衍生自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇的制作方法

专利名称：衍生自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的衍生自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇(CMLC)，和涉及此类心肌细 胞样细胞簇在例如药物发现以及开发、毒性测试、细胞治疗和医疗上的潜在用途。所述簇包 含表达内胚层、中胚层以及心脏标记的细胞。本发明还涉及所述簇的制备方法、用于治疗和 毒性测试的包括一种或多种CMLC的组合物。在将所述组合物在至少-80°C的温度下贮存至 少2年后所述组合物是稳定的，即所述簇的特性和活力在该贮存阶段不实质上改变。
背景技术：
认为成熟心肌细胞为终末分化细胞，并且因而它们不具有或具有非常低的增殖能 力。人类心肌细胞可以从心脏活组织检查分离，但是该过程是复杂的并且难以获得活细胞 制品。此外，人类心脏组织的接近非常受限，并且因此不可能分离大量细胞。容易接近具有 人类心肌细胞表型的细胞对于开发用于心脏病的细胞治疗干预是关键的。此外，由于缺少 供体材料以及细胞分离的某些成问题的过程，对于在临床前药物发现期间的体外测试当前 不能获得人类原代心肌细胞。多潜能人类干细胞的群体可以从囊胚的内细胞团分离，并且这些细胞具有不确定 的、未分化的体外增殖的能力(Thomson et al. , 1998 ；Reubinoff et al. ,2000 ；Helns et al.，2004)。人类囊胚衍生的干(hBS)细胞的分化可以在体外自发性地出现，特别是对于 未分化细胞在次优培养条件期间(Thomson et al.，1998 ；Reubinoff et al.，2000)，此外， hBS细胞可以以沿着形成各种特化细胞类型的特定途径的定向方式诱导(coaxed)分化，所 述特化细胞类型包括心肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、胰岛素产生β细胞和造血细胞(综 述于Keller，Genes Dev2005)。然而，关于如何控制和操作hBS细胞分化以产生特定细胞 类型的专有群体目前已知相对少。为了从hBS细胞衍生心肌细胞，原则上已经报道两种不同的方法。第一种为当细 胞在悬浮液中培养时通过hBS细胞的分化开始并且形成拟胚体(EBs) (Itskovitz-Eldor et al 2000,Kehat et al 2001)。在这些混合的细胞群体中，可以观察到具有心肌细胞功能性 质的收缩区域。第二种方法基于hBS细胞与END-2细胞(内脏内胚层样细胞系)的共培养， 其导致也显示心肌细胞特征的细胞的搏动簇(beating cluster)的形成(Mummery et al 2003,Passier et al 2005)。所述策略的其它变化包括强迫聚集(Burridge et al 2007) 和悬滴方法(Yoon et al 2006)。基于使用的策略的变化和hBS细胞分化成心肌细胞的效 率，似乎hBS细胞系相当不同地表现，暗示使用的实际hBS细胞系可能影响最后的结果。这 样，各细胞系可能需要用于诱导心脏发生的特定分化策略。近几年期间，许多论文已经以各种方式描述hBS细胞衍生的心肌细胞的基本特 性。在这些报道中，细胞分析已经基于心肌细胞的分子标记的表达、结构建筑和功能性(综 述于Ameen et al 2007 Crit RevOncol Hematol)。hBS细胞衍生心肌细胞的形态学和 超结构与成熟心肌细胞共有相似性，尽管在干细胞衍生群体中肌原纤维和肌原纤维节表 示未成熟表型(Kehat et al 2001，Snir et al 2003, Norstrom et al2006, Yoon et
10al 2006)。在分子水平上，由心肌细胞表达的几种标记还通过hBS细胞衍生心肌细胞表 达，包括转录因子，结构蛋白、激素、离子通道和紧密连接蛋白(Kehat et al 2001, Xu et al 2002，Mummeryet al 2003，He et al 2003，Passier et al 2005，Norstrom et al 2006，Yoon et al 2006)。总之，hBS细胞衍生心肌细胞的分子和结构性质暗示这些细胞与它们的成体对应 物(counterpart)共有相似性。然而，更重要的是所述细胞的功能性质，并且不同的药理学 和电生理学方法已经用于检查这些性质。衍生自hBS细胞的心肌细胞的一个主要优点在于 它们可以以培养的形式维持延长的时间而不丧失它们的自发性收缩能力。这允许相同细胞 制品的重复的非入侵性检查。几种研究已经证明hBS细胞衍生心肌细胞应答于α/β-肾 上腺素能_和毒蕈碱刺激，暗示所述细胞表达特定表面膜受体，所述表面膜受体与激活离 子通道、膜转运蛋白和肌丝蛋白的信号传导途径偶联(Kehat et al 2001，Xu et al 2002， Xue et al2005,Norstromet al 2006)。此外，指示结节-、心房-和心室-样起源的 动作电位已经使用细胞内电生理学测定在hBS细胞衍生心肌细胞中鉴定(Xu et al 2002， Mummery et al 2003,He et al 2003)。总之，这些结果表示体外发育的干细胞衍生心肌细 胞具有这样的基本功能性，其使它们对于进一步在药物发现上的应用方面评价而言有吸引 力。作为组织样结构，来自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇特别的具有用于几种这些体 外应用的极大潜能，使它们构建用于在心肌细胞的功能属性例如作用潜能和传导的测定的 平台。此外，发展的簇可以用作体外模型以研究在人类心脏发生的早期事件。此外，基于组 织相似性，所述簇可以最佳地体内用于在受伤或疾病之后的心脏功能的修复。本发明提出 独特的衍生自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇，以用于上述的应用。

