增强对有鞭毛的细菌的免疫反应的组合物和方法

专利名称：增强对有鞭毛的细菌的免疫反应的组合物和方法
增强对有鞭毛的细菌的免疫反应的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2007年10月30日提交的美国临时专利申请系列号60/983，803的 优先权，该临时专利的全部内容在此通过弓I用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明部分是在美国政府授予的USDA/NRI计划#2007-01953的资助下完成。美 国政府可对本发明享有某些权利。
引言
沙门氏菌(Salmonella)仍旧是全世界的人类食物传播感染的最常被报道的细菌 性诱因之一，并且流行病学证据表明家禽和家禽产品是人类感染的重要来源。在美国，每年 报道估计一百四十万例的人类沙门氏菌感染。这些案例中，血清型肠炎沙门氏菌(SE)和鼠 伤寒沙门氏菌(ST)是最常被分离的，虽然一些其它的血清型也被显示引起人类中的肠炎。
沙门氏菌不常导致家禽群体中的明显的临床疾病。但是，在具有一些沙门氏菌分 离体(isolate)的幼鸡中的感染导致孵化后头48小时内的2%发病率，和头5天内的达到 20%发病率。因此，增强家禽种群对沙门氏菌的抵抗力不仅将降低低水平疾病对性能的影 响，而且也还将降低对人类种群的重要的健康风险。发明内容
本发明公开了包含编码第一多肽的fliC多核苷酸序列和编码⑶IM多肽的第二 多核苷酸序列的疫苗。CD154多肽能够与CD40结合，其具有50个以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO 8的140-149位氨基酸或其同源物。
在另一方面，本发明公开了包含肠炎沙门氏菌(SalmonellaenteritidisUSA的 变异体的疫苗。沙门氏菌包含编码flic多肽的第一多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供通过施用细菌来增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反应 的方法。细菌包括编码flic多肽的第一多核苷酸序列和编码CD154多肽的第二多核苷酸 序列。⑶154多肽能够与⑶40结合，其具有50个以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO :8的 140-149位氨基酸或其同源物。细菌以增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反应的有效量进 行施用。
在另一方面，本发明提供通过施用肠炎沙门氏菌13A的变异体增强受试者对有鞭 毛的细菌的免疫反应的方法。沙门氏菌包括编码flic多肽的第一多核苷酸序列。沙门氏 菌以增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反应的有效量进行施用。
在另一方面，本发明提供通过施用细菌降低受试者中与有鞭毛的细菌感染相关的 发病率的方法。细菌包括编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和编码CD154多肽的第二多 核苷酸序列。⑶巧4多肽能够与⑶40结合，其具有50个以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO 8的140-149位氨基酸或其同源物。细菌以降低受试者的感染有鞭毛的细菌后的发病率的 有效量进行施用。
在另一方面，本发明提供通过施用肠炎沙门氏菌13A的变异体降低受试者中有鞭毛的细菌感染的发病率的方法。沙门氏菌包括编码fliC多肽的第一多核苷酸序列。沙门 氏菌以降低受试者的感染有鞭毛的细菌后的发病率的有效量进行施用。


图1描述在肠炎沙门氏菌中进行定点突变的方案。
图2描述重叠延伸PCR方法的设计方案，其用于产生插入至IamB多核苷酸的环区 9中的fliC和fliC-CD154插入物。
图3为柱形图，显示使用标明的细菌接种后3天，与最初肝/脾和盲肠扁桃体中的 接种物相比较，肠炎沙门氏菌的回收百分率。
图4为柱形图，显示使用标明的细菌接种后21天，与最初肝/脾和盲肠扁桃体中 的接种物相比较，肠炎沙门氏菌的回收百分率。
具体实施方式
针对沙门氏菌的疫苗接种是困难的，因为已经描述了 2000种以上的血清型并且 针对一种血清型的免疫一般不能赋予对不同血清型的免疫力。需要开发针对沙门氏菌的疫 苗以保护人类、家禽和其它家养动物。能够保护针对多种血清型的疫苗是最佳的。本发明 提供包含fliC的高度保守区的疫苗，flic为有鞭毛的沙门氏菌上发现的鞭毛丝蛋白。
重组DNA技术能使对许多细菌及病毒物种的操作相对容易。一些细菌及病毒有轻 微的致病性或无致病性，却能够产生强烈的免疫反应。这些细菌及病毒是激发对抗原的免 疫反应的理想疫苗载体。细菌或病毒疫苗载体能够模拟自然感染并产生强烈的和持久的免 疫性。生产和施用疫苗载体通常相对廉价。此外，这样的载体经常能携带不止一个抗原，而 且可以提供针对多种感染性试剂的保护。
