花、姜、茉莉、薰衣草、茶树和柠檬草 的香精油)中发现橙花叔醇。橙花叔醇是用羟化酶例如橙花叔醇合成酶由FPP制备的。合 适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于AF529266，来自玉米(Zea mays)(玉米；基因 tpsl)ο绿叶醇绿叶醇，也被称作广藿香醇，其结构为 其是广藿香(Pogostemon patchouli)香精油的组成成分。绿叶醇是用绿叶醇合成 酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于AY508730，区域1. . 1659， 来自广藿香(Pogostemon cablin)。巴伦西亚橘烯巴伦西亚橘烯，其结构为 其是橘子的气味和风味的主要化学成分之一，在橘子皮中被发现。巴伦西亚 橘烯是用香柏酮合成酶由FPP制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于 AF441124，区域1· . 1647，来自甜橙(Citrus sinensis))和AY917195，区域1· . 1653，来自 紫苏(Perilla frutescens)。C20化合物本文提供的C2tl化合物一般源自香叶基栊牛儿醇焦磷酸(GGPP)，GGPP是由三分子 IPP和一分子DMAPP缩合制备的。已知催化该步骤的酶是，例如，香叶基香叶基焦磷酸合成 酶。这些C2tl化合物也被称作二萜，因为它们源自四个异戊二烯单元。图3图解显示了 IPP和DMAPP如何结合生成GGPP，GGPP可以被进一步加工成二 萜，或者可以被进一步加工以生成类胡萝卜素。香叶基香叶基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(ATHGERPYRS ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(BT005328 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、 (NM_119845 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、 (NZ_AAJMO1000380,位 点ZP_00743052 ；苏云金芽孢杆菌以色列血清型(Bacillus thuringiensis serovar israelensis), ATCC 35646sql563)、(CRGGPPS ；长春花(Catharanthus roseus))、(NZ_ AABF02000074,位点 ZP_00144509 ；具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucIeatum subsp. Vincentii), ATCC 49256)、(GFGGPPSGN ；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi))、 (AY371321;银杏(Ginkgobiloba))、(AB055496 ；巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))、 (ABO17971 ；智人(Homosapiens))、(MCI276129 ；葡萄牙卷枝毛霉(Mucor circinelloides f. Iusitanicus))、(AB016044 ；小家鼠(Mus musculus))、(AABX01000298，位点 NCU01427 ； 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(NCU20940 ；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(NZ_ AAKL01000008，位点 ZP_00943566 ；青枯菌(Ralstoniasolanacearum) UW551)、(ABl 18238 ； 褐家鼠(Rattus norvegicus))、(SCU31632 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、 (ABO 16095 ；细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus))、(SAGGPS ；白芥(Sinapis alba))、(SS0GDS ；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))、(NC_007759,位 点 YP_461832 ；酸养互营菌(Syntrophus aciditrophicus) SB)、和(NC_006840，位点 YP_204095 ；费氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)。
或者，GGPP也可以通过将IPP添加到FPP上制备。编码能够催化该反应的酶的 核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(NM_112315 ；拟南芥(Arabidopsis thaliana)), (ERWCRTE ；成团泛菌(Pantoea agglomerans))、(D90087,位点 BAA14124 ；菠萝泛菌 (Pantoea ananatis))、(X52291，位点 CAA36538 ；荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus))、 (AF195122，位点 AAF24294 ；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides))、和(NC_004350，位 点 NP_721015 ；变异链球菌(Sti^ptococcus mutans) UA159)。GGPP随后被转化成多种C2tl类异戊二烯。C2tl化合物的示例性例子包括但不限于香叶基栊牛儿醇香叶基栊牛儿醇，其结构为 其是来自红椿(Cedrela toona)的木油和亚麻籽油的组成成分。香叶基栊牛儿醇 可以通过例如在表达构建体中在GGPP合成酶基因的后面添加磷酸酶基因来制备。松香二烯松香二烯包含以下异构体 其在树木例如北美冷杉(Abies grandis)中被发现。松香二烯是用松香二烯合成酶制备的。合适的核苷酸序列的示例性例子包括但不限于(U50768;北美冷杉(Abies grandis))和(AY473621 ；欧洲云杉(Picea abies))。C2Q+化合物C2tl+化合物也包含在本文提供的范围内。这些化合物的示例性例子包括二倍半萜 (由五个异戊二烯单元制备的C25化合物)、三萜(由六个异戊二烯单元制备的C3tl化合物)、 和四萜(由八个异戊二烯单元制备的C4tl化合物)。这些化合物通过使用本文描述的类似 方法，并且取代或添加了适当的合成酶的核苷酸序列来制备。类异戊二烯化合物的高产率本发明提供了通过在使用乙醇作为碳源的条件下培养或维持宿主细胞来高效制 备类异戊二烯的组合物和方法。使用本发明描述的方法，宿主细胞生成多于约5克类异戊 二烯每升发酵反应混合物(5g/L)。在其它实施方案中，生成多于约10g/L、多于约15g/L、多 于约20g/L、多于25g/L，或生成多于约30g/L的类异戊二烯。或者，类异戊二烯的制备可以用比生成率而不是产量来表示。例如，使用本发明描 述的方法，宿主细胞生成多于约50毫克类异戊二烯每克干宿主细胞。在其它实施方案中， 生成多于约100毫克每克细胞干重、多于约150毫克每克细胞干重、多于约200毫克每克细 胞干重、多于约250毫克每克细胞干重、多于约500毫克每克细胞干重、多于约750毫克每 克细胞干重、或多于约1000毫克每克细胞干重的类异戊二烯。无论制备水平是用产量还是比生成率表示，制备发生在小于约120小时、小于约 96小时、小于约72小时、优选地小于约48小时、或甚至小于约24小时。本发明提供的方法可以在分批、补料分批或连续工艺中进行。分批工艺通常是封 闭工艺，其中所有的原材料都在工艺开始时添加。补料分批工艺通常是封闭工艺，其中碳源 和/或其它底物在工艺期间增量添加。补料分批工艺实现了对培养基和微生物的生长的更 大控制。连续工艺可以被认为是开放系统，其中培养基是连续添加的，而且产物被同时去 除。介于补料分批和连续工艺之间的工艺也可以被使用。例如，在一个实施方案中， 工艺作为补料分批工艺开始，而且在工艺进行期间有机层被与培养基接触。将类异戊二烯 (通常在有机溶液中比在水溶液中具有更高的溶解度)从培养基中萃取到有机层中。因为 将产物从培养基中去除，本方法同时具有补料分批和连续工艺的特点。通过有机覆盖层(例如十二烷、肉豆蔻酸异丙酯、油酸甲酯等)去除产物，经常可 以引起类异戊二烯产量的增加。去除产物可以引起产量增加，而且其在产物积累导致途径 抑制时尤其合适。在一些实施方案中，有机层可以由类异戊二烯产物自身形成。这发生在 生成的类异戊二烯超过了其饱和点并形成了可与水性培养基分离的层的时候。在一些实施方案中，乙醇是宿主细胞的唯一碳源。在其它实施方案中，碳源同时包 括乙醇和非乙醇碳源。在又一些实施方案中，非乙醇碳源是碳水化合物。碳水化合物的示例性例子包括单糖、二糖、及其组合。合适的单糖的一些非限制性 例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖，及其组合。合适的二糖的一些非限制性例子 包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖，及其组合。合适的多糖的一些非限制性例子包 括淀粉、糖原、纤维素、几丁质，及其组合。碳水化合物的其它来源包括甘蔗汁和糖蜜。