发明内容
本发明涉及新的心肌细胞样细胞簇(CMLC)和从hBS细胞制备它们的方法。本发 明的CMLC特别良好地适合于在药物发现和毒性测试中使用。根据本发明的簇包括心肌细胞样细胞，其中所述簇具有i)收缩细胞(contracting cells),ii)电连接的细胞，和表达iii)心脏标记，包括Nkx. 2. 5、肌钙蛋白和肌球蛋白，iv)功能性肾上腺素能受体的标记，ν)功能性毒蕈碱受体的标记，vi)功能性离子通道的标记，包括hERG，Na+, Ca2+和K+通道，vii)选自以下的一种或多种内胚层标记AFP，TF，AP0A2，AHSG，SERPINA1，APOAl， AP0C3, TTR, APOBjP RBP4。上述细胞之间的电连接可以通过间隙连接。在特定实施方式中，所述簇不表达未分化细胞的一种或多种以下标记如在实施 例 13 中描述的 0CT-3/4，SSEA-4, TRA-1-60。重要的是所述簇包含对药理学刺激应答的细胞，所述药理学刺激例如β -肾上腺
11素能刺激(异丙基肾上腺素，肾上腺素)、α _肾上腺素能刺激(去氧肾上腺素，也可称为 “苯肾上腺素”)、毒蕈碱刺激(卡巴胆碱、乙酰胆碱、阿托品(atropine))、钙通道的阻断(维 拉帕米)、hERG通道的阻断(E4031)和起搏通道(funny channels)的抑制。根据本发明的簇包括心肌细胞样细胞，并且所述簇包括上调并且具有以下特征的
基因i) 500以上的表达值，ii)在心肌细胞样细胞簇和未分化hBS细胞(FCqk)之间的基因表达上10倍以上 的倍数变化。在本文的实施例中已经证明了用于确定上述值的合适方法。本发明人已经发现适合例如在医学应用、药物筛选和心脏毒性研究中使用的心肌 细胞样细胞可以以簇的形式分离，其相对易于以可再现的方式制备并且无需进一步分化成 心肌细胞。除了心脏标记之外，所述簇还可以包括标记(所述标记例如内胚层谱系标记)， 表达一种或多种通常用于心脏毒性测试的离子通道，和表达转录因子。因此，本发明提供获得合适的心肌细胞样细胞产品的相对简单的手段以用于医学 用途以及用于药物筛选和测试，而无需纯化和完全分化成成熟的心肌细胞。此外，本发明提供以对于终端用户而言容易使用的形式呈递所述CMLC的组合物， 该组合物通过使CMLC在水性介质中悬浮来制备，所述水性介质显著地包含在所述簇的冷 冻/玻璃化、贮存、解冻和使用期间确保所述CMLC的稳定性的试剂。因此，此类水性介质的 性质必须考虑所有这四个不同过程来选择，以从已经制备和直到终端用户的使用的簇获得 适合处理所述簇的专用介质(sole medium)。该产品以新鲜和冷冻形式存在。本发明的详细描述如本文所用，术语"囊胚衍生干细胞"表示BS细胞，人类形式命名为"hBS细 胞"，在文献中该细胞常常被称为胚胎干细胞，并且更具体地为人类胚胎干细胞。因此在本 发明中所用的多能干细胞可以为如在例如WO 03/055992和WO 2007/042225中所公开的从 囊胚制备的胚胎干细胞，或为商购可得的hBS细胞或细胞系。然而，还应该进一步考虑任何 人类多能干细胞可以用于本发明，包括分化的成体细胞，其可以通过例如将成体细胞用特 定的转录因子处理重新编程为多能细胞，所述转录因子例如Junying Yu, et al.，2007所公 开的的 0CT4，S0X2, NANOGJP LIN28。如本文所用术语〃 DMSO〃是指二甲(基)亚砜。如本文所用术语"心肌细胞样细胞"是指与成熟心肌细胞共有特征的细胞。心肌 细胞样细胞进一步通过形态学特征以及通过特定的标记特征来定义。如本文所用术语"心肌细胞样细胞簇"(CMLC)是指包括至少两种或两个相互 连接的心肌细胞样细胞的组，并且其还包括其它细胞类型。簇包含搏动细胞(beating cells)ο如本文所用术语"结节样细胞(nodal-样细胞)“是指具有以下动作电位特征的 细胞膜静息电位(MRP):_40 至 _60mV，持续时间80-130ms，和明显的4期去极化。
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如本文所用术语"心房样细胞"是指具有下动作电位特征的细胞膜静息电位(MRP):_50 至-8OmVjn持续时间<150ms。如本文所用术语"心室样细胞"是指具有下动作电位特征的细胞膜静息电位(MRP):_50 至 _80mV，持续时间> 150ms，和明显的平台期。在本上下文中，术语"表达"用于基因和/或蛋白质表达，究竟什么必须在上下 文中相关。在本申请中，术语"冷冻保存"表示生物材料在极低温下的保存。在本上下文中，术语"混合的分化hBS细胞"用于自发性分化的hBS细胞的群体， 其中存在来自所有三个胚层(中胚层、内胚层和外胚层)的细胞。该样品用作对照材料以将 在许多种类的分化细胞中上调的基因与在心肌细胞样细胞簇中特异性上调的基因区分开。 在实例中本文给出如何获得混合的分化hBS细胞的说明。在本上下文中，术语"强迫聚集"用于细胞通过外力，例如使用离心力的离心或 通过重力的沉淀的3D聚集。饲养细胞如本文所用，饲养细胞是指单独或组合使用的支持细胞种类。细胞类型可以进一 步具有人类或其它物种起源。饲养细胞衍生自的组织可以包括胚胎、胎儿、新生儿、青少年 或成人组织，并且其进一步包括衍生自皮肤(包括包皮)、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵 管、腺、间质或乳房的组织。该饲养细胞可以衍生自涉及以下的细胞类型人类成纤维细胞、 纤维细胞、肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和上皮细胞。可用于衍生饲养细胞的特定细胞 类型的实例包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/ 或纤维细胞、胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐 带间充质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞。如本文所用，术语"MEF细胞"是指小鼠胚胎成纤维细胞。如本文所用，术语〃 TGF-β ‘‘是指优选人类和/或重组来源的转化生长因子β。 TGF-β为分为3种称为TGF-βΙ，TGF-3 2和TGF-3 3亚型的蛋白质。TGF-β家族为称 为转化生长因子β超家族的蛋白质超家族的部分，其包括抑制素、激活素、抗苗勒管激素 (anti-mili 11 erianhormone)、骨形成蛋白、decapentapIegic 禾口 Vg-I0如本文所用，术语"FGF"是指优选人类和/或重组来源的成纤维细胞生长因子， 属于其的亚型为例如bFGF(有时还称为FGF2)和FGF4。术语"BMP2"是指骨形成蛋白_2，其为生长因子的BMP家族的一个成员。如本文所用术语"无异源"是指完全绕开直接或间接暴露至非人类动物成分。心脏干细胞标记c-kit 和心脏祖细胞(cardiac progenitor)标记Islet_l，Nkx2. 5，GATA-4。此 处称为早期心脏标记。心肌细胞的标记cTnI，CTnT(心脏肌钙蛋白I和Τ)，α-MHC( α -肌球蛋白重链)， 连接蛋白-43。
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从本文的实例导出其它标记。CMLC根据本发明的簇包括心肌细胞样细胞，其中所述簇具有i)收缩细胞，ii)电连接的细胞，和表达iii)心脏标记，包括Nkx. 2. 5、肌钙蛋白和肌球蛋白，iv)功能肾上腺素能受体的标记，ν)功能性毒蕈碱受体的标记，vi)功能性离子通道的标记，包括hERG，Na+, Ca2+和K+通道，vii)选自以下的一种或多种内胚层标记AFP，TF，AP0A2，AHSG，SERPINA1，APOAl， AP0C3, TTR, APOBjP RBP4上述细胞之间的电连接可以通过间隙连接。本发明的簇优选不表达未分化细胞的一种或多种以下标记0CT_3/4，SSEA-4， TRA-1-60。在特定实施方式中，所述簇不表达未分化细胞的任何标记。在一方面本发明提供包括心肌细胞样细胞的簇，所述簇包括上调并且具有以下特 征的基因i) 500以上的表达值，ii)在心肌细胞样细胞簇和未分化hBS细胞(FCqk)之间的基因表达上10倍以上 的倍数变化。上述值可以按照本文实施例2中所述测定。本发明人已经应用获得倍数变化值的 两种特定方式i)通过测定CMLC和未分化细胞之间的基因表达上的倍数变化，ii)如上但补充有测定CMLC和混合的分化hBS细胞之间基因表达上的倍数变化 (参见以下)来自两种方法的结果稍微不同，并且关注方法ii)的使用，即，其中进行进一步的 筛选，可以导致具有更适合在特定应用中使用的性质的簇。因此，在具体实施方式
中，本发明提供包括心肌细胞样细胞的簇，所述簇包括上调 并且具有以下特征的基因i) 500以上的表达值，ii)在心肌细胞样细胞簇和未分化hBS细胞(FCqk)之间的基因表达上10倍以上 的倍数变化，和iii)FCcmlc 和 FCmc 的比为 100 以上Ftc表示对于混合的分化hBS细胞群体的倍数变化。在本上下文中，术语"混合的 分化hBS细胞"用于自发性分化的hBS细胞的群体，其中存在来自所有三个胚层(中胚层、 内胚层和外胚层)的细胞。该样品用作对照材料以将在所有种类的分化细胞中上调的基因 与在心肌细胞样细胞簇中特异性上调的基因区分开。此外，表达值通过用特定芯片(GeneChip Human Genome U133Plus 2. 0 (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA, USA)按照本文实施例2中的详细描述测定来获得。
14其它芯片的使用可以给出不同的值，并且因此与本文值的任何比较应该使用相同种类的芯 片或给出类似结果的芯片来进行。在本发明的更具体实施方式
中，提供了簇，其中所述簇包括上调并且具有以下特 征的基因i) 2000以上的表达值，ii) 100 以上的 FCcmlc 值，禾口iii)FCcmlc 和 FCmc 的比为 100 以上在本文实例中给出关于本领域技术人员能够如何进行试验以确定上述值的详细 资料。所述簇衍生自BS细胞，特别是hBS细胞。因此，起始材料可以为商业获得 的BS细胞或细胞系，或备选地，起始材料可以按照W003/055992和WO 2007/042225中 所述制备。此类材料可以从CeIlartisAB(驟w. cellartis. com)获得，并且还通过NIH stem cell reRistry (http//stemcells. nlh. rov/research/reRistry)以及从 UK Stem CellBank (http //www, ukstemcellbank. orR. uk)获得。如上所述，不是在簇中包含的每个个体细胞都可以满足上述要求。该要求对于簇 但不必对于任何个体细胞满足。此外，在簇中包含的细胞可以具有不同程度的分化；一些可 以完全分化成心肌细胞样细胞，而其它可以拥有像内胚层细胞的性质。然而，无论如何，所 述簇必须包含收缩细胞。如在本文实例中所述，所述簇典型地通过以下制备使BS特别是 hBS细胞借由强迫聚集进行自发性分化，以获得包含未分化细胞的3D结构。心肌细胞样细 胞簇在将所述3D结构进一步培养达22天后出现。此外，在簇中包含的分化细胞和细胞的分化程度设想在CMLC应用中为有利的。例 如，各种细胞类型可以对于增加CMLC在体外粘附和结合至不同的表面(例如，培养皿或玻 璃表面，涂布或未涂布)是重要的。它们还可以有助于在冷冻保存期间增强细胞存活，并且 当CMLC用于体内应用(例如细胞移植)时提高细胞的植入。因此，本发明的目的在于提供 簇，其包含在其发育中的从hBS细胞至心肌细胞的不同细胞类型，即分化的最开始经由中 间分化以完全地分化成心肌细胞。