在一方面，本发明提供包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和编码⑶IM多肽 (其能够与CD40结合)的第二多核苷酸序列的疫苗。在另一方面，本发明公开了疫苗载体 (例如细菌载体)的用途，用于疫苗接种和产生针对沙门氏菌和其它有鞭毛的致病性细菌 的免疫反应。沙门氏菌菌株是适当的疫苗载体，因为可以使细菌基因发生突变或使其毒性 减弱，以产生对被感染或免疫接种的受试者有低致病性或没有致病性但同时保持免疫原性 的细菌。
多数沙门氏菌分离体含有两个基因，其编码鞭毛(H)抗原，fliC和fljB，它们通过 相变异机制交替地表达。相1抗原由fliC编码而fljB编码相2抗原。已经鉴定fliC内的 保守区域在多种沙门氏菌血清型之间和在fliC与fljB之间具有几乎100%同源性。fliC 的保守区域在SEQID NO :1中描述并用于产生实施例中所描述的几个疫苗载体。用于疫苗 载体的其它可能的多肽在SEQ ID NO :2(来自大肠杆菌的fliC的相似区域)、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 12中公开。f IiC多肽的免疫原性片段也可用于产生疫苗。 另外，在这个fliC的保守区域和其它细菌(例如志贺杆菌(Shigella)和大肠杆菌)的鞭 毛序列之间具有广泛的同源性，以至于表达fliC的疫苗载体也普遍地增强对有鞭毛的细 菌的免疫反应。因此，沙门氏菌疫苗载体表面上的这些保护性表位的表达可诱导对生物的 多种血清型的保护性免疫力，并可允许对所有有鞭毛的细菌的免疫接种。
树突状细胞(DC)的参与对于有力的免疫反应的启动是必需的，因为其具有独特的能力激活原态T细胞，引起T细胞扩增并分化为效应细胞。DC的作用(DC是机体的几乎 所有组织中发现的抗原递呈细胞(APC))是捕获抗原，将抗原运送到相关的淋巴组织，然后 把抗原递呈给原态T细胞。被DC激活后，T细胞扩增、分化为效应细胞、离开次级免疫器官 并进入外周组织。激活的细胞毒性T细胞(CTL)能破坏病毒感染的细胞、肿瘤细胞或者甚 至被胞内寄生虫(例如，沙门氏菌)感染的APC，并被证明在抗病毒感染的保护中至关重要。
⑶40是TNF受体家族分子的成员并表达于多种细胞类型上，包括专职的抗原递呈 细胞(APC)，例如DC和B细胞。⑶40与其配体⑶154的相互作用是极其重要的，对于体液 和细胞免疫都有刺激作用。可以通过抗CD40抗体模拟在DC表面表达的CD40对DC的刺激。 然而在体内这是通过在激活的T细胞表面表达的CD40的天然配体(即CD154)相互作用发 生的。有趣的是，已经鉴定了⑶154的⑶40结合区。⑶154的⑶40结合区可在疫苗载体 (如沙门氏菌疫苗载体)的表面表达，并可导致对共递呈的肽序列增强的免疫反应。
沙门氏菌能够在宿主的胃肠道存活并能引起粘膜免疫反应。使用沙门氏菌载体的 口服疫苗产生强烈的粘膜免疫反应，而且对动物和人类施用都相对容易。然而，与其毒性更 强的对应体(counterpart)比较，许多目前的减毒的沙门氏菌疫苗菌株在产生强烈的保护 性免疫反应方面不那么有效。强毒性菌株提供强烈的免疫反应但也可引起接种的受试者的 显著的发病率。可以用作有效的粘膜(例如口服)接种的沙门氏菌菌株可提供易于对受试 者进行抵抗一种或多种病原性试剂(例如有鞭毛的细菌)的疫苗接种的载体。或者，限制 沙门氏菌疫苗载体引起的感染的方法也是有用的。本文提供了限制沙门氏菌疫苗载体引起 的感染的方法，该方法是通过向受试者施用沙门氏菌疫苗载体和施用包含编码fliC多肽 的第一多核苷酸序列的第二疫苗载体。第二疫苗载体的施用增强了对沙门氏菌的免疫反应 并限制了沙门氏菌疫苗载体引起的感染。第二疫苗载体可以在沙门氏菌疫苗载体之前、同 时或之后施用。
本发明描述了可用作疫苗载体的肠炎沙门氏菌菌株，以及使用这个菌株制成 的各种重组疫苗载体。特别地，本发明提供了能表达外源flic多肽的肠炎沙门氏菌 13A(SE13A)。此外，本发明公开了疫苗载体和通过施用疫苗载体增强受试者的免疫反应的 方法，所述疫苗载体包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和包含编码能够与CD40结合 的CDlM多肽或其同源物的第二多核苷酸序列。疫苗载体可以用于增强对沙门氏菌或另一 个有鞭毛的细菌(例如，大肠杆菌或志贺杆菌)的免疫反应或用于降低与有鞭毛的细菌感 染相关的发病率。
基于在鸡体内引起粘膜定殖(colonization)和粘膜下易位的不寻常的能力(使 相关抗原或表位在商业化鸡体内强烈地呈递)选择了沙门氏菌的野生型分离体，肠炎沙门 氏菌13A(SE13A)(于2006年9月13日保藏于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏号为 PTA-7871)。重要地是，该野生型沙门氏菌分离体在商业化鸡体内不引起临床可检测的疾病 或性能的丧失，这提示该野生型沙门氏菌对脊椎动物的致病潜在可能性低。