一般而言，多糖在首先通过化学手段或酶方法被转化成单糖和寡糖之后被宿主细 胞用作碳源。例如，纤维素可以被纤维素酶转化成葡萄糖。在一些实施方案中，如发酵开始 时所测定的，多糖分解后，单糖和/或寡糖构成了碳源的至少约50%重量。在其它实施方案 中，如发酵开始时所测定的，单糖和/或寡糖构成了碳源的至少约80%或甚至90%重量，因 此，发酵培养基基本不含纤维素。在一些实施方案中，宿主细胞被外源提供乙醇作为碳源。在其它实施方案中，被宿主细胞作为碳源消耗的乙醇是由宿主细胞生成的。也就是说，向宿主细胞提供了非乙醇碳 源(通常为碳水化合物)，其被宿主细胞转化成乙醇，而乙醇随后被宿主细胞消耗。宿主细胞对乙醇的使用可以用许多方式量化。在一个方法中，使用乙醇浓度。除 了作为碳源之外，培养基中存在的乙醇也具有阻止微生物污染的益处。因此，在一个实施方案中，培养基中的乙醇浓度在至少4小时内是至少约1克每升 培养基。乙醇浓度可以通过任何本领域已知的方法测定。可以通过培养基取样直接测量， 或通过废气取样间接测量乙醇浓度。如果使用间接方法例如通过质谱分光光度计进行废气 分析，首先必须建立废气测量(以每百万分之一为单位)和培养基中乙醇的直接测量之间 的相互关系。在其它实施方案中，培养基中的乙醇浓度在约1到约5克、约1到约10克、或 约1到约20克每升培养基之间。在又一些实施方案中，培养基中的乙醇浓度大于约10克 每升培养基或大于约20克每升培养基。在又一些实施方案中，以上乙醇浓度被保持至少6 小时、8小时、10小时、12小时、24小时、或48小时。然而，在宿主细胞使用乙醇作为碳源时，仍然可能检测不到乙醇水平，或者乙醇浓 度接近零。例如，这可以发生在宿主细胞消耗乙醇与补充乙醇一样快时。因此，本发明提供 了对宿主细胞的乙醇使用率的其它测量法。在另一实施方案中，宿主细胞的比乙醇消耗率是至少0.01克乙醇每克细胞干重 每小时。在其它实施方案中，比乙醇消耗率在约0. 01到约0. 20克乙醇、或约0. 02到约0. 10 克乙醇每克细胞干重每小时之间。在又一些实施方案中，比乙醇消耗率大于约0. 10克乙醇 每克细胞干重每小时。比乙醇消耗率被保持至少4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、 24小时、或48小时。或者，比乙醇消耗率以克乙醇每克细胞干重每天表示。在一些实施方案中，宿主细 胞的比乙醇消耗率是至少0. 2克乙醇每克细胞干重每天。在一些实施方案中，比乙醇消耗 率在约0. 2到约5克或约0. 5到约3克乙醇每克细胞干重每天之间。在其它实施方案中， 比乙醇消耗率大于约3克乙醇每克细胞干重每天。 在一些实施方案中，细胞被培养或维持在不限制氧气的条件下。也就是说，细胞处 在有氧条件下。但是，因为质量转移的限制和氧气在水溶液中的相对低溶解度，在大规模加工中 保持完全有氧条件可能是特别具有挑战性的。例如，如果用空气喷射到罐中，氧气在20°C 下在水中的溶解度是9毫克每升。如果使用纯氧来代替空气，那么溶解度增加到43毫克每 升。在任一种情况下(喷射空气或纯氧)，除非持续提供氧气，该氧气量将在数秒内被活跃 且密集的微生物群耗尽。相比之下，细胞在相同时间(数秒，例如，低于一分钟)内使用的 其它养分的量与总体浓度相比可以忽略。我们已经发现本发明提供的宿主细胞能够忍受一段时期的氧气限制，并仍然生成高水平的类异戊二烯化合物。该灵活性使得可以通过在发酵罐设计方面的节约、降低的氧 气需要、更低的用于通风的能量消耗等，实现更加经济的工艺。此外，在一些情况下，氧气限 制似乎是有益的。不受限于理论，氧气限制条件下的细胞生长似乎允许更多的碳形成产物， 而不是形成生物量或通过二氧化碳丢失。因而，在一些其它实施方案中，宿主细胞被培养或维持在氧气限制条件下。氧气限 制的时间包括至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少24小 时、或至少48小时。当宿主细胞的比生长速率低于氧气不受限(例如，过量提供)时的最大比生长速率时，发生氧气限制。比生长速率是每单位生物量每单位时间的细胞生长速率，且其以时间 的倒数(1/t)为单位。细胞在培养基中的最大比生长速率跟底物浓度(在本例中是氧气) 对生长速率的影响有关。一般地，细胞在低水平的底物下将缓慢生长，而且随着培养基中的 底物水平增加，细胞生长的速率也会增加。但是，细胞生长的速率不会持续无限升高，而且 在高水平的底物下，底物量的给定增加将使细胞生长的速率产生越来越小的增加。因此，生 长速率最终达到一个极限，它经常被称为最大比生长速率。对培养中生长速率之间的关系的理论处理是本领域技术人员熟知的，且被称为 Monod 方程式。参见，例如，Pirt，Principles of Microbe and CellCultivation, Wiley, NY，1975，4-10页。在该理论处理中，最大比速率是渐近的极限，该极限在底物达到无限水 平之时才能达到。但是，实践中，当研究条件(例如，底物水平例如氧气)支持最快的初始 生长速率时，可以认为获得了最大比生长速率。例如，在补料分批反应器中，当生长需要的 所有底物(例如养分和氧气)被过量提供，而且发酵发生在宿主细胞的最适温度时，该初始 条件被认为是实现最大生长速率的条件。参见，例如，Lee等(1996)TrendSBiotechnol. 14 98-105和Korz等(1995) J Biotechnology 39 :59_65。最大比生长速率在某些时候也被称 为不受限的生长。在一个方法中，氧气限制被量化为培养基中的氧气浓度，而且用溶解的氧浓度 (DOC)表示。培养基中的DOC可以低于约20%、低于约15%、低于约10%、和低于约5%。 在其它实施方案中，DOC是约0%或低于可检测水平。然而，因为氧气被细胞相对快速地消耗，DOC为零可以指细胞在厌氧条件(没有氧 气)下培养，也可以指细胞的耗氧和供氧一样快。在另一个方法中，细胞的氧气使用以氧气 摄入率(OUR;每升培养基的细胞氧气消耗速率)表示，以区分这两种可能性。合适的氧气 摄入率包括低于约50毫摩尔、低于约40毫摩尔、低于约30毫摩尔、低于约20毫摩尔每升 培养基，或低于约10毫摩尔每升培养基。或者，当相对于细胞密度的标准化值为优选时，可以使用比氧气摄入率(S0UR，即 OUR除以细胞密度)。每升发酵物中的微生物数量，或微生物密度，可以通过测量给定体积 的发酵培养基中分离的微生物重量来测量。常用的测量是每升发酵培养基的细胞干重。另 一个可以用来在发酵进程中监测发酵的方法是测量培养基的光密度。常用的方法是在波长 600nm处测量光密度，称作0D_值，或OD值。OD值可以与特定培养基内的特定类型生物体 的密度相关联，但OD值和每体积微生物量之间的特定关系通常将不能适用于所有类型的 培养基中所有类型的生物体。通过在一定细胞密度范围内测量OD值和细胞干重，可以创建 校准曲线。在某些情况下，这些关联性可被用于相同或类似的微生物在相同或类似的培养基中的不同发酵中。合适的比氧气摄入率包括低于约30毫摩尔、低于约25毫摩尔、低于约 20毫摩尔、低于约15毫摩尔、低于约10毫摩尔、或低于约5毫摩尔每克细胞干重每小时。我们也已经发现，本发明提供的宿主细胞能够容忍一段时期的磷酸盐限制，并仍 然制备高水平的类异戊二烯化合物。不受限于理论，磷酸盐限制条件下的细胞生长似乎允 许更多的碳形成产物，而不是生物量。培养基中的合适磷酸盐浓度是低于约5克、低于约4 克、低于约3克、低于约2克、或低于约1克每升培养基。在一些实施方案中，磷酸盐浓度为 零或低于可检测水平。这样的磷酸盐限制的时间包括至少4小时、至少6小时、至少8小时、 至少10小时、至少12小时、至少24小时、或至少48小时。宿主细胞可以在非限制性条件(允许最大比生长)下生长，以在施加限制条件(氧气限制、磷酸盐限制、或两者同时)之前形成足够的生物量。这些限制条件包括使比 生长低于最大比生长速率的约 90%,80%,75%,60%,50%,40%,30%,25%,20%,10%, 5%、或的条件。尽管本文提供了具体的实施方案，以上描述是为了说明，而非限制实施方案的范 围。实施方案范围内的其他方面、益处、和修饰对本领域技术人员将是显而易见的。
实施例除非另外指出，本领域技术范围内的生物合成工业的常规技术等可以被用来实现 本发明提供的实施方案。对于本文中没有充分说明的此类技术，可以在科学文献中找到足 够的相关参考。在以下实施例中，已经尽力保证所使用的数字(例如数量、温度等)的精确度，但 是变化和偏差是可以接受的，且如果本文报道的数字存在笔误，本领域普通技术人员可以 基于本文披露的其它内容，推导出正确的量。除非另外指出，温度以摄氏度表示，且压力是 或接近海平面的大气压。所有的试剂，除非另外指出，是可商业获得的。以下实施例仅仅为 了说明目的，而不以任何方式限制本发明提供的实施方案的范围。实施例1本实施例描述了制备载体用于将编码酶(包括MEV途径的酶)的核酸靶向整合到 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的特定染色体位点中的方法。基因组DNA分离自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y002和 Y003 (CEN. PK2 背景 MATA 或 MATa ura3-52trpl-2891eu2-3，112his3 Δ 1MAL2-8C SUC2) (van Dijken 等(2000) Enzyme Microb. Technol. 26 :706_714)、Y007 (S288C 背景 MATA trpl Δ63) (ATCC 号 200873)、和 EG 123(MATA ura3trp Ileu2his4canl)(Michaelis&Herskowitz. (1988)Mol. Cell. Biol. 8 1309-1318) 在包含酵母提取物、2%细菌蛋白胨和2%右旋 糖的液体培养基(YPD培养基)中过夜生长菌株。通过在3，IOOrpm离心、在IOmL超纯水中 洗涤细胞沉淀、并重新离心来从IOmL液体培养基中分离细胞。使用Y-DER酵母DNA提取试 剂盒(Pierce Biotechnologies, Rockford，IL)按照生产商建议的步骤提取基因组DNA。 将提取的基因组DNA在100 μ L IOmM Tris_Cl，ρΗ8. 5中重悬，并在ND-1000分光光度计 (NanoDrop Technologies, Wilmington,DE)上取得 0D26(1/2M 读数，以测定基因组 DNA 浓度和 纯度。在 Applied Biosystems 2720 温控循环器(Applied Biosystems Inc.，FosterCity, CA)上，按照生产商建议的步骤，使用Phusion高保真DNA聚合酶体系 (Finnzymes OY，Espoo，Finland)，通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增。在将待插入 到 TOPO TA pCR2. 1 克隆载体(Invitrogen，Carlsbad, CA)中的 DNA 片段 PCR 扩增完毕后， 通过如下步骤生成核苷酸突出端向反应混合物加入IyL Qiagen Taq聚合酶(Qiagen， Valencia, CA)，并进行额外10分钟72°C PCR延伸步骤，接着冷却到4°C。在PCR扩增完成 后，向反应混合物添加8 μ L 50%甘油溶液。使用包含0. 5g/mL 溴化乙啶的 1 % TBE (0. 89M Tris, 0. 89M 硼酸，0.02MEDTA 钠 盐)琼脂糖凝胶，在120V，400mA，进行30分钟琼脂糖凝胶电泳。使用紫外光观察DNA条 带。用无菌的剃须刀片从凝胶中切除DNA条带，使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research, Orange, CA)依照生产商建议的步骤凝胶纯化切下的DNA。