如在本文实例中证明，已经发现在簇中没有细胞为未分 化的细胞，因此，如实例和附图证明的，本发明的簇具有各种标记。正常地，所述簇包含多个细胞例如约10至约5000个细胞。在特定实施方式中，根据本发明的簇包含具有上调基因(与未分化细胞相比)的 细胞，其中表达值为约750以上，例如表达值为约1000以上，约1500以上，约2000以上， 约2500以上，或3000以上。备选地，或此外，根据本发明的簇包含具有上调基因的细胞，其 FCfctc0值为约20以上，例如约50以上，约100以上，约500以上，约750以上，约1000以上。 备选地或此外(当使用包括混合的分化hBS细胞的方法时^FCiyFCtc的比为约15以上， 例如约20以上、约50以上，约100以上，约500以上，约750以上，约1000以上。能够建立 一套标准以选择具有不同上调基因含量的簇。在该簇中鉴定的基因的一些为与心肌细胞样细胞正常不相关的基因(参见在表 II中标记为"白色"的基因)。这些发现似乎是有意义的并且它们可以对于CMLC关于医 疗用途和测试的功能性起重要作用。具体地内胚层起源的细胞和组织似乎在早期心脏发育 中起关键作用。CMLC组成刺激早期发育的心脏组织的组织样结构。
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如本文实施例中所示，根据本发明的簇具有以下特征(表II和III)表II.在CMLC中特异性上调的基因的总结。如上所示，在表中的所有FC值相对 于未分化的hBS细胞计算。基于CMLC的表达值将基因以降序分类。
特别注意的是在表II中的多数基因可以分类成两个不同组。第一组由与心脏细 胞之前相关的基因组成，第二组由与内胚层细胞例如肝细胞之前相关的第二基因组成。属 于第一组的基因的实例为(在表II中以浅灰色标记)MYH6，MYL7，MYL4，TNNC1, TNNT2, PLN, TTN, MYH7，LDB3，NPPB，GATA6，MYL3，CSRP3，ACTN2，MB, MY0Z2，TBX5，和 HSP27。属于第 二组的基因的实例为(在表II中以深灰色标记)AFP，TF，AP0A2，AHSG，SERPINA1，AP0A1， ALB, AP0C3, TTR, APOBjP RBP4。为了得到更严格的在CMLC中特异性上调的基因的选择，所述标准缩小为i)除去在CMLC中表达值为2000之下的基因ii)除去FCcmlc为100之下的基因iii)除去FCcmu/FCmc比为100之下的基因。剩余的9个基因列于表III，并且对于CMLC这些代表合适的标记基因。表III，在用更严格标准选择后在CMLC中特异性上调基因的总结。如上所示，在表 中的所有FC相对于未分化的hBS细胞计算。基于CMLC的表达值将基因以降序分类。 该选择显示在所述簇中表达的内胚层和中胚层基因之间的均勻分布。中胚层基因 和内胚层在表III中分别以浅灰色和深灰色标记。在其它特定实施方式中，根据本发明的簇具有例如2种以上，例如4种以上，6种以 上，8种以上，10种以上，12种以上或16种以上的与心脏细胞有关的上调基因，和/或2种以上，例如4种以上，6种以上，8种以上的与内胚层细胞相关的上调基因，和/ 或2种以上，例如4种以上，6种以上，8种以上的与非心脏或非内胚层细胞相关的在 本文表II中所述的上调基因，和/或该上调基因包括在本文表II中列出的10种以上，例 如20种以上，30种以上，40种以上，50种以上，55种以上或所有基因。在本发明的更具体实施方式
中，提供了簇，其中所述簇包括上调并且具有以下特 征的基因i) 2000以上的表达值，ii) 100 以上的 FCcmc 值，和iii) FCcmlc 和 FCmc 的比为 100 以上在本发明的进一步实施方式中，提供簇，其中所述簇包括上调并且具有以下特征 的基因i) 2000以上的表达值，ii) 100 以上的 FCcmlc 值。所述簇正常地衍生自BS细胞例如hBS细胞，并且在所述簇中的细胞数量正常地为 10至约5000细胞或10至约2000细胞。此外，根据本发明的簇表达一种或多种离子通道。显著地，鉴定的离子通道为通常 用于心脏毒性测试的离子通道。这是CMLC适合心脏毒性测试的进一步表示。该离子通道典型地为K-，Na，和/或Ca-离子通道例如K-电压-门控通道、K-内 向_整流通道、Na-电压-门控通道、Na-配体-门控通道和/或Ca-电压-依赖性通道。 更具体的离子通道列于图7a和b，海报表(poster Table)l。在特定实施方式中簇表达在 图7a和b，海报表1中列出的至少3种例如至少4种，至少5种或所有离子通道。在非常特定的实施方式中，根据本发明的簇具有在表II，III和/或在图7a和b， 海报表1中任一中列出的所有基因。更特定的实施方式从附图和权利要求变得明显。
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上述心肌细胞样细胞的簇的特征还可以在于测定其跨膜动作电位。如在实施例n 中进一步描述的，通过使用锐利的微电极以进入所述簇，记录特征动作电位，并且确定在复 极化 50%，70%和 90% 时的 AP 持续时间(dur50 (APD50)，dur70 (APD70)，dur90 (APD90))、 AP振幅(amp)、膜静息电位(MRP)和AP上升冲程的上升的最大速率(Vmax)。基于跨膜动作电位(TAP)记录，所述簇这样主要表征为结节-样、心房-样和心 室-样。因此发现簇，或簇的悬浮液包括至少10%，(例如至少13%，至少15%，或约17% ) 的结节-样细胞和/或至少30% (例如至少35%，至少40%，至少45%或约50% )的心 房-样细胞和/或至少20% (例如至少23% ,至少26%，至少30%，或约33%)的心室-样 细胞。从上述表看出，所述簇包含具有非心脏标记的细胞并且表达超过之前报道的研究 的基因数量。因此，根据本发明的簇典型地包括表达一种或多种例如至少5种，至少10种， 至少15种，至少20种，至少25种或所有以下基因的细胞 更具体地，如上所述使用更严格的要求，本发明的簇包括表达表达一种或多种例