可通过将细菌在实验室或生产条件之外持续复制所必需的至少一个基因灭活而 使SE13A分离体进一步减毒。能用作疫苗载体的减毒或变异的沙门氏菌菌株如下所述。将 SE13A用于产生减毒的沙门氏菌菌株以开发疫苗并产生增强的免疫反应。SE13A对家禽具 有侵入性、无致病性，而且不造成可检测的发病率。与非侵入性细菌载体相比，这些特性导 致增强的免疫反应。通过使限制细菌传播能力的基因突变而使SE13A减毒可以提高疫苗的安全性。例如，具有aroA和/或htrA突变的SE13A菌株保留产生免疫反应的能力，但在宿 主中的复制受到限制。因此，减毒作用提高了疫苗载体的安全性而未使其免疫原性下降。
可以在多种其它沙门氏菌基因中进行突变，这些基因包括但不限于Cya、Crp、aSd、 cdt、phoP、phoQ、ompR、外膜蛋白、dam、htrA或其它应激相关基因、aro、pur和gua。如实施 例中所示，发现aroA和htrA突变可使SE13A减毒。aro基因是涉及莽草酸酯(shikimate) 生物合成途径或芳香酶途径的酶，而aro突变体是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸的营养缺陷型。htrA是编码降解异常蛋白的细胞周质蛋白酶的应激反应基因。htrA突 变体也是减毒的并表现出对过氧化氢敏感性增加。
实施例中描述的aroA和htrA突变是缺失突变，但能以各种方式产生突变。适合 地，突变为不能以单一步骤修复的非反向突变(non-reverting mutation) 0适合的突变包 括缺失、反转、插入及置换。疫苗载体可以包括一种以上突变，例如疫苗载体可以同时包含 aroA及htrA突变。产生这种突变的方法在本领域中广为人知。
SE13A或减毒的SE13A变异体可用作疫苗载体。可将编码fIiC多肽抗原和来自任 何数目的致病有机体的其它抗原的多核苷酸插入细菌中，并由该细菌表达以产生抗原性多 肽。可将多核苷酸插入细菌的染色体或在质粒上或其它染色体外DNA上编码。适合地，可 将编码fliC抗原的多核苷酸插入被表达的细菌的多核苷酸中。适合地，细菌的多核苷酸编 码跨膜蛋白，将编码fliC抗原的多核苷酸插入至细菌多核苷酸序列中，以允许fliC抗原在 细菌表面表达。例如，以阅读框(frame)的形式将编码fIiC的多核苷酸插入至细菌的编码 跨膜蛋白外环区的多核苷酸区中，以使细菌多核苷酸序列保留在阅读框中。参看实施例1。
此外，可将编码fliC抗原的第一多核苷酸插入编码分泌多肽的多核苷酸中。本领 域的技术人员将理解，编码flic抗原的多核苷酸可以插入细菌的众多的多核苷酸中，以使 flic抗原表达并呈递至经过细菌疫苗载体治疗的受试者的免疫细胞。在实施例中，将编码 fliC抗原的多核苷酸插入SE13A的IamB基因的环区9中。可以包括单一拷贝或一个以上 拷贝的编码fliC抗原的多核苷酸。在实施例中，描述了包含插入至IamB的环区9中的单 个拷贝的fliC抗原的细菌疫苗载体。此外，可以将表位的拷贝插入细菌疫苗载体中的一个 以上的位置。多核苷酸的拷贝可以连接在一起或通过连接子分开。适合的连接子是本领域 技术人员已知的，包括但不限于重复的氨基酸，例如1-10丝氨酸残基。
如以下更详细描述的那样，疫苗载体可以包括CD154多肽，CDlM多肽能够在受试 者内与CD40结合并刺激受试者对疫苗载体及其相关抗原产生反应。如上所述，可将这些多 核苷酸插入疫苗载体的染色体中或保持在染色体外。本领域的技术人员将理解，这些多核 苷酸可以插入到多种内源多核苷酸中并在疫苗载体的不同部分(例如细胞壁)表达或被分 泌。编码能够增强对外源抗原的免疫反应的CD154多肽的多核苷酸也可以编码外源抗原。 可将编码CDlM多肽的多核苷酸与编码fliC抗原的多核苷酸连接起来，从而在疫苗载体 中CDlM多肽和fIiC抗原存在于同一多核苷酸上。在实施例中，编码能够与CD40结合的 ⑶154多肽的多核苷酸也编码fliC抗原。参见所附序列表中SEQ ID NO 1，2，9，10和11。 在实施例中，将fliC抗原的多核苷酸和编码CDlM多肽的多核苷酸都插入IamB基因的环 区9中。本领域技术人员将理解，也可以使用编码其它跨膜蛋白的和IamB基因的其它环区 的细菌多核苷酸。
SE13A细菌包括编码fliC多肽(该多肽是与沙门氏菌天然相关的全长fliC多肽的一部分)的外源多核苷酸。适合地，可将编码部分flic多肽或整个flic多肽的多核苷 酸插入疫苗载体。在实施例中，将7个氨基酸的多肽(SEQ ID NO 1)导入SE13A。适合地， 插入至疫苗载体的fliC多肽部分是免疫原性片段。免疫原性片段是能够激发细胞或体液 免疫反应的肽或多肽。适合地，fliC的免疫原性片段可以是全长蛋白质序列的6个或更多 个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸，或者20个或更多个氨基酸。
其它适合包含在fliC疫苗载体中的表位包括但不限于，编码其它细菌多肽的多 核苷酸。本领域的技术人员将理解，多种序列可以与任何其它抗原结合使用，而且也可以与 编码免疫刺激肽(如CD154多肽)的多肽联合使用。
如以上所讨论，疫苗载体中可以包括编码能够增强对抗原的免疫反应的CD154多 肽的多核苷酸。适合地，CDlM多肽长度为50个氨基酸以下，更适合地是40个以下、是30 个以下或是20个以下氨基酸的长度。多肽可介于10至15个氨基酸之间、10至20个氨基 酸之间或10至25个氨基酸长度之间。CDlM序列和CD40结合区在各种物种间不是高度保 守的。鸡和人的CDM4氨基酸序列分别见于SEQ ID NO :9及SEQ ID NO :8。