将纯化的DNA洗脱到 10 μ L超纯水中，并在ND-1000分光光度计上取得0D26Q/28Q读数，以测定DNA浓度和纯度。使用100-500 μ g纯化的PCR产物和高浓度T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs, Ipswich, ΜΑ)按照生产商建议的步骤进行连接。为增殖质粒，按照生产商建议的步骤将连 接后的构建物转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a化学感受态细胞(Invitrogen， Carlsbad, CA)中。在包含1. 5%细菌用琼脂、1 %胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、1 % NaCl、 和合适抗生素的固体培养基上筛选阳性转化株。分离的转化株在37°C在包含适当抗生素 的液体Luria-Bertoni (LB)培养基中生长16小时，并使用QIApr印Spin Miniprep试剂 盒(Qiagen，Valencia, CA)按照生产商建议的步骤分离和纯化质粒。通过如下步骤验证 构建体进行诊断性限制性内切酶消化，用琼脂糖凝胶解析DNA片段，并使用紫外光观察 条带。也通过DNA测序来验证选择的构建体，DNA测序由ElimBiopharmaceuticals Inc. (Hayward, CA)完成。 通过将载体pAM471的ERG20-PeAL-tHMGR插入片段插入到载体pAM466中，生成 质粒 PAM489。通过将 DNA 片段 ERG20-PeAftHMGR 插入到 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆载 体(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，生成载体 pAM47l，所述 DNA 片段 ERG20-PGAL-tHMGR 包含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ERG20基因的开放读码框(ORF) (ERG20核苷酸位点1至1208 ；ATG起始密码子的A是核苷酸1) (ERG20)、包含酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的分歧 GALl 和 GALlO 启动子(GAL1 核苷酸位点 _1 至-668)的 基因组位点(PaJ,和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HMGl基因的截短的ORF (HMG1 核苷酸位点 1586 至 3323) (tHMGR)。通过将 DNA 片段 TRPr856 5+548 插入到 Τ0Ρ0 TA pCR2. 1 克隆载体(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，生成载体 pAM466，所述 DNA 片段 TRPl—856 5+548 包 含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的野生型TRPl位点片段(从核苷酸位点_856延 伸至位点548，且在碱基-226和-225之间包含非天然的内部XmaI限制性酶切位点)。如表 1所示，通过PCR扩增生成DNA片段ERG20-PeAL-tHMGR和TRP1-8565+548。对PAM489的构建， 使用 XmaI 限制性内切酶(New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ)完全消化 400ng 的 pAM471 禾口 IOOng的pAM466，将对应于ERG20-PeAf tHMGR插入片段的DNA片段和线性化的pAM466载 体凝胶纯化，并将4摩尔当量的纯化的插入片段与1摩尔当量的纯化的线性化载体连接，生 成PAM489。图4A显示了 ERG20-PeAftHMGR插入片段的图谱，而SEQ ID NO :1显示了侧翼为
TRPl序列的插入片段的核苷酸序列。
通过将载体pAM472的ERG 13-PeAf tHMGR插入片段插入到载体pAM467中，生成 质粒 PAM491。通过将 DNA 片段 ERGl 3-PeAf tHMGR 插入到 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆载 体中生成载体pAM472，所述DNA片段ERGl3-PeAf tHMGR包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ERG13基因的0RF(ERG13核苷酸位点1至1626) (ERG 13)、包含酿酒酵 母(Saccharomycescerevisiae)的分歧 GALl 和 GAL10 启动子(GAL1 核苷酸位点 _1 至-668) (PaJ的基因组位点、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HMGl基因的截 短的ORF (HMG1核苷酸位点1586至3323) (tHMGR)。通过将DNA片段URA3 —723 5 插入 到Τ0Ρ0 TA pCR2. 1克隆载体中生成载体pAM467，所述DNA片段URA3_723 5toi包含酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)的野生型URA3位点片段(从核苷酸位点-723延伸至 位点-224，且在碱基-224和-223之间包含非天然的内部XmaI限制性酶切位点)。如 表2所示，通过PCR扩增生成DNA片段ERG13-PeAL-tHMGR和URA3〃2357CI1。对于pAM491的 构建，使用XmaI限制性内切酶完全消化400ng的pAM472和IOOng的pAM467，将对应于 ERG13-PGAL-tHMGR插入片段的DNA片段和线性化的pAM467载体凝胶纯化，且将4摩尔当 量的纯化的插入片段与1摩尔当量的纯化的线性化载体连接，生成PAM491。图4B显示了 ERG13-PeAf tHMGR插入片段的图谱，而SEQ ID NO :2显示了侧翼为URA3序列的插入片段的
核苷酸序列。 通过将载体pam473的idi l-peaf thmgr插入片段插入到载体pam468中生成质粒 pam493。通过将dna片段idil-peAL-thmgr插入到τ0ρ0 zeroblunt ii克隆载体中生成载体 pam473，所述dna片段 idil-pgal-thmgr包含酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae) idil 基 因的 orfddil 核苷酸位点 1 至 1017) (idil)、包含酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae) 的分歧gall和gallo启动子(gal1核苷酸位点_1至-668)的基因组位点(paj、和酿酒酵 母(saccharomyces cerevisiae)hmgl 基因的截短的 0rf(hmg1 核苷酸位点 1586 至 3323) (thmgr)。通过将dna片段ader8255653插入到τ0ρ0 ta pcr2. 1克隆载体中生成载体pam468， 所述dna片段ader825 5 653包含酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的野生型adel位 点片段(从核苷酸位点-225延伸至位点653，且在碱基-226和-225之间包含非天然的内 部xmai限制性酶切位点)。如表3所示，通过pcr扩增生成dna片段idil-peaf thmgr和 adel—825 5 653。对于pam493的构建，使用xmai限制性内切酶完全消化400ng的pam473和 ioong的pam468，将对应于idil-peaf thmgr插入片段的dna片段和线性化的pam468载体 凝胶纯化，且将4摩尔当量的纯化的插入片段与1摩尔当量的纯化的线性化载体连接，生成 载体pam493。图4c显示了 idil-peAL-thmgr插入片段的图谱，而seq id no 3显示了侧翼 为adel序列的插入片段的核苷酸序列。 通过将pAM474的ERG10-PeAfERG12插入片段插入到载体pAM469中，生成质粒 PAM495。通过将DNA片段ERG10-reAL_ERG12插入到Τ0Ρ0 ZeroBlunt II克隆载体中生成载 体 PAM474。所述 DNA 片段 ERG10-rcAL-ERG12 包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ERG10基因的0RF(ERG10核苷酸位点1至1347) (ERG10)、包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的分歧GALl和GAL10启动子(GAL 1核苷酸位点_1至-668) (Pgal)的基因组 位点、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ERG12基因的0RF(ERG12核苷酸位点1至 1482) (ERG 12)。通过将 DNA 片段 HIS3-32至-10CI0-HISMX_HIS3504 至-1103 插入到 Τ0Ρ0ΤΑ pCR2. 1 克隆载体中生成载体PAM469，所述DNA片段HIS3—325-1(I°°-HISMX-HIS35°41(13包含酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)的HIS位点的两个片段(从核苷酸位点-32延伸至位 点-1000和从核苷酸位点504延伸至位点1103)、HISMX标记、和在HIS3504至_1103序列与 HISMX标记之间的非天然的XmaI限制性酶切位点。如表4所示，通过PCR扩增生成DNA片 段 ERGIO-Pgal-ERG 12 和 HIS3-32 至-1000-HISMX_HIS3504至-1103。对于 pAM495 的构建，使用 XmaI 限制性内切酶完全消化400ng的pAM474和IOOng的pAM469，将对应于ERGlO-Pt^-ERG 12插 入片段的DNA片段和线性化的PAM469载体凝胶纯化，且将4摩尔当量的纯化的插入片段与 1摩尔当量的纯化的线性化载体连接，生成载体pAM495。图4D显示了 ERG10-PeAfERG12插 入片段的图谱，而SEQ ID NO :4显示了侧翼为HIS3序列的插入片段的核苷酸序列。