如至少2种，至少3种，至少4种，至少5种或所有以下基因的细胞 更详细地描述在本文图11中给出。为此目的，在特定实施方式中本发明的簇包括 表达至少10种例如至少50种，至少100种，至少200种，至少300种或至少400种在图11 中提及的标记。更具体地，本发明的簇包括表达至少10种例如至少20种，至少40种，至少 60种或所有以下标记 心肌细胞样簇的悬浮液或组合物可以包含包括结节-样细胞的簇、包括心房-样 细胞的簇和包括心室_样细胞的簇的混合物。这样本发明的一种实施方式涉及心肌细胞样簇的悬浮液或组合物，其中包括 结节-样细胞的簇的数量和包括心房-样细胞的簇的数量之间的比为约1 100至约 50 100，例如约 10 100 至约 40 100，约 20 100 至约 40 100，约 30 100 至约 40 100 或约 33 100-34 100。在另一实施方式中本发明涉及心肌细胞样簇的悬浮液或组合物，其中包括结 节-样细胞的簇的数量和包括心室-样细胞的簇的数量之间的比为约1 100至约 80 100 例如约 10 100 至约 70 100，约 30 100 至约 70 100，约 45 100 至约 55 100 或约 50 100。在进一步实施方式中，本发明涉及心肌细胞样簇的悬浮液或组合物，其中包括 心室-样细胞的簇的数量与包括心房-样细胞的簇的数量之间的比为约1 100至约 90 100 例如约 40 100 至约 80 100，约 50 100 至约 75 100 或约 66 100。在进一步的实施方式中，本发明涉及心肌细胞样簇的悬浮液或组合物，其中 包括结节-样细胞的簇、包括心房-样细胞的簇和包括心室-样细胞的簇之间的比为 17 50 33。包括一种或多种簇的组合物在另一方面本发明涉及包含簇的组合物，S卩，一种或多种如上所述的心肌细胞样 细胞的簇可以在包括载体，例如水性介质的组合物中。该组合物进一步包含一种或多种添 加剂，所述添加剂包括一种或多种冷冻保护剂、一种或多种稳定剂和/或一种或多种粘度 调节剂。该组合物可以为液体或冷冻形式。所述一种或多种冷冻保护剂可以选自乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、甘油、丙二醇和 甲基戊二醇，和/或其混合物。添加剂还可以为糖或糖醇，包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳 糖。在特定实施方式中，所述冷冻保护剂为海藻糖，浓度为约0.02M至约1M，例如约 0. 05M 至约 0. 9M,约 0. IM 至约 0. 8M,约 0. 15M 至约 0. 7M,约 0. 2M 至约 0. 65M,约 0. 25M 至约 0.6M。海藻糖的浓度可以优选为约0.3M。在另一特定实施方式中，所述冷冻保护剂为蔗糖，浓度为约0. 02M至约1M，例如约 0. 05M 至约 0. 9M,约 0. IM 至约 0. 8M,约 0. 15M 至约 0. 7M,约 0. 2M 至约 0. 65M,约 0. 25M 至约 0.6M。蔗糖的浓度可以优选为约0.3M。在进一步实施方式中，所述冷冻保护剂可以为DMS0，浓度为至少2. 5% v/v，例如 约2. 5%至约40% v/v，约5%至约35% v/v，约7%至约30% v/v，约7%至约25% v/v，约 7%至约 20% v/v，约 15%至约 25% v/v，或约 5%至约 15% v/v。在还进一步的实施方式中，所述冷冻保护剂可以为乙二醇，浓度为至少2. 5% ν/ ν,例如约2. 5%至约30% v/v，约5%至约25% v/v，约5%至约20% v/v，约10%至约20%
27ν/ν,约 7%至约 10% ν/ν，或约 2. 5%至约 5% ν/ν。该组合物可以进一步包括粘度调节剂，其选自Ficoll(聚蔗糖)，Percoll，透明质 酸，白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸，明胶和甘油。在特定实施方式中，粘性调节剂可以为Ficoll，浓度为最多约150mg/ml，例如最 多约100mg/ml，最多约50mg/ml，最多约25mg/ml，最多约15mg/ml或最多约10mg/ml。该组合物的其它组分可以为一种或多种生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，浓度为约 2ng/ml，例如约 3ng/ml，约 4，ng/ml，约 5ng/ml，约 6ng/ml 以上。该组合物还可以以合适的浓度包括一种或多种必需或非必需氨基酸。必需氨基酸 的实例为例如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸， L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨 酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸，浓度为约0. OlmM, 例如约 0. 05mM,约 0. ImM,约 0. 15mM,约 0. 2mM 以上。该组合物可以进一步包括一种或多种无机盐，例如氯化钙(无水)、硫酸铜 (CuS04-5H20)、硫酸亚铁(FeS04-7H20)、氯化钾(KCl)、氯化镁(无水)、氯化钠(NaCl)J^ 酸氢钠(NaHC03)、磷酸钠、dibas (无水)、硫酸锌(ZnS04-7H20)，和/或一种维生素类，例如 生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、内消旋肌醇(i-Inositol)、烟酰胺、盐酸吡多辛、核黄 素、盐酸硫胺或维生素B12。