已经确定了一些物种的⑶巧4的⑶40结合区，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，分别见于 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQID NO 6 禾口 SEQ ID NO -J0 虽然不同物种之 间的CD40结合区的序列有可变性，但人CDlM多肽能够增强鸡的免疫反应。因此，人们可 以使用物种特异性CDlM多肽或异源CD154多肽来实施本发明。
在实施例中制备了几种SE13A重组细菌。在每种含有同时编码fliC和⑶巧4肽 的多核苷酸的SE13A菌株中，f IiC多肽和⑶巧4多肽被编码在同一多核苷酸上，而且它们彼 此处于阅读框内并与其所插入至的沙门氏菌IamB多核苷酸处于阅读框内。在替代性具体 实施方式中，CDM4多肽和fliC多肽可被不同的多核苷酸编码。SE13A的aroA htrAfliC 包含aroA和htrA的缺失并同时编码fliC表位(SEQ ID NO 1)和可选地插入至IamB的环 区 9 的 CD154 多肽(SEQ ID NO 3)。
本发明还提供包括减毒沙门氏菌菌株和药学上可接受的载体的组合物。药学上可 接受的载体是任何适合体内施用的载体。药学上可接受的适合用于组合物中载体的例子包 括但不限于，水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的附加成份可以适合地包括， 例如，赋形剂，如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和滑润剂。药学上可接受的载体或稀释剂 的例子包括稳定剂，如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、 蛋白(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白试剂(如牛血清或脱脂乳)和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲 液)。特别是在组合物中添加这样的稳定剂时，该组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明还提供通过施用包含fliC多肽和能够与⑶40结合并激活⑶40的⑶154 多肽的疫苗载体而增强受试者免疫反应的方法。向受试者施用有效量的包括编码能够与 CD40结合的CDlM多肽的多核苷酸的疫苗载体以增强受试者对疫苗的免疫反应。适合地， 疫苗载体包含编码包括人类CDlM多肽(SEQ ID NO 8)的140-149位氨基酸的多肽或其同 源物的多核苷酸。如上所述和如实施例中所证明，CD154的CD40结合区在物种间不是保守 的，然而异源CDlM能够增强免疫反应(即在鸡中使用人类序列)。因此，源自一个物种的 140-149位氨基酸的同源物可用于刺激不同物种中的免疫反应。
在本文中鉴定出几种适合的多肽。适合地，多核苷酸编码来自于与受试者同一物 种的⑶IM多肽。适合地，将编码SEQ ID NO :3的多肽的多核苷酸用于人类受试者，将编码SEQ ID NO :4的多肽的多核苷酸用于鸡，将编码SEQ ID NO :5的多肽的多核苷酸用于鸭，将 编码SEQID NO :6的多肽的多核苷酸用于小鼠，和将编码SEQ ID NO :7的多肽的多核苷酸用 于牛。在实施例中，在鸡疫苗载体中使用人类CDlM多肽(SEQ ID NO :3)，而且证明可增强 对外源抗原的免疫反应。因此，CDlM多肽和受试者的其它异源组合可用于本发明的方法。 CD154多肽可用于增强受试者对任何外源抗原或存在于疫苗载体中的除fliC多肽之外的 抗原性多肽的免疫反应。本领域的技术人员将理解，CD154多肽可用于增强对存在于疫苗 载体中的一种以上抗原性多肽的免疫反应。
来自⑶154的多肽至少部分通过与其受体⑶40的结合而刺激免疫反应。在实施 例中使用了与CDlM多肽同源的多肽，其在受试者免疫细胞上表达并且能够与巨噬细胞和 其它抗原递呈细胞上的CD40受体结合。这个配基-受体复合物的结合刺激巨噬细胞(和 巨噬细胞谱系细胞，例如树突状细胞)以增强吞噬作用和抗原呈递，并同时增加已知能够 激活其它局部免疫细胞(如B淋巴细胞)的细胞因子的分泌。因此，CDlM肽相关分子是 免疫反应及扩大的抗体产生的优选靶标。
本方法可用的潜在疫苗载体包括但不限于沙门氏菌属(肠炎沙门氏菌)、志贺 菌属Shigella)、埃希杆菌属(Escherichia)(大肠杆菌)、耶尔森菌属Yersinia)、博 德特氏菌属(Bordetella)、乳球菌属(Lactococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus) > ff ^ 属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)(霍乱弧菌)、李斯特菌属 (Listeria)、腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxvirus)、疱疫病毒(herpesvirus)、甲病毒 (alphavirus)及腺相关病毒。