通过将pAM475的ERG8-PMl-ERG19插入片段插入到载体pAM470中生成质粒 PAM497。通过将DNA片段ERG8-PMl-ERG19插入到Τ0Ρ0 Zero BluntII克隆载体中生成载体 PAM475，所述DNA片段ERG8-Pgal-ERG19包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ERG8基 因的 0RF(ERG8 核苷酸位点 1 至 1512) (ERG8)、包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的分歧GALl和GAL10启动子(GAL1核苷酸位点_1至-668)的基因组位点(PaJ，和酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)ERG19 基因的 0RF(ERG19 核苷酸位点 1 至 1341) (ERG 19)。通过将DNA片段LEU2-1°°545°HISMX-LEU21°965m°插入到TOPOTA pCR2. 1克隆载体中生成载 体 pAM470，所述 DNA 片段 LE^Ja^^-HISMX-LEU〗1。965 包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LEU2位点的两个片段(从核苷酸位点_100延伸至位点450和从核苷酸位点 1096延伸至位点1770)、HISMX标记、和在LEU21(l965m°序列与HISMX标记之间的非天然的 XmaI限制性酶切位点。如表5所示，通过PCR扩增生成DNA片段ERG8-PMl-ERG19和LEU2-1(I° 至45°-HISMX-LEU21Q965m°。对于pAM497的构建，使用XmaI限制性内切酶完全消化400ng 的pAM475和IOOng的pAM470，将对应于ERG8-PMl-ERG19插入片段的DNA片段和线性化的 PAM470载体纯化，且将4摩尔当量的纯化的插入片段与1摩尔当量的纯化的线性化载体连 接，生成载体PAM497。图4E是ERG8-PMl-ERG19插入片段的图谱，而SEQ ID NO :5显示了侧 翼为LEU2序列的插入片段的核苷酸序列。
实施例2本实施例描述了可用于制备本发明提供的实施方案中的质粒和DNA片段的方法。通过将DNA 片段 GAL7451Q21-HPH-GAL11637 5 2587 插入到 TOPO ZEROBlunt II 克隆载 体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生成质粒 pAM584。DNA 片段 GAL74至1°21-HPH-GAL11637 至 2587 包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL7基因的ORF片段(GAL7核苷酸位点4至 1021) (GAL7451。21)、潮霉素抗性盒(HPH)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GALl 基 因的3非翻译区(UTR)片段(GAL1核苷酸位点1637至2587)。如表6所示，通过PCR扩增 生增生成DNA片段。图4F显示了图谱，而SEQ ID NO :9是DNA片段GAL7451CI21-HPH-GAL11637
5 2587的核苷酸序列。
**质粒PAM547是合成生成的，且包含HPH盒，其由大肠杆菌CEscfer/c/^ co//)的潮 霉素B磷酸转移酶编码序列组成，侧翼是轧酸克鲁维酵母(Kiuyveromyces lactis)TefJ基 因的启动子和终止子。_通过PCR扩增生成DNA片段GALSiT5ci5-1-NatR_GAL8013°951358。该DNA片段包含诺尔 斯氏链霉菌(Sti^ptomyces noursei)的诺尔丝菌素抗性选择性标记基因(NatR)，侧翼是 两个各自具有50个核苷酸的片段，分别直接位于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL80基因编码区域的上游和下游(分别是GAL80核苷酸位点-50至-1和1309至1358 ； GAL8(T50 至和 GAL801309至 1358)。图 4G 显示 了图谱，而 SEQ ID NO :8 是 DNA 片段 GAL8(T50 至^l-NatR-GALSO1309 5 1358 的核苷酸序列。通过PCR扩增生成DNA片段GALl1548-NatR_GALl15°°5155°。该DNA片段包含诺尔 斯氏链霉菌(Sti^ptomyces noursei)的诺尔丝菌素抗性选择性标记基因(NatR)，侧翼是 两个各自具有40至50个核苷酸的片段，分别位于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GALl基因编码区域的5和3端(分别是GALl核苷酸位点1至48和1500至1550 ；GALl1至48 和 GALl1500 至 1550)。图 4H 显示了图谱，而 SEQ ID NO :68 是 DNA 片段 GALl1548_NatR_GALl15°° 5 1550的核苷酸序列。通过将编码β -法呢烯合成酶的核苷酸序列插入到PRS425-GAL1载体(Mumberg 等(1994) Nucl. Acids. Res. 22 (25) :5767_5768)中，生成表达质粒 pAM353。合成生成 核苷酸序列插入片段，使用黄花蒿(Artemisia annua)的β-法呢烯合成酶基因的编 码序列(GenBank登录号ΑΥ835398)作为模板，该编码序列经密码子优化以在酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中表达(SEQ IDNO :10)。合成生成的核苷酸序列侧翼是 5BamHI和3XhoI限制酶切位点，并因此可以被克隆到克隆载体例如标准的pUC或pACYC源 载体的相容的限制性酶切位点中。通过使用BamHI和XhoI限制性内切酶完全消化DNA合 成构建物而将合成生成的核苷酸序列分离。通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取包含 β -法呢烯合成酶编码序列的约1. 7kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接到pRS425_GALl 载体的BamHI XhoI限制性酶切位点中，生成表达质粒pAM353。通过将编码黄花蒿(Artemisia annua)的β -法呢烯合成酶的、经密码子优化以 在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的核苷酸序列插入到载体pAM178 (SEQ ID NO 69)中以生成表达质粒 pAM404。使用引物 52_84pAM326BamHI (SEQ ID NO :71)禾口 52-84pAM326NheI (SEQ ID NO 72)从pAM353PCR扩增编码β -法呢烯合成酶的核苷酸序列。 使用BamHI和Nhel限制性内切酶将得到的PCR产物完全消化，通过凝胶电泳解析反应混合 物，凝胶提取包含β-法呢烯合成酶编码序列的约1.7kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接到载体PAM178的BamHI Nhel限制酶切位点中以生成表达质粒pAM404 (质粒图谱参见图 5)。实施例3本实施例描述了可用于本发明提供的实施方案的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生成。通过用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MET3启动子替换ERG9启动子，并用光滑假丝酵母(Candida glabrata) LEU2基因(CgLEU2)替换ADE10RF，来制备酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株 CEN. PK2-1C Y002 和 Y003 (MATA 或 ΜΑΤ α ；ura3-52 ； trp 1-289 ；leu2-3,112 ；his3A1 ；MAL2-8C ；SUC2)(van Dijken 等(2000)Enzyme Microb. Technol.26(9-10) 706-714)从而引入可被诱导的MEV途径基因。这一点通过以下方法完 成使用引物 50-56-pwl00-G(SEQ ID NO 10)和 50-56-pwl01_G (SEQ ID N0:11)(其包含 与天然ERG9启动子同源的45个碱基对)PCR扩增载体pAM328的KanMX-PMET3区域(SEQ ID NO 6)，该区域包含Pmet3启动子，该启动子的前面是卡那霉素抗性标记，该标记的侧翼是乳 酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) Tefl基因的启动子和终止子；使用40% w/w聚乙 二醇 3350 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、IOOmM 醋酸锂(Sigma-Aldrich，St. Louis, M0)、 禾口 10 μ g 鲑鱼精 DNA(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)将 10 μ g 生成的 PCR 产物转化到 指数生长的Y002和Y003细胞中，并将细胞在30°C培养30分钟，接着在42°C热休克30分 钟(Schiestl 和 Gietz (1989) Curr. Genet. 16 :339_346)。通过细胞在包含 0. 5 μ g/mL 遗 传霉素(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)的富集培养基上生长的能力来识别阳性重组 物，并通过PCR鉴定来确认筛选的克隆。得到的克隆被命名为Y93 (ΜΑΤ Α)和Υ94(ΜΑΤα)。 然后使用引物 61-67-CPK066-G(SEQID NO :60)和 61-67-CPK067-G (SEQ ID N0:61)(其包 含与ADE10RF同源的50个碱基对的侧翼)从光滑假丝酵母(Candida glabrata)基因组 DNA (ATCC,Manassas, VA)扩增3. 5kb CgLEU2基因组位点，并将10 μ g得到的PCR产物转化 到指数生长的Y93和Y94细胞中，通过在缺乏亮氨酸补充下生长来选择阳性重组物，并通过 PCR鉴定来确认筛选的克隆。得到的克隆被命名为Y176 (ΜΑΤ Α)和Υ177(ΜΑΤα)。