上述物质还可以以商业混合物的形式获得，例如DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养 基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium))，MEM 培养基或 RPMI 培养基。如W02004098285中所述，CMLC可以在封闭的细管(straws)中玻璃化并贮存在液 N2中。使用包括补充有10%乙二醇和10% DMSO的vitro-PBS(Vitrolife AB)的无菌过滤 的玻璃化溶液，以及补充有0. 3M海藻糖，20%乙二醇和20% DMSO的vitro-PBS (Vitrolife AB)。所述细胞在培养基(Knock Out DMEM，补充有20 % FBS，1 %青霉素-链霉素，1 % Glutamax, 0. 5mmol/l β -巯基乙醇和非必需氨基酸)中解冻后回收。在特定实施方式中CMLC正常地具有约20 μ m至约30 μ m的尺寸，此外，在簇中 50-80%的细胞表达心脏标记。用于运送的合适产品包含在补充有2-20% FBS，1 %青霉素-链霉素，1 % Glutamax, 0. 5mmol/l β-巯基乙醇和 非必需氨基酸(都来自 Invitrogen，Carlsbad, California)的Knock Out DMEM培养基中的一种或多种簇。根据本发明的组合物提供这样的组合物，其中所述簇在至少-80°C的温度下贮存 至少2年后保留至少95%的其所述特性。此外，至少约50%以上例如约55%以上、约60% 以上、约65%以上、约70%以上、约75%以上、约80%以上、约85%以上、约90%以上或约 95%以上的细胞在使所述组合物在至少-80°C的温度下贮存至少2年后有活力。试剂盒本发明进一步提供用于测试特定物质的心脏毒性的试剂盒，其中所述试剂盒包括i) 一种或多种心肌细胞样细胞的簇或如上所述的组合物，和ii)使用所述簇或组合物的具体说明，无论哪个都是相关的。在特定实施方式中，所述试剂盒可以包括如上定义的结节-样细胞和/或心 房_样细胞和/或心室_样的心肌细胞样簇的组合物。
所述试剂盒可以进一步包括iii)在使用所述试剂盒之前将所述特定物质分散至其的培养基。在进一步实施方式中，本发明提供在特定物质的药物发现期间用于体外测试的试 剂盒，其中所述试剂盒包括i) 一种或多种心肌细胞样细胞的簇或如上所述的组合物，和ii)使用所述簇或组合物的具体说明，无论哪个都是相关的。在特定实施方式中，所述试剂盒可以包括如上定义的结节-样细胞和/或心 房_样细胞和/或心室_样的心肌细胞样簇。所述试剂盒可以进一步包括iii)在使用所述试剂盒之前将特定物质分散至其的培养基。在进一步实施方式中本发明还提供用于再生医学的试剂盒，包括i)如上所述的组合物和/或一种或多种心肌细胞样细胞簇，和ii)用于施用所述组合物或细胞至患者的工具，例如以施用形式的细胞，所述施用 形式例如为直接使用的注射器(ready-to-use syringe) 0在特定实施方式中，所述试剂盒可以包括如上定义的结节-样细胞和/或心 房_样细胞和/或心室_样的心肌细胞样簇的组合物。所述心肌细胞样细胞簇的冷冻保存可以通过使用慢速冷冻法或通过玻璃化，使用 开放或封闭的拉管(pulled straws)来进行。玻璃化溶液至少一种玻璃化溶液(第一和第二溶液)可以包含一种或多种冷冻保护剂或冷冻 保护剂的混合物。当然非毒性冷冻保护剂是优选的。冷冻保护剂通过降低残留在未冷冻水 中的其它溶质的摩尔分数来帮助最小化皱缩。它们抑制结晶冰的形成，并且因此降低水的 凝固点。它们还可以通过与水氢键结合防止蛋白质的变性。随着细胞冷却，溶剂水转化成 细胞外冰，并且增加的非渗透电解质或非电解质的细胞外浓度损伤细胞。当用冷冻保护剂 处理时，细胞不达到未处理细胞的盐浓度，直到它们达到低得多的温度。在此类低温下化学 反应进行地非常缓慢，因此细胞损伤最小化。通常最好使用冷冻保护剂的组合，因为可能在 不同类型之间存在差异。所述冷冻保护剂还可以用作渗透活性剂。合适的冷冻保护剂可以 选自乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、甘油、丙二醇，糖(包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖)和甲 基戊二醇。玻璃化过程可以包括以下步骤i)将心肌细胞-样簇转移至第一溶液，ii)任选地使心肌细胞_样簇在所述第一溶液中孵育，iii)将在步骤i)或ii)中获得的心肌细胞_样簇转移至第二溶液，iv)任选地使所述心肌细胞_样簇在所述第二溶液中孵育，ν)将从步骤iii)或iv)获得的细胞转移入一个或多个开放的、至少一面封闭的或 完全封闭的细管中，和vi)使一个或多个开放的、至少一面封闭的封闭的或完全封闭的细管玻璃化。在所述第一和第二溶液中包含的个体试剂的浓度正常地为5-50% v/v，例如约 5%至约40% ν/ν例如约5%至约25% ν/ν (第一溶液)以及约5%至约30% ν/ν (第二溶
29液)。正常地，在第二溶液中的冷冻保护剂的总浓度(即，以V/V，w/V或M计算)大于在第 一溶液中的。第一和第二溶液可以包含相同或不同的一种或多种冷冻保护剂。在第一和第 二溶液中的一种或多种冷冻保护剂的浓度可以相同或不同，并且正常地在第二溶液中的冷 冻保护剂的总浓度大于在第一溶液中的。在本发明的特定实施方式中，所述冷冻保护剂为海藻糖。在第一和/或第二溶液 中包含的海藻糖的浓度正常地为约0. 02M至约1M，例如约0. 05M至约0. 9M，约0. IM至约 0. 8M,约 0. 2M 至约 0. 7M,约 0. 3M 至约 0. 65M,约 0. 4M 至约 0. 6M,约 0. 45M 至约 0. 55M。通 常，蔗糖以类似的应用使用。海藻糖为独特的、天然发生的二糖，并且在数以百计的植物和 动物中发现。海藻糖为能量的重要来源，并且已经在冷冻期间在使稳定微生物上显示为主 要因素(primaryfactor)。已经显示海藻糖可以降低膜的相变温度，以使即使当干燥时它们 也保持在液晶状态。