此外，本发明公开了增强对有鞭毛的细菌的免疫反应的方法和降低与随后 感染有鞭毛的细菌相关的发病率的方法。简言之，该方法包含向受试者施用有效量 的包含编码fliC多肽的多核苷酸序列的疫苗载体。fliC多肽包括SEQ ID NO 1-2 和10-12。可以以本领域的技术人员熟悉的多种方式将fliC多肽插入疫苗载体，包 括但不限于在BMCBiotechnol. 2007 Sept, 17:7(1) :59中描述的无痕定点突变系统 (scarlesssite-directed mutation system)，(Scarless and Site-directed Mutagenesis)，其全部内容通过引用并入本文。也可以工 程化疫苗载体使其表达fliC多肽和以上讨论的能够增强免疫反应的多核苷酸(如SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9)。特别的，疫苗载体可以表达能够结合⑶40的OTlM的多肽，以增强 受试者对fliC多肽的免疫反应。可选地，疫苗载体是细菌，例如肠炎沙门氏菌。
将施用的疫苗载体的有用剂量将根据受试者的年龄、体重和物种、施用的模式及 途径、以及寻找对其产生免疫反应的病原体类型而变化。可以任何足以激发免疫反应的剂 量施用组合物。对于细菌疫苗而言，预计IO3至101°个细菌、IO4至IO9个细菌、或IO5至IO7 个细菌的剂量范围是适合的。组合物可以只施用一次，或可以施用两次或更多次以增强免 疫反应。例如，组合物可以施用两次或更多次，每次隔一周、隔两周或隔三周或隔更多周。在 施用之前使细菌适合地存活，但在一些具体实施方式
中，在施用之前将细菌杀死。在一些具 体实施方式中，细菌能够在受试者体内复制，而在其它具体实施方式
中，细菌不能在受试者 体内复制。
对于向动物或人类的施用而言，可以以多种手段施用组合物，这些手段包括但不 限于鼻内、粘膜、通过喷雾、皮内、非肠道、皮下、口服、通过气雾或肌内。点眼施用或添加到饮水或食物中也是适合的。对于鸡而言，可以将组合物施用到卵中。
本发明的一些实施例提供增强受试者免疫反应的方法。适合的受试者包括但不限 于脊椎动物，适合的哺乳动物、适合的人类和鸟类，适合的家禽如鸡。也可以使用其它感染 的动物模型。增强免疫反应包括但不限于，诱导受试者的免疫系统介导的治疗性或预防性 效应。特别地，增强免疫反应可包括抗体的产生增加、抗体重链的类别转换增强、抗原呈递 细胞的成熟、辅助性T细胞的刺激、溶细胞性T细胞的刺激或T及B细胞记忆的诱导。
可预计将来自相同或不同病原体的几个表位或抗原在单一疫苗载体中组合施用， 以产生针对多个抗原的增强的免疫反应。重组疫苗载体可以编码来自多种病原体微生物、 病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表达多种抗原的疫苗载体具有同时诱导抵抗两种或 更多种疾病的免疫力的优点。例如，活的减毒细菌(如肠炎沙门氏菌13A)为激发抵抗多种 抗原的免疫反应提供适合的疫苗载体。
可以使用编码抗原的外源多核苷酸构建细菌疫苗，所述多核苷酸可被插入细菌基 因组中的任何非必需位点，或可选地使用本领域中广为人知的方法质粒上携带所述多核苷 酸。一个适合的插入多核苷酸的位点是在跨膜蛋白的外部部分内或将该多核苷酸与靶向用 于分泌途径的外源多核苷酸的序列偶联。一个用于插入多核苷酸的适合的跨膜蛋白的例子 是IamB基因。在实施例中，fliC和⑶IM多核苷酸插入IamB序列的环区9中。
外源多核苷酸包括但不限于，编码选自病原体微生物或病毒的抗原的多核苷酸， 并包括疫苗载体的多核苷酸，该多核苷酸以产生有效免疫反应的方式表达。这样的多核苷 酸可以来自病原性病毒，如流感病毒(例如M2e、红细胞凝集素、或神经氨酸酶)、疱疹病毒 (例如编码疱疹病毒的结构蛋白的基因)、逆转录病毒(例如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副 粘液病毒、冠状病毒等等。外源多核苷酸也可以获自病原性细菌，例如编码细菌蛋白(如毒 素)和外膜蛋白的基因。此外，来自寄生虫的外源多核苷酸是用于载体疫苗的理想候选物。
疫苗载体中也可以包括编码参与激发免疫系统的多肽的多核苷酸，如活的减毒的 沙门氏菌属疫苗。多核苷酸可以编码已知具有刺激效应的免疫系统分子，如白细胞介素、肿 瘤坏死因子或干扰素，或是另一种参与免疫调节的多核苷酸。疫苗载体也可包括编码已知 刺激免疫反应的肽(例如本文描述的CDlM多肽)的多核苷酸。
以下实施例只是示例性的，而不是限制本发明或所附权利要求的范围。
实施例
实施例1. fliC和fliC/CDIM插入物的构建
菌株和培养条件
除非另有说明，否则首先将所有质粒保持在T0P10大肠杆菌细胞(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)中。使用肠炎沙门氏菌13A来引入突变。肠炎沙门氏菌菌株13A是从 USDA/APHIS/NVSL获得的田野分离体，并以保藏号PTA-7871保藏于ATCC。携带质粒pKD46 的细菌在30°C生长。其它细菌在37°C生长。质粒消除在37°C实施。