通过使用PmeI 限制性内切酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)将 ρΑΜ491 禾口 ΡΑΜ495质粒DNA消化完全，并将纯化的DNA插入片段引入到指数生长的Υ176细胞中，来生 成菌株Υ188。通过在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基上生长来筛选阳性重组物，并通过诊断 性PCR来确认整合到了正确的基因组位点中。通过使用PmeI限制性内切酶将ρΑΜ489和ρΑΜ497质粒DNA消化完全，并将纯化的 DNA插入片段引入到指数生长的Υ177细胞中，以生成菌株Υ189。通过在缺乏色氨酸和组氨 酸的培养基上生长来筛选阳性重组，并通过诊断性PCR来确认整合到了正确的基因组位点 中。将约1 X IO7个来自菌株Υ188和Υ189的细胞在室温下在YPD培养基平板上混合 6小时以使之结合。将混合的细胞培养物接种到缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基中， 以筛选二倍体细胞的生长。如下生成菌株Υ238 用已使用PmeI限制性内切酶完全消化的 ΡΑΜ493质粒DNA转化二倍体细胞，并将纯化的DNA插入片段引入到指数生长的二倍体细胞 中。通过在缺乏腺嘌呤的培养基上生长来筛选阳性重组，并通过诊断性PCR来确认整合到 了正确的基因组位点中。
如下生成单倍体菌株Υ211(ΜΑΤα)使菌株Υ238在2 %醋酸钾和0. 02 %棉籽 糖液体培养基中形成孢子，使用Singer Instruments MSM300系列微操作器(Singer Instrument LTD, Somerset, UK)分离约200个遗传四分体，通过它们在腺嘌呤、组氨酸、尿 嘧啶和色氨酸的缺乏下的生长能力，识别包含了引入的遗传物质的合适补体的独立遗传分 离物，并通过诊断性PCR确认所有引入的DNA的整合。 通过使菌株能够将FPP转化成紫穗槐-4，11-二烯，由菌株Y211生成菌株Y227。为 此，用表达质粒pAM426(SEQ IDNO 7)转化指数生长的Y211细胞，该质粒包含GALl启动子， 其与经密码子优化以在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达的紫穗槐_4，11-二 烯合成酶基因的编码序列可操作地连接(Merke等(2000) Ach. Biochem. Biophys. 381 173-180)。在缺乏亮氨酸的完全合成的确定成分培养基上筛选宿主细胞转化株。通过删除GAL80基因的编码序列，并因此使得菌株中的GAL启动子具有组成性活 性，由菌株Y227生成菌株Y293。为此，用DNA片段GAL80_5°5-LNatR-GALSO13ci95 1358转化指 数生长的Y227细胞。在包含100 μ g/mL诺尔丝菌素的YPD琼脂上筛选宿主细胞转化株，挑 取单克隆，并通过诊断性PCR来确认整合到了正确的基因组位点中。通过使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Y227生成菌株Y337。为此，使用PmeI限制 性内切酶将PAM584质粒DNA消化完全，并将纯化的DNA插入片段GAL7451(I21-HPH-GAL11637 5 2587引入到指数生长的Y227细胞中。通过在包含潮霉素B (Sigma，St. Louis, MO)的YPD琼 脂上生长来筛选阳性重组物。通过诊断性PCR和测试菌株缺乏使用半乳糖作碳源的能力， 来确认整合到了正确的基因组位点中。通过使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Y211生成菌株Y351。为此，使用PmeI限制 性内切酶将PAM584质粒DNA消化完全，并将纯化的DNA插入片段GAL7451(I21-HPH-GAL11637 5 2587引入到指数生长的Y211中。在包含潮霉素B的YPD琼脂上筛选宿主细胞转化株。通过 诊断性PCR和测试菌株缺乏使用半乳糖作碳源的能力，来确认整合到了正确的基因组位点 中。通过使得菌株能够生成β -法呢烯合成酶，由菌株Υ351生成菌株Υ352。为此，用 表达质粒ΡΑΜ404转化指数生长的Υ351细胞。在缺乏亮氨酸的完全合成的确定成分培养基 上筛选宿主细胞转化株。通过删除GALl基因的编码序列并因此使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Υ227生 成菌株Υ283。为此，用DNA片段GALll548-NatR-GALl15°°5l55°转化指数生长的Y227细胞。 在包含100 μ g/mL诺尔丝菌素的YPD琼脂上筛选宿主细胞转化株，挑取单克隆，并通过诊断 性PCR和通过使菌株在包含甘油和2-脱氧半乳糖(有功能的GALlp会把后者转化成毒素) 的琼脂上生长，来确认整合到了正确的基因组位点中。通过用载体pAM178(SEQ ID NO 69)转化指数生长的Y211细胞，由菌株Y211生成 菌株Y221。通过在缺乏亮氨酸的完全合成培养基上生长来筛选阳性转化株。通过删除GAL80基因的编码序列并因此使得菌株中的GAL启动子具有组成性活 性，由菌株Y221生成菌株Y290。通过筛选丢失了 pAM178载体的克隆，由菌株Y290生成菌株Y318。通过使得菌株能够在半乳糖存在下生成β _法呢烯合成酶，由菌株Υ318生成菌株 409。为此，用表达质粒ΡΑΜ404转化指数生长的Υ318细胞。在缺乏亮氨酸的完全合成的确定成分培养基上筛选宿主细胞转化株。通过使得菌株中的GAL启动子具有组成性活性并能够在葡萄糖的存在下表达更 高水平的GAL4p(即，能够在葡萄糖存在下更加有效地驱动半乳糖诱导的启动子的表达， 同时确保有足够的Gal4p转录因子驱动细胞中所有半乳糖诱导的启动子的表达)，由菌株 Y409生成菌株Y419。为此，菌株Y409中ERG9位点的KanMX标记被替换成一段DNA片段，该 片段包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL4基因的ORF (其处于“可操作的、组成 性的”天然启动子的控制下)(Griggs&Johnston (1991)PNAS 88(19) :8597_8601)，和 GAL4 终止子(PGal4QC-GAL4-TGAL4)、以及诺尔斯氏链霉菌(Str印tomyces noursei)的诺尔丝菌素抗 性选择标记基因(NatR)(其侧翼是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)Tefl基因的 启动子和终止子)。通过将甲羟戊酸激酶的编码区域的另一拷贝引入到位于GAL80位点的Pem的控制下，由菌株Y419生成菌株Y677。通过在30°C在接种培养基中培养细胞，直到其0D_值达到2-5来制备菌株Y293、 Y283、Y352和Y677的细胞库。此时，将瓶放置于冰上。将三份培养物和2份冰冷的无菌 50%甘油混合，将ImL该混合物的等份在_80°C冷冻在小冷冻瓶中。对于菌株Y337使用相 同步骤，但该菌株的0D_值在其冷冻时为13. 6。实施例4本实施例描述了宿主细胞在补料分批、仅用葡萄糖给料的限碳发酵中对紫穗 槐-4，11-二烯的生成。通过接种ImL冷冻小瓶到包含50mL接种培养基(表7)的250mL瓶中，制备Y337 接种培养物。在30°C生长约24小时后，将0. 5mL培养物在各自包含50mL接种培养基的另 外多个250mL瓶中继代培养。接种培养物在30°C生长过夜，直至0D_值为约3到12。合 并这些瓶，并被用来以10% ν/ν接种包含分批培养基(表8)的生物反应器。 储备液
C)通过在水中加热溶解琥珀酸，让溶液冷却，用NaOH调节pH值为5.05，并 高压灭菌溶液(12〗°C，45分钟)来制备琥珀酸储备液_
a)首先将生物素溶解在10mL 5 M NaOH中，然后添加到DI水(750mL/L)中。
使用5 MNaOH或HCl调节pH值至6.5，并在加入每种维生素后再次调节pH。 所有的维生素都溶解后，溶液用DI水朴满至终体积，并过滤灭菌。瓶子用铝 箔覆盖，在4°C储存。
b)在ZnSO4溶解前，首先将EDTA添加到DI水(750mL/L)中。使用5M NaOH 调节pH值至6.0，并在加入每种金属后再次调节pH。所有的金属都溶解后， 使用5 MHCl调节pH值至4.0，溶液用DI水补满至终体积，并过滤灭茵。瓶 子用铝箔覆盖，在4°C储存。__自动控制发酵的pH值，而且通过加入ION NH4OH使pH保持在5。将温度保持在 30°C。以ILPM的速率供应气流。通过高落搅拌和随后的氧气富集将溶解的氧保持在40%。 用Biospumex抗泡沫剂200K控制泡沫。 让生物反应器培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖耗尽，在此时，开始指数葡 萄糖给料，其中以如下方程式限定的速率将葡萄糖给料培养基(表10)泵到生物反应器 中F = νμ^β^^'^V = V0+Vfeed
F是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间生物反应器中的液体体积(L)，Sb是分 批培养基中的底物浓度(20g/L)，μ set是比给料速率(0. OSThf1)，t是分批时间(hr)，tQ是 给料开始时的分批时间(hr)，V。是生物反应器中的初始体积，而Vfted是在指定时间添加到 生物反应器中的给料总体积(L)。持续指数给料阶段，直到F/V比率达到预设的最大给料速 率(表11)。达到该最大值后，剩余过程中的F/V比率(表11)恒定地保持在预设的固定给 料速率。 b)通过在 300 mL 的 38°C 自来水中混合葡萄糖、KH2P04、MgSO4WH2CK K2SO4 和Na2SO4,加热混合物到约100°C以完全溶解糖和盐，添加水将体积补到750 mL,冷却溶液，使用0.2微米过滤器过滤灭菌，在无菌罩内先添加237 mL 95%(v/v)乙醇，再添加补充成分(微量金属和维生素的过滤灭菌的浓缩储备 液)，添加无菌水将溶液补满至终体积1 L而制备混合给料培养基。_接种后约24小时，在OD6tltl值为50时，通过向生物反应器和给料瓶添加10g/L半 乳糖(每升培养物体积添加22. 2mL的450g/L半乳糖储备液)，诱导紫穗槐_4，11-二烯的 生成。另外，向生物反应器添加0. 25g/L的甲硫氨酸，并向给料瓶添加lg/L的甲硫氨酸，以 抑制ERG9基因的转录(每升培养物体积添加IOmL的25g/L甲硫氨酸储备液，和每升给料 体积添加40mL的25g/L甲硫氨酸储备液)，并向生物反应器添加10% ν/ν的高压灭菌的油 酸甲酯，以收获紫穗槐-4，11 - 二烯。(通过在水中加热溶解糖，让溶液冷却，并过滤灭菌，来 制备450g/L半乳糖储备液。通过在水中溶解甲硫氨酸，并过滤灭菌溶液，制备25g/L甲硫 氨酸储备液。)