不限于任何理论，假设在复水期间这防止膜渗漏，由此保存细胞活力。 关于蛋白质，当细胞处于水合状态时，海藻糖已经显示通过将水从蛋白质表面排除来防止 蛋白质变性。在本发明的另一实施方式中，所述冷冻保护剂为蔗糖。在第一和/或第二溶液中 包含的蔗糖的浓度正常地为约0. 02M至约1M，例如约0. 05M至约0. 9M，约0. IM至约0. 8M， 约 0. 2M 至约 0. 7M,约 0. 3M 至约 0. 65M,约 0. 4M 至约 0. 6M,约 0. 45M 至约 0. 55M。在本发明的另一实施方式中，所述第一和第二溶液中的至少一种包括冷冻保护 剂。所述第一和第二溶液中的至少一种可以包括粘性调节剂。用于本上下文中的合适 的粘性调节剂可以选自Ficoll，Percoll，透明质酸，白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸，明 胶和甘油。所述第一和第二溶液可以包含相同或不同的一种或多种粘性调节剂。在所述第 一和第二溶液中的一种或多种粘性调节剂的浓度可以相同或不同。在本发明的特定实施方式中，所述粘性调节剂为Ficoll。在第一和/或第二溶液 中包含的Ficoll的浓度为最多约150mg/ml、例如最多约100mg/ml、最多约50mg/ml、最多约 25mg/ml、最多约 15mg/ml 或最多约 10mg/ml。在本发明的一种实施方式中，第一和第二溶液中的至少一种为水溶液。在本发明的一种实施方式中，无异源hBS细胞系和培养方法用于心肌细胞样细胞 簇的治疗性应用。在本发明的一种实施方式中，所述hBS细胞系组成三体细胞系(trisomic cell line)例如携带额外的染色体13的SA002。该细胞系已经显示有效发育成心肌细胞样细胞 簇，以及高产量簇的极大倾向。使用hBS系SA002的发育CMLC的一个优点为细胞携带固 有"标记"(即，三拷贝的染色体13)，其可以在衍生或分离自其它来源的非三体细胞的混 合物中容易地检测。来自hBS细胞的CMLC的提高的产率另一方面本发明涉及用于从hBS细胞制备CMLC的方法。与使用EB形成的现有技 术方法相比，使用该新方法已经显示是有利的，因为搏动簇(beating cluster)的产率显著 地提高。该新方法还适合大规模生产。用于该方法的细胞系可以从商业获得的细胞系，例 如 SA 002, SA 121,SA 001，SA002. 5，和 SA 461(购自 Cellartis AB, Goteborg, Sweden)获得。
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这样，本发明提供包括心肌细胞样细胞的簇的制备方法，所述方法包括以下步骤i)使在培养基中的未分化的hBS细胞悬浮和分离，ii)对这样分离的聚集体进行强迫聚集，iii)使这样强迫聚集的细胞聚集体在任选地包括多种生长因子之的培养基中孵 育以获得一种或多种3D结构，iv)将一种或多种3D结构转移至一个或多个板并且使所述3D结构在任选地包括 一种或多种生长因子的培养基中孵育，以使它们发育成一种或多种包括收缩细胞的簇。所述方法还可以包括通过从所述板除去一种或多种簇来分离一种或多种簇的进
一步步骤。在一种实施方式中，用于获得心肌细胞样簇的方法包括以下步骤1)获得未分化hBS细胞的悬浮液，2)使所述细胞悬浮液在合适的培养基中再悬浮，所述培养基任选地包含来自转化 生长因子β超家族的一个或多个成员，和/或来自成纤维细胞生长因子家族的一个或多个 成员，3)任选地，使所述细胞在所述细胞悬浮液中分离成聚集体，4)将来自步骤2或3的细胞悬浮液转移入合适的培养皿，和5)使所述细胞发育成心肌细胞样细胞簇。如果这些细胞系在饲养层上繁殖，所述细胞可以通过使用机械或优选酶促处理从 饲养层分离，由此获得原代未分化hBS细胞的悬浮液。所述酶促处理可以通过使用蛋白水 解酶，例如胶原酶进行合适的时间，例如2-20分钟，5-15分钟或10-15分钟。然而，应该设 想为了获得细胞悬浮液的细胞的任何处理可以用于本发明。设想在上述步骤1中获得的细胞主要是未分化的，是指70%以上，80%以上，85% 以上，90%以上，95%以上，或99%以上的细胞为未分化的。其后所述细胞悬浮液可以在悬浮在支持所述细胞的合适的培养基中，该培养基可 以为例如补充有FBS(优选15-25%，例如20% )的Knock Out DMEM。所述培养基可以在 试验的各种时间点补充有不同的因子例如蛋白质生长因子、化学化合物、矿物质或其它信 号传导分子。此类因子的实例为BMP-2、BMP-4、BMP-5、TGF-3 1、激动素(Activin，同“活化 素”)A、生长激素、LIF和PDGF。重要的是注意悬浮步骤相对短并且不允许拟胚体发育。在 本方法中悬浮步骤仅仅是转移步骤。任选地，如果所述细胞形成大的聚集体(例如在0. 5mm 之上)再悬浮的细胞可以其后分离成未分化细胞的小聚集体，该分离可以手动地进行，例 如通过移液管，直到所述细胞形成尺寸0. 2-0. 4mm的小聚集体。通过其后将所述细胞转移至在合适培养基(例如与如上所述相同，补充有不同因 子)中的合适的培养皿，并且使所述细胞孵育1-30天，例如1-15天，1-10天，1-5天，或优 选3天，出现心肌细胞样簇收缩的自发性簇。使用的培养皿可以为支持所述细胞的任何种 类，但在优选实施方式中所述培养皿为明胶包被的皿。在步骤4)和5)中将所述细胞转移至培养皿之前，将在步骤2)或3)中获得细胞 聚集体进行强迫聚集和/或沉淀。通过使用该方法，当通过强迫聚集旋转减慢时形成3D结 构。所述3D结构不同于拟胚体。优点在于当与例如具有崩溃趋势的拟胚体比较时，形成更可靠的结构，并且因此本方法在使用的未分化细胞的数量和所得的心肌细胞样簇的数量之 间给出更高的产率。该方法的优点还在于与现有技术EB策略相比其更快、更可靠和更大规 模和可用的用于自动化。