将Luria-Bertani(LB)培养基用于细胞的常规生长，SOC培养基(Invitrogen， Carlsbad,CA,USA)用于电穿孔之后的表型表达。在适当时，将以下抗生素添加到培养基中 氨比西林(Amp) 100 μ g/ml、卡那霉素(Km) 50 μ g/ml 和氯霉素(Cm) 25 μ g/ml。
质粒
以前描述过质粒 pKD46、pKD13 和 pBCUcel (Datsenko 和 Wanner，PNAS 2000，97 :6640-6645 和 Kang 等人，J Bacteriol 2004，186 :4921-4930, 二者通过引用全文并入 本文)。质粒PKD46编码Red重组酶酶类，其介导引入的线性DNA与染色体DNA之间的同 源重组。这个质粒还包含氨比西林抗性基因而且对温度敏感，所以其需要30°C的温度以在 细胞中维持生长。质粒PKD13用作重叠PCR反应中Km抗性(Knf)基因的扩增模板。质粒 pBC-I-Scel (在37°C维持在细胞中)产生HceI酶，I-SceI酶剪切以下18个碱基对的稀 有识别序列5' -TAGGGATAACAGGGTAAT-3‘ (SEQ ID NO 13)。质粒 pBCHcel 还包含氯 霉素抗性(Cnf)基因。
PCR
在表1中列出了用于PCR的所有引物。通常，PCR的反应条件如下在总体积 50 μ L中含有大约0. Iyg纯化的基因组、质粒或PCR产生的DNA Oliagen，Valencia, CA, USA), 1 X 克隆的 Pfu 聚合酶缓冲液、5U Pfu 聚合酶(Stratagene La Jolla, CA, USA)、ImM dNTP(GEHealthcare Bio-Sciences Corp. ,Piscataway,NJ)和每个引物 1·2μΜ。使用 DNA 引擎热循环仪(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在以下扩增条件下进行扩增94°C，2分钟； 94°C持续30秒、58°C持续60秒、72°C持续90秒(每11Λ)，共进行30个循环；和72°C持续 10分钟以进行最后的延伸。每个PCR产物经过凝胶纯化Oliagen，Valencia, CA, USA)，并 以25 μ L的EB缓冲液洗脱以制备用于重叠延伸PCR的模板，或者以50 μ L的EB缓冲液洗 脱，经乙醇沉淀，并重悬于5μ L的ddH20中，以使其通过电穿孔进入肠炎沙门氏菌中。
表1引物序列
权利要求
1.一种包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和编码能与⑶40结合的⑶154多肽 的第二多核苷酸序列的疫苗，其中⑶巧4多肽具有50个以下的氨基酸并包含SEQ ID NO 8 的140-149位氨基酸或其同源物。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中fliC多肽包括SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12、SEQID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的免 疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中⑶154多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO5,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7。
4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗，其中疫苗是细菌疫苗。
5.根据权利要求4所述的疫苗，细菌在其表面上包含fIiC多肽和CDlM多肽中的至少一个。
6.根据权利要求4或5所述的疫苗，其中细菌选自沙门氏菌属、埃希氏菌属、杆菌属或 乳酸菌属。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其中细菌是肠炎沙门氏菌。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其中细菌是选自ATCC保藏号为PTA-7871、ATCC保藏 号为PTA-7872或ATCC保藏号为PTA-7873的肠炎沙门氏菌13A。
9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸中至少 一个插入到编码跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
11.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中疫苗包含一个以上拷贝的第一多核 苷酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中疫苗包含一个以上拷贝的第二多核 苷酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列与第二多核苷酸 序列按照处于阅读框内的方式连接。