在不同时间点取样，并以1 20的比率将样本稀释在甲醇中。将每个稀释的样本 振荡30分钟，沉淀培养物残渣。通过将5到10 μ L上清液转移到包含990到995 μ L使用反式-石竹烯作为内标标定的乙酸乙酯的干净玻璃小瓶中，测定紫穗槐-4，11- 二烯的滴 度。在配备了火焰离子探测器的Agilent 7890N气相色谱仪(Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA)上分析乙酸乙酯样本。如下分离各样本的1 μ L等份中的化合物使用DB Wax 柱(AgilentTechnologies, Inc.，Palo Alto，CA)，氦载气，和以下温度程序:220°C保持 3分钟，以100°C/分钟增温到温度260°C。使用该方案，紫穗槐_4，11-二烯具有约3. 4分 钟的滞留时间。将产生的峰面积与纯化的紫穗槐_4，11-二烯在用反式-石竹烯标定的乙 酸乙酯中的定量校准曲线比较，计算紫穗槐-4，11-二烯的滴度。如表11和图6所示，在仅用葡萄糖给料的过程中，在发酵开始后第114小时，菌株 Y337 生成了 2. 4g/L 紫穗槐-4，11- 二烯(AD)。 实施例5本实施例描述了宿主细胞在补料分批、葡萄糖_乙醇混合给料的限碳发酵中对紫 穗槐-4，11-二烯的生成。如实施例4中所述，制备Y337接种培养物，并用来接种生物反应器。进行发酵并 分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变。在发酵的早期阶段，分批培养基中的一些葡萄糖被转化成乙醇。让生物反应器的 培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖和乙醇耗尽，在此时，开始指数给料，其中以如下 方程式规定的速率将混合给料培养基(表10)泵到生物反应器中 V = VVfeedF是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间生物反应器中的液体体积(L)，Sb是分 批培养基中的底物浓度(20g/L)，μ set是比给料速率(0. OSThr—1)，t是分批时间(hr)，tQ是 给料开始时的分批时间(hr)，Vtl是生物反应器中的初始体积，而Vfted是在指定时间添加到 生物反应器中的给料总体积(L)。持续指数给料阶段，直到F/V比率达到预设的最大给料速 率，单位为g底物/hr/L生物反应器体积(表11)。达到该最大值后，剩余过程中F/V比率 (表11)恒定地保持在预设的固定给料速率。接种约40小时后，在0D_值为77时，诱导紫穗槐_4，11- 二烯的生成。如表11和图6显示，在葡萄糖和乙醇混合给料发酵中，在发酵开始后第118小时， 菌株Y337生成了高达16. 5g/L的紫穗槐_4，11- 二烯。实施例6
本实施例描述了宿主细胞在补料分批、仅用乙醇给料的脉冲给料发酵中对紫穗 槐-4，11-二烯的生成。如实施例3中所述，制备Y293接种培养物，并用来接种生物反应器。进行发酵并 分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变在发酵的早期阶段期间，分批培养基中的一些葡萄糖被转化成乙醇。让生物反应 器的培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖和乙醇耗尽，在此时，开始乙醇脉冲给料。给 料速率由废气中的CO2百分比(CO2释放速率；CER)和计算机算法控制，所述CER用废气分 析仪监测，所述计算机算法指定一个变量(Cmax)为最大CER，其跟踪废气中的CO2百分比的 最大值。当在葡萄糖上生长时，CER快速演变(图7B)。当葡萄糖从分批培养基中耗尽时， CER降到低于Cmax的50%，而计算机算法重设Cmax为下降后的CO2值。当由分批培养基中的 过剩葡萄糖生成的乙醇耗尽时，CER第二次下降。脉冲给料在CER降到低于当前Cmax的75% 时自动触发。泵向生物反应器中注射75% (ν/ν)乙醇5分钟，向培养物递送约IOg乙醇。 Cmax被重设为泵关毕时废气中的CO2百分比的值，然后重新指定以跟踪CO2释放的增加，且 当CER再次降到低于新设置的Cmax的75%时，泵被重新激活。在发酵期间重复该给料算法 (图7Α)，并确保没有对培养物过量给料乙醇。因为盐，微量金属、维生素、糖、或氨基酸溶液 在乙醇给料中都是不溶的，浓缩的给料成分(表12)被混合，并通过生物反应器封头中的隔 膜，依照自前次添加给料成分后已经递送的乙醇体积，每天注射一次。 在葡萄糖从分批培养基中耗尽后十小时，通过封头向生物反应器添加0. 25g/L甲 硫氨酸，且将10% ν/ν高压灭菌的油酸甲酯泵到容器中。(因为菌株Υ293包含被破坏的 GAL80基因，半乳糖不是诱导紫穗槐_4，11- 二烯生成所必需的。)如图7Β显示，菌株Υ293生成36g/L紫穗槐_4，11-二烯。实施例7本实施例描述了宿主细胞在补料分批、仅用乙醇给料的限碳发酵中对紫穗槐_4， 11-二烯的生成。如实施例3中所述，制备Y293接种培养物，并用来接种包含分批培养基(表13) 的生物反应器。 进行发酵并分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变使生物反应器中的培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖耗尽，在此时，开始指 数给料，其中以如下方程式规定的速率将葡萄糖给料培养基(表10)泵到生物反应器中 F是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间发酵器中的液体体积(L)，Sb是分批培 养基中的底物浓度(20g/L), Pset是比给料速率(0. OSihr-1), t是分批时间(hr), t0是给 料开始时的分批时间(hr)，Vtl是发酵器中的初始体积，而Vfted是在指定时间添加到发酵器 中的给料总体积(L)。持续指数给料，直到达到最大给料速率7. lg/hr/L (OD600值约为50)。 在此时，将给料切换为乙醇给料(190proof)，而且对于剩余的发酵，给料速率设置为恒定容 积值2. 5g/hr/L。通过该设定的给料速率，乙醇消耗率被控制，范围为0. 4到1. 75g乙醇/ gDCW/天。如图8显示，在发酵开始后第187小时，菌株Y293生成37g/L紫穗槐_4，11_ 二烯。实施例8本实施例描述了宿主细胞在补料分批、仅用乙醇给料的限碳发酵中对法呢烯的生 成。如实施例3中所述，制备Y677接种培养物，并用来接种各自包含630mL分批培养 基(表14)的两个生物反应器。向两个生物反应器中的一个添加200mL油酸甲酯，以收获 产物。进行发酵并分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变
表14-生物反应器培养基 在发酵的早期阶段期间，分批培养基中的一些葡萄糖被转化成乙醇。让生物反应 器中的培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖和乙醇耗尽，在此时，开始指数给料，其中 以如下方程式规定的速率将纯乙醇(190prOOf)泵到生物反应器中 V = V。+Vfeed。F是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间发酵器中的液体体积(L)，Sb是分批培 养基中的底物浓度(39. 03g/L)，μ set是比给料速率(0. OSShr-1)，t是分批时间(hr)，t0是 给料开始时的分批时间(hr)，Vtl是发酵器中的初始体积(0. 70，而Vfeed是在指定时间添加 到发酵器中的给料总体积(L)。持续指数给料阶段，直到F/V比率达到最大给料速率5g底 物/hr/L生物反应器体积。达到该最大值后，在剩余过程中F/V比率恒定地保持在2. 5g/ hr/L的固定给料速率。但是，如图9A中显示，在指数给料阶段开始时，乙醇利用的相对缓慢 速率导致乙醇积累。该积累使得必须手动调节预设的给料速率(图9B)和将给料速率加倍 时间增加12至14小时以保持限碳过程。在油酸甲酯存在下生长的细胞快速恢复并重新生 长至预设的最大值和固定给料速率(图9C)。相比之下，不包含油酸甲酯的培养物更慢地 消耗积累的乙醇，并因此需要二次暂停固定给料，接着将固定给料速率从2. 5g/hr/L降低 到1. 25g/hr/L。总的来说，菌株Y677在油酸甲酯缺乏下的乙醇消耗率为0至2. Ig乙醇/g DCW/天，而在油酸甲酯存在下为0. 27-2. 9g乙醇/g DCW/天。生物反应器的废气被导入冷凝器，以使用废气质谱仪测量氧气摄入率(OUR)和CO2 生成(CER)。图9D显示了在油酸甲酯存在下菌株Y677的CER和OUR。通过一天取样两次，监测细胞密度和乙醇消耗。在每个时间点，取ImL培养液样 本，并以1 1000用水稀释，使用波长设置在eoonm的分光光度计测量细胞密度。通过HPLC量化乙醇水平。在每个时间点，取ImL培养液样本，并在30mM硫酸溶液 中进行2 X稀释(将400 μ L 30mM硫酸加入400 μ L上清液以达到15mM硫酸的终浓度，这 与流动相溶液的浓度匹配)。加样前通过离心和过滤去除细胞。通过GC-FID量化生成的法呢烯的水平。在每个时间点，取100 μ L油酸甲酯覆 盖层，并用包含0.001%反式-β石竹烯的乙酸乙酯1 40稀释。混合物用乙酸乙酯以 1 100再次稀释，最终成为1 4000稀释液，这与该方法的校准曲线相适应。当没有使用 油酸甲酯收获产物时，将25 μ L培养液与975 μ L甲醇混合，混合物振荡五分钟并离心，最终 在分析前用包含0.001%反式-β石竹烯的乙酸乙酯以1 100稀释。如图9Ε显示，在油酸甲酯存在下，菌株Υ677达到法呢烯滴度峰值30g/L，而在油酸 甲酯缺乏下其达到法呢烯滴度峰值40g/L。实施例9本实施例描述了宿主细胞在限氧发酵中对紫穗槐_4，11- 二烯和法呢烯的生成。如实施例3中所述，制备Y283和Y352接种培养物，并用来接种包含SOOmL分批培 养基(表15)和IOOmL油酸甲酯的生物反应器。 发酵在配有两个气流定量控制器的2L Sartorius Biostat B中执行。通过加入 15N NH4OH和5N H2SO4,将pH值自动控制在pH 5. O0将温度保持在30°C，并使用Biospumex 200K牌抗泡沫剂控制泡沫。在0D500值为0. 6-1之间接种生物反应器，并使其用30g/L的 葡萄糖生长。生物反应器的废气被导入冷凝器，以使用废气质谱仪测量氧气摄入率(OUR)和CO2 生成(CER)。使用敏感度在IOppb至饱和之间的O2传感器探头(Hamilton，OXYFERM FDA 225，Hamilton Company, Reno, NV)测量溶解的氧(DO)浓度。在发酵的初始阶段期间，生物反应器培养物将分批培养基中的葡萄糖转化成生物 量和乙醇。