14.一种疫苗，其包含肠炎沙门氏菌13A的变异体，其中沙门氏菌包含编码f IiC多肽的 外源的第一多核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的疫苗，其中fliC多肽包括SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的 免疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
16.根据权利要求14或15所述的疫苗，其中疫苗包含一个以上拷贝的第一多核苷酸序列。
17.根据权利要求14-16任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列插入到编码跨膜 蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
18.根据权利要求17所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
19.根据权利要求14-18任一项所述的疫苗，还包含编码能与⑶40结合的⑶巧4多肽 的第二多核苷酸序列，其中⑶巧4多肽具有50以下氨基酸并包含SEQ ID NO 8的140-149氨基酸或其同源物。
20.根据权利要求19所述的疫苗，其中CDlM多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
21.根据权利要求19-20任一项所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列与第二多核苷酸 序列按照处于阅读框内的方式连接。
22.根据权利要求中19-21任一项所述的疫苗，其中第二多核苷酸序列插入到编码跨 膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
23.根据权利要求22所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
24.根据权利要求19-23任一项所述的疫苗，其中疫苗包含一个以上拷贝的第二多核 苷酸序列。
25.一种增强受试者中对有鞭毛的细菌的免疫反应的方法，包括向受试者施用疫苗载 体，所述疫苗载体包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和编码能f与CD40结合的CDlM 多肽的第二多核苷酸序列，其中⑶1 多肽具有50个以下氨基酸并包含SEQ ID N0:8的 140-149氨基酸或其同源物，并且所述的疫苗载体以有效增强受试者对有鞭毛的细菌的免 疫反应的量施用。
26.根据权利要求25所述的方法，其中fIiC多肽包括SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的 免疫原性片段、SEQ IDN0:10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
27.根据权利要求25或沈所述的方法，其中CDlM多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
28.根据权利要求25-27任一项所述的方法，其中疫苗载体是细菌疫苗载体。
29.根据权利要求观所述的方法，细菌在其表面上包含fIiC多肽和⑶巧4多肽中的至 少一个。
30.根据权利要求观或四所述的方法，其中细菌选自沙门氏菌属、埃希氏菌属、杆菌属 或乳酸菌属。
31.根据权利要求30所述的方法，其中细菌是肠炎沙门氏菌。
32.根据权利要求31所述的方法，其中细菌是选自ATCC保藏号为PTA-7871、ATCC保 藏号为PTA-7872或ATCC保藏号为PTA-7873的肠炎沙门氏菌13A。
33.根据权利要求25-32任一项所述的方法，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸中至 少一个插入到编码跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
34.根据权利要求33所述的方法，其中跨膜蛋白是lamB。
35.根据权利要求25-34任一项所述的方法，其中疫苗包含一个以上拷贝的第一多核 苷酸序列。
36.根据权利要求25-35任一项所述的方法，其中疫苗包含一个以上拷贝的第二多核 苷酸序列。
37.根据权利要求25-36任一项所述的方法，其中第一多核苷酸序列与第二多核苷酸 序列按照处于阅读框内的方式连接。
38.根据权利要求25-37任一项所述的方法，其中细菌通过选自口服、鼻内、非肠道或卵内的方法施用。
39.根据权利要求25-38任一项所述的方法，其中增强的免疫反应包括增强的抗体反应。
40.根据权利要求25-39任一项所述的方法，其中增强的免疫反应包括增强的T细胞反应。
41.根据权利要求25-40任一项所述的方法，其中受试者是家禽类物种成员。