当葡萄糖被消耗(取决于培养基中的氧气可用度，在发酵开始后的8-14小时)， 半乳糖运输和转录机制的葡萄糖抑制被减轻了，且GAL启动子的基因表达被分批培养基中 的半乳糖诱导。分批培养物持续生长，直到发酵阶段中生成的乙醇被耗尽，此时，DO峰标记 了培养阶段的结束。对需氧工艺，将洁净的干燥空气以ILPM的速率喷射到培养基中。搅拌速率初始设 置为400rpm，并使用DO反馈控制循环和搅拌级联程序来保持DO浓度为40% (表16)。对微需氧工艺，气体流量降低到0. 25LPM，以使到达废气分析仪的气体的稀释最 小化，并增加质谱仪的敏感度。氧气递送速率根据所使用的不同的空气对氮气的气流比率 (表16)而变化。对完全厌氧工艺，接种前，将100%氮气以0. 25LPM喷射到水性培养基中，而且在 培养期间保持恒定搅拌速率400rpm(表16)。 通过一天取样两次，监测细胞密度和乙醇消耗。在每个时间点，取ImL培养液样 本，并用水以1 100稀释，使用波长设置在eoonm的分光光度计测量细胞密度。如实施例8中所述，量化所生成的乙醇和法呢烯的水平，但油酸甲酯样本用乙酸 乙酯稀释到最终1 400稀释液而不是1 4000稀释液。图IOA显示了宿主菌株Y283的各种发酵中的DO浓度。如图IOB和IOC显示，在 菌株Y283中，培养基中的氧气可用度增加引起细胞生长增加、葡萄糖向乙醇转化的速率增 力口、和从培养基消耗乙醇的速率增加。尽管菌株Y283的生长、产物形成、和乙醇消耗在完全 通风培养(DO为40%)中是最大的，它们在24小时后进入平台期。如表17显示，所有微氧 工艺的每个细胞的乙醇消耗率在0.40-0. 72g乙醇/g DCW/天之间。如图IOD显示，在80% 空气和20%氮气时观察到紫穗槐-4，11- 二烯相对于碳投入的最佳产量。
表17 -微氧发酵的具体乙醇利用率(EUR)— 如图IOE和IOF显示，在菌株Y352中，培养物中的氧气可用度增加引起细胞生长增加、葡萄糖向乙醇转化的速率增加、和从培养基消耗乙醇的速率增加。如表17显示，两个 测试的微氧工艺中的每个细胞的乙醇消耗率在0. 42-0. 88g乙醇/g DCW/天之间。如图IOG 显示，尽管在100%空气下观察到法呢烯相对碳投入的稍高产量，但在微氧培养物中，在更 长的时间段内持续生成。实施例10本实施例描述了宿主细胞在碳和磷酸盐受限的摇瓶培养中对紫穗槐_4，11- 二烯 的生成。通过将固体淀粉葡糖苷酶(Sigma A7420-100MG)溶解在0. 5M琥珀酸缓冲液(pH 5. 0)中至100U/mL的终酶浓度，并过滤灭菌溶液，制备淀粉葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)储备酶 溶液。通过将ImL冷冻的Y337细胞接种到装有50mL磷酸盐受限的接种培养基(表18) 的250mL挡板瓶中，制备Y337的接种培养物。接种培养物在30°C和200rpm生长过夜。 使用Y337接种培养物接种数个250mL带挡板的摇瓶，起始0D_值为0. 05。制备 瓶装有40mL磷酸盐受限的制备培养基(表18)。向每个瓶中加入100g/L的过滤灭菌的 KH2PO4储备液，终浓度为0. 1、0. 25、0. 5、0. 8、2和8g/L。接种前，向每个瓶中加入80 μ L新 鲜解冻的100U/mL过滤灭菌的淀粉葡糖苷酶储备液(终浓度为0. 2U/mL)。制备瓶在30°C 和200rpm培养长达3天。在培养期过程中，葡萄糖被葡糖淀粉酶以约20mg/小时的恒定速 率释放。通过将2到IOyL油酸甲酯覆盖层转移到包含500μ L以β -或反式-石竹烯作 内标标定的乙酸乙酯的干净玻璃小瓶中，并如实施例4中所述分析乙酸乙酯样本，测定紫 穗槐-4，11-二烯的滴度。如图11显示，除了最低磷酸盐浓度(0. lg/L)以外，大体上紫穗槐_4，11-二烯滴 度在测试的所有磷酸盐浓度是类似的，但在较低磷酸盐浓度下细胞生长受限，转换为在较 低磷酸盐浓度时每个细胞生成的紫穗槐_4，11- 二烯增加。实施例11本实施例描述了宿主细胞在补料分批、葡萄糖给料并伴有磷酸盐限制的限碳发酵中对紫穗槐-4，11-二烯的生成。如实施例3中所述，制备Y337接种培养物，并用来接种包含磷酸盐受限的分批培 养基(表19)的生物反应器。进行发酵并分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变。使生物反应器的培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖耗尽，此时，开始指数给 料，其中以如下方程式规定的速率将磷酸盐受限的葡萄糖给料培养基(表19)泵到生物反 应器中 V = VVfeed"F是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间生物反应器中的液体体积(L)，Sb是分 批培养基中的底物浓度(19. 5g/L)，μ set是比给料速率(0. OSihr-1)，t是分批时间(hr)，t0 是给料开始时的分批时间(hr)，Vtl是生物反应器中的初始体积，而Vfrad是在指定时间添加 到生物反应器中的给料总体积(L)。持续指数给料，直到F/V比率达到预设的最大给料速 率(表20)。达到该最大给料速率后，剩余过程中的F/V比率恒定地保持在预设的固定给料 速率。但是，因为随着更多给料被添加到生物反应器中，体积(V)持续增加，底物质量流速 (F)持续增加直到体积达到生物反应器的最大工作体积(约3倍于起始体积)。在剩余过 程中，通过连续从反应器中去除细胞培养液，将生物反应器体积保持恒定，且底物质量流速 (F)保持恒定。图12A显示了发酵的葡萄糖给料速率图。 在OD6tltl值为约50时，诱导紫穗槐-4，11- 二烯的生成。如表20和图12B显示，供应8g/L KH2PO4的分批培养基和没有磷酸盐的给料培养基 显示最佳紫穗槐_4，11- 二烯产量为5. 52g/L。在这些条件下，分批培养基中的磷酸盐在40 小时被耗尽，而且细胞生长因而受限(即，更少的碳成为生物量而更多的碳生成紫穗槐_4， 11-二烯)(图 12C)。 实施例12本实施例描述了宿主细胞在补料分批、葡萄糖/乙醇混合给料并伴有磷酸盐限制 的限碳发酵中对紫穗槐_4，11- 二烯的生成。如实施例3中所述，制备Y337接种培养物，并用来接种包含磷酸盐受限的分批培 养基(表19)的生物反应器。进行发酵并分析样本，基本如实施例4中所述，具有以下改变。在发酵的早期阶段期间，分批培养基中的一些葡萄糖被转化成乙醇。使生物反应 器中的培养物生长，直到分批培养基中的葡萄糖和乙醇耗尽，此时，开始指数给料，其中以 如下方程式规定的速率将磷酸盐受限的混合给料培养基(表19)泵到生物反应器中 V = V0+VfeedF是底物质量流速(g/hr)，V是在指定时间生物反应器中的液体体积(L)，Sb是分 批培养基中的底物浓度(20g/L)，μ set是比给料速率(0. OSThr—1)，t是分批时间(hr)，tQ是 给料开始时的分批时间(hr)，Vtl是生物反应器中的初始体积，而Vfted是在指定时间添加到 生物反应器中的给料总体积(L)。持续指数给料阶段，直到F/V比率达到预设的最大给料速 率，单位为g底物/hr/L生物反应器体积(表21)。达到该最大值后，剩余过程中的F/V比 率恒定地保持在预设的固定给料速率(表21)。在OD6tltl值为约50时，诱导紫穗槐-4，11- 二烯的生成。如表21和图13A显示，供应8g/L KH2PO4的分批培养基和0到0. 5g/LKH2P04的给 料培养基显示最佳的紫穗槐_4，11-二烯产量超过26到27g/L。在这些条件下，分批培养基 中的磷酸盐在40小时被耗尽，而且细胞生长因而受限(即，更少的碳成为生物量而更多的 碳生成紫穗槐_4，11- 二烯)(图13B)。与Og/L KH2PO4的给料培养基相比，0. 5g/L KH2PO4 的给料培养基在额外的24小时中实现细胞生长和紫穗槐_4，11- 二烯的持续生成。 实施例13本实施例描述了在其基因组中整合了编码酶(包括MEV途径的酶和萜烯合成酶) 的异源核苷酸序列的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主菌株的生成方法。使用Datsenko&Wanner ((2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :6640_6645)概述的 步骤的变形进行基因组整合。该方法使用包含了 T7启动子-感兴趣的基因-FRT-Kan-FRT 盒的质粒。盒的两边侧翼各为约100个核苷酸，其与盒的整合所靶向的基因组位点的侧翼 区域同源。通过PCR扩增盒生成侧翼区域，所述扩增使用的引物包含与盒的3或5端同源 的约30个核苷酸的延伸片段，和与基因组位点侧翼区域同源的约50个核苷酸的另一延伸 片段(图14)。得到的PCR产物在第二轮PCR反应中用作模板，在盒的任一端添加了另外 50个核苷酸的同源侧翼序列(图14)。盒与其侧翼序列被电转化到携带编码Red重组酶蛋 白的质粒的电感受态大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中。通过克隆PCR筛选卡那霉素 ("Kan")抗性克隆。阳性重组物用Pl-噬菌体处理，而整合通过Pl-转导转移到新的菌株 中。得到的菌株用编码FLP重组酶的质粒转化，该酶的活性导致Kan基因从盒中被切除，在 靶向的基因组位点留下T7启动子-感兴趣的基因。最终的宿主菌株去除了 FLP重组酶。应用所述方法，通过将编码β -法呢烯合成酶(“FS”)的DNA片段整合到大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株B1021 (MM294(DE3) (TlR))的Lac操纵子中，生成宿主菌株B1060。 为此，使用DE3溶原化试剂盒(Novagen, Darmstadt, Germany)使大肠杆菌(Escherichia coli)菌株MM294(ATCC33625)感染DE3，并通过在Tl噬菌体过剩存在下生长菌株使其对 Tl噬菌体有抗性，因此生成菌株B1021。使用QuikChange methodology (Geiser等(2001) Biotechniques 31 :88_92)的改进形式，将FRT-Kan-FRT盒插入到表达质粒pAM454中，该 质粒编码黄花蒿(Artemisia annua)的β -法呢烯合成酶(GenBank登录号ΑΥ835398)，其 在Τ7启动子控制下，且经密码子优化以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达，因此生成了表达质粒PAM617。因为pAM617中的T7-FS-FRT-Kan-FRT盒侧翼已经是来自mhpR和cynX 位点的序列(SEQ ID NO 70)，仅需要一轮PCR扩增来形成与Lac操纵子侧翼mhpR或cynX 序列同源的100个核苷酸的序列。包含表达质粒PAM88 (编码Red重组酶)的匪294 (DE3) 宿主细胞在30°C在包含50μ g/mL羧苄青霉素和ImM阿拉伯糖的LB培养基中生长到OD6tltl值 为0.6。收获细胞，使其成为电感受态，并用PCR产物转化。在包含50 μ g/mL卡那霉素的LB 琼脂上在30°C生长2天后，获取克隆，并通过克隆PCR筛选正确的整合体。整合通过Pl-转 导转移到宿主菌株B1021(MM294(DE3) (TlR))中，而且得到的菌株被制成感受态，并用表达 质粒pAM89 (编码FLP重组酶)转化。在包含50 μ g/mL羧苄青霉素的LB琼脂上在30°C生 长2天后，获取克隆。分离一个克隆，并在LB培养基中在42°C生长以丢失质粒pAM89，生成 菌株 B1060 (MM294 (DE3) (TlR) Iac T7-FS)。