42.根据权利要求41所述的方法，其中家禽类物种是鸡。
43.根据权利要求25-40任一项所述的方法，其中受试者是哺乳动物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中受试者是人类。
45.根据权利要求25-44任一项所述的方法，其中向受试者施用大约IO4至约IO9个细菌。
46.根据权利要求25-45任一项所述的方法，其中向受试者施用大约IO5至约IO7个细菌。
47.根据权利要求25-46任一项所述的方法，其中在给受试者施用前杀死细菌。
48.根据权利要求25-46任一项所述的方法，其中细菌在受试者体内不能复制。
49.一种增强受试者中对有鞭毛的细菌的免疫反应的方法，包括向受试者施用肠炎沙 门氏菌13A的变异体，所述的变异体包含编码fliC多肽的外源的第一多核苷酸序列，变异 体以有效增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反应的量施用。
50.根据权利要求49所述的方法，其中fIiC多肽包括SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12、SEQID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的免 疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
51.根据权利要求49或50任一项所述的方法，其中疫苗包含一个以上拷贝的第一多核 苷酸序列。
52.根据权利要求49-51任一项所述的方法，其中第一多核苷酸序列插入到编码跨膜 蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
53.根据权利要求52所述的方法，其中跨膜蛋白是lamB。
54.根据权利要求49-53任一项所述的方法，还包含编码能与⑶40结合的OTlM多 肽的第二多核苷酸序列，其中⑶154多肽具有50个以下氨基酸并包含SEQ ID NO :8的 140-149氨基酸或其同源物。
55.根据权利要求M所述的方法，其中CDlM多肽包括SEQIDN0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
56.根据权利要求M-55任一项所述的方法，其中第一多核苷酸序列与第二多核苷酸 序列按照处于阅读框内的方式连接。
57.根据权利要求49-56任一项所述的方法，其中细菌通过选自口服、鼻内、非肠道或 卵内的方法施用。
58.根据权利要求49-57任一项所述的方法，其中增强的免疫反应包括增强的抗体反应。
59.根据权利要求49-58任一项所述的方法，其中增强的免疫反应包括增强的T细胞反应。
60.根据权利要求49-59任一项所述的方法，其中受试者是家禽类物种成员。
61.根据权利要求60所述的方法，其中家禽类物种是鸡。
62.根据权利要求49-59任一项所述的方法，其中受试者是哺乳动物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中受试者是人类。
64.根据权利要求49-63任一项所述的方法，其中向受试者施用大约IO4至约IO9个细菌。
65.根据权利要求49-64任一项所述的方法，其中在给受试者施用前杀死细菌。
66.根据权利要求49-64任意项所述的方法，其中细菌不能在受试者体内复制。
67.一种降低受试者中与有鞭毛的细菌感染相关的发病率的方法，包括向受试者施用 疫苗载体，所述疫苗载体包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列和编码能与CD40结合的 ⑶154多肽的第二多核苷酸序列，⑶巧4多肽具有50个以下氨基酸并包含SEQ ID NO 8的 140-149氨基酸或其同源物，并且所述的细菌以有效增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反 应的量施用。
68.一种降低受试者中与有鞭毛的细菌感染相关的发病率的方法，包括向受试者施用 肠炎沙门氏菌13A的变异体，所述的变异体包含编码f IiC多肽的外源的第一多核苷酸序 列，变异体以有效增强受试者对有鞭毛的细菌的免疫反应的量施用。
69.一种限制沙门氏菌疫苗载体引起的感染的方法，包括向受试者施用沙门氏菌疫苗 载体并且施用包含编码fliC多肽的第一多核苷酸序列的第二疫苗载体，其中第二疫苗载 体增强对沙门氏菌的免疫反应并限制沙门氏菌疫苗载体引起的感染。
全文摘要
本发明提供了包含fliC和CD154多肽的疫苗及包含fliC多肽的肠炎沙门氏菌疫苗载体。本发明还提供了增强针对有鞭毛的细菌的免疫反应的方法以及降低与有鞭毛的细菌感染相关的发病率的方法。
文档编号C12Q1/68GK102037135SQ200880116911
公开日2011年4月27日 申请日期2008年10月30日 优先权日2007年10月30日
发明者B·哈格斯, K·乔菜, L·博格曼, M·考克斯, S·莱顿, W·博特吉, Y·M·权 申请人:德克萨斯A&M大学体系, 阿肯色大学评议会