通过将编码甲羟戊酸激酶(“MK”)的DNA片段整合到大肠杆菌(Escherichia coli)菌株B1021的ackpta操纵子中，生成宿主菌株B1061。为此，将经密码子优化以在 大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲 羟戊酸激酶的DNA片段(SEQ ID NO 71)插入到质粒pAM618的NdeI BamHI限制性酶切位 点中。质粒PAM618包含T7启动子，接着是多克隆位点(MCS)和FRT-KanR-FRT盒(SEQ ID NO :72，图15)。得到的T7-MK-FRT-Kan-FRT盒如上所述经历两轮PCR扩增，以创造与ack Pta操纵子同源的100个核苷酸的侧翼序列。将PCR最终产物如上所述引入到大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株 B1021 中，生成菌株 B1061 (MM294(DE3) (TlR)ackpta: :T7_MK)。 该整合也被转移到宿主菌株B1060中，生成菌株B1124(MM294(DE3) (TlR)Iac: :T7_FS ackpta:T7-MK)。通过将编码磷酸甲羟戊酸激酶(“PMK”)的DNA片段整合到大肠杆菌(Escherichia coli)菌株B1021的poxB位点中，生成宿主菌株B1062。为此，将经密码子优化以在大肠杆 菌(Escherichia coli)中表达的编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)磷酸甲羟戊 酸激酶的DNA片段(SEQ ID NO 73)插入到质粒pAM618的NdeI BamHI限制性酶切位点中。 得到的T7-PMK-FRT-Kan-FRT盒如上所述经历两轮PCR扩增，以生成与poxB位点同源的100 个核苷酸的侧翼序列。将PCR最终产物如上所述引入到大肠杆菌(Escherichia coli)菌 株 BlO2I 中，生成菌株 BlO62 (匪294 (DE3) (TlR) poxB : 7_ΡΜΚ)。通过将编码HMG-CoA还原酶(“HMGR”)的DNA片段整合到大肠杆菌(Escherichia coli)菌株B1021的IdhA位点中，生成宿主菌株B1273。为此，在用Klenow片段处理EcoRI 限制性酶切位点后，将编码金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)HMGR的DNA片段 (mva ；GenBank 登录号 BAOOOO17,区域2688925. · 2687648)插入到质粒 pAM618 的 EcoRI BamHI限制性酶切位点中。得到的T7-mVaA-FRT-Kan-FRT盒如上所述经历两轮PCR扩增，以 生成与IdhA位点同源的100个核苷酸的侧翼序列。将PCR最终产物如上所述引入到大肠杆 菌(Escherichia coli)菌株B1021 中，生成菌株B1273 (MM294 (DE3) (TlR) IdhA: T7_mvaA)。尽管已经提供了许多具体实施例，以上描述是为了说明，而不是限制本发明提供 的实施方案。基于本说明书，实施方案的许多变型对本领域技术人员将是显而易见的。实 施方案的范围因此不应当由以上描述确定，而应当由所附的权利要求及其等同的整个范围 确定。
权利要求
制备类异戊二烯化合物的方法，该方法包含(a)获得多个能够生成类异戊二烯化合物的宿主细胞，该宿主细胞包含染色体整合的异源核酸序列，该异源核酸序列编码MEV或DXP途径的酶；(b)在该宿主细胞使用乙醇作为碳源并生成类异戊二烯化合物的条件下，在培养基中培养该宿主细胞；和(c)从该培养基中回收类异戊二烯化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中被所述宿主细胞作为碳源消耗的乙醇是由所述宿主 细胞生成的。
3.如权利要求1所述的方法，其中被所述宿主细胞作为碳源消耗的乙醇是外源提供给 所述培养基的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基在至少4个小时中包含浓度等于或大于 约1克乙醇每升的乙醇。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞的乙醇消耗率等于或大于约0.2克到 约5克乙醇每克细胞干重每天。
6.如权利要求1所述的方法，其中在所述宿主细胞在生成类异戊二烯化合物期间不限 制氧气。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述培养条件包括比氧气摄入率低于10毫摩尔氧气 每克细胞干重每小时的一段时间。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述培养条件包括所述对宿主细胞进行磷酸盐限制 的一段时间。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是真菌。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯化合物以大于约10克每升培养基 的量生成。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯化合物以大于约50mg每克细胞干重的量生成。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯化合物的量在小于约72小时中生成。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯化合物的量在小于约48小时中生成。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯化合物的量在小于约24小时中生产。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯选自半萜、单萜、二萜、三萜、四萜 和多萜。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯是C5-C2tl类异戊二烯。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α -法呢烯、β -法呢烯、法呢醇、栊牛儿醇、香叶基栊牛儿醇、异戊二烯、芳樟醇、柠檬烯、月 桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、绿叶醇、β-菔烯、桧萜、Y-萜品烯、萜品油烯和巴伦西亚橘烯。
22.制备C5-C2tl类异戊二烯化合物的方法，该方法包含(a)获得多个能够生成该类异戊二烯化合物的宿主细胞；(b)在乙醇含量等于或大于约1克每升培养基的培养基中，培养该宿主细胞至少四小 时；禾口(c)每升培养基回收至少5克该类异戊二烯化合物。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基包含约1到约5克乙醇每升培养基。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基包含约1到约20克乙醇每升培养基。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基的乙醇含量大于约20克乙醇每升培养基。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述培养基中的至少一部分乙醇是由所述宿主细 胞生成的。
28.制备C5-C2tl类异戊二烯化合物的方法，该方法包含(a)获得多个能够生成该类异戊二烯化合物的宿主细胞；(b)通过向培养基提供碳源，培养所述酵母细胞以形成生物量；(c)将所述细胞维持一定条件下，由此该酵母细胞的乙醇消耗率等于或大于约0.01克 乙醇每克细胞干重每小时；和(d)每升培养基回收至少5克所述类异戊二烯化合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中至少一部分被消耗的乙醇是由所述宿主细胞生成的。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述乙醇消耗率在约0.01到约0. 20克乙醇每克 细胞干重每小时之间。
31.如权利要求28所述的方法，其中乙醇消耗率大于约0.1克乙醇每克细胞干重每小时。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述碳源是碳水化合物。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述碳源是碳水化合物和乙醇的混合物。
34.如权利要求28所述的方法，其中所述碳源是乙醇。
35.如权利要求28所述的方法，其中维持所述细胞的条件包括氧气限制至少四小时。
36.如权利要求28所述的方法，其中维持所述细胞的条件包括磷酸盐限制至少四小时。
37.如权利要求28所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
38.如权利要求28所述的方法，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
全文摘要
本发明提供了通过一种或多种生物合成途径高效制备类异戊二烯的方法。本发明还提供了用于进行所述方法的核酸、酶、表达载体、和遗传修饰的宿主细胞。本发明也提供了自遗传修饰的宿主细胞获得高产量类异戊二烯的发酵方法。
文档编号C12N15/52GK101868532SQ200880117160
公开日2010年10月20日 申请日期2008年9月19日 优先权日2007年9月20日
发明者R·里根廷, 雅各布·R·勒尼汉, 鹤田宽子 申请人:阿迈瑞斯生物技术公司