用于获得心肌细胞样簇的优选方法包括以下步骤1)获得原代未分化hBS细胞的悬浮液，2)使所述细胞悬浮液在合适的培养基中再悬浮，所述培养基任选地包含来自转化 生长因子β超家族的一个或多个成员，和/或来自成纤维细胞生长因子家族的一个或多个 成员，3)任选地，使所述细胞在所述细胞悬浮液中分离成聚集体，4)任选地，将在步骤1或2中获得的细胞离心和/或沉淀，5)任选地，孵育来自步骤4的细胞，6)将来自步骤2或3的细胞悬浮液转移入合适的培养皿，和7)使所述细胞发育成心肌细胞样细胞簇。通过使用强迫聚集，将来自步骤2)或3)的约4-6个克隆转移至适合离心的板或 管，例如96-孔ν-底板(Corning Incoporated，NY，USA)。所述细胞然后在100_800xg下离 心 2-20 分钟(例如 200-600xg 5-10min、300-500xg 5-lOmin、或在 400xg 下 5min。)。在 提到的转移步骤6)前，这些离心的细胞可以进一步孵育1-10天(例如1-7天，或1-5天) 以用于形成3D结构，然后根据上述步骤6)转移所述结构。在进行步骤6)之前，强迫聚集可以另外使步骤2)或3)获得的细胞悬浮液沉淀 1-36小时(例如2-24小时或3-12小时)组合，或被使步骤2)或3)获得的细胞悬浮液沉 淀1-36小时(例如2-24小时或3-12小时)来代替。如上所述，来自hBS细胞的CMLC的产率可以进一步通过将所用的培养基补充不同 的因子例如蛋白质生长因子、化学化合物、矿物质或其它信号传导分子来改进。具体地本发 明人已经发现当在优选方法的例如步骤5和/或步骤7(和/或该方法的第一实施方式 的步骤2)中，使培养基(例如DMEM)包括来自转化生长因子β超家族的一个或多个成员 (例如激动素Α)，和/或来自成纤维细胞生长因子家族的成员(例如bFGF)时，产率增加。 如在图6和在实施例9中所示，与在相同培养基(但无添加的bFGF或激动素A)中的对照 生长相比，该产率增加4. 7倍。补充至培养基的激动素A的浓度包括约5-40ng/ml，例如8ng/ml，9ng/ml，IOng/ ml, llng/ml,或12ng/ml ；补充至培养基的bFGF的浓度包括约5_40ng/ml，例如10ng/ml, llng/ml,12ng/ml,13ng/ml 或 14ng/ml。还已经显示在优选方法的步骤5和/或7中有利地添加浓度为约20% FBS (例如 15-25% )，以提高产率。在特定实施方式中，用于获得心肌细胞样簇的方法从而包括以下步骤
步骤实施方式1实施方式2实施方式3实施方式4 当在优选方法的步骤5和/或7中使用的培养基进一步分别补充(单独或与激 动素A、bFGF和/或FBS组合)有GSK-3抑制剂的成员和/或p38MAP激动抑制剂例如SB 216763和SKF-860002时，该产率也显示增加(如在例如图15中所示)。如在实施例10和 图15中所示，当将激动素A、bFGF和SB 216763或SKF-860002添加至在优选方法的步骤5 中的培养基时，与其中仅添加激动素A和bFGF的对照相比，所述产率增加2-3倍。所述培 养基可以在该方法的任何阶段补充，然而在一种实施方式中所述培养基在优选方法的步骤 5中的离心之后补充至在其孵育期间的细胞。补充至培养基的GSK-3抑制剂的浓度为约1-25 μ Μ,例如2_10 μ M或5 μ Μ，补充至 培养基的Ρ38ΜΑΡ-激酶抑制剂的浓度为约1-25 μ Μ,例如2_10 μ M或5 μ Μ。本发明的特定实施方式从而包括 本发明人还已经指出通过使在优选方法的步骤7 (或该方法的首次提及实施方 式的相应的步骤5)中的包含激动素A和/或bFGF的培养基补充LIF，与仅接受培养基的对 照相比产率提高约2倍，如例如图14和实施例10中所示。LIF的浓度包括100-2000U/ml LIF,例如500-1500U/ml，或1000U/ml。在特定实施方式中，使在优选方法的步骤7 (或该方 法的首次提及实施方式的相应的步骤5)中的心肌细胞样细胞簇发育期间，包括LIF的培养 基在2-8天后，例如在4-5天后被无LIF的培养基代替。本发明的进一步的特定实施方式从而包括 如上文所述，根据本发明的簇可用于体外研究(例如在药物发现、药物测试、 靶鉴定和靶验证，例如按照实施例11和14中所述基于电生理学测定起搏通道(funny channel))0


图1.衍生自hBS细胞的CMLC的形态图。如实施例1所述使未分化的hBS细胞 保持和分化。3D结构随后在明胶包被的细胞培养皿上铺平板，导致细胞的粘附和进一步分 化。板A显示在培养皿中铺平板1天后的3D簇。板B显示铺平板3天后在3D结构的生长 物(outgrowth)的自发性搏动区域(圆形)。板C显示在新培养皿中分离后继代培养12天 的机械分离的搏动区域。图2.已经染色以显示细胞核(圆形物体)和心脏肌钙蛋白1 (线形结构)的CMLC 的形态学图(放大率x600)。所述CMLC如实施例1中所述衍生。图3.在CMLC的搏动频率上的分布。CMLC如实施例1中所述从hBS细胞分化，并 且评价109个不同的自发性收缩簇。该图显示在细胞制品中的搏动频率上的分布。图4.与未分化的hBS细胞和成人心脏组织相比在CMLC中的基因表达的QPCR分 析。CMLC如实施例3中所述从hBS细胞分化。制备两个不同发育阶段的CMLC 早期CMLC (在 培养物中维持达2个周)和晚期CMLC (在培养中维持至少6个周)。为了调查在CMLC和未
分化hBS细胞中的特定离子通道的基因表达水平，使用TaqMan 低密度阵列(384_孔
Micro Fluidic Cards，AppliedBiosystems)。为了比较，平行地分析来自人类成人正常心
脏组织(从6个不同的雌性供体收集)的商业获得的总RNA(BioChain )。如实施例3
中所述进行QPCR。各PCR反应一式四份地进行。将相对基因表达水平针对GAPDH的表达 标准化并且根据 Δ Δ Ct 法计算。板 A 显示 P0U5F1 (Oct-4)、NANOG, NKX2. 5、GATA4、TNNI3, DES、SCN5A 和 SCNlB 的 RNA 水平。板 B 显示 SCN2B，CACNA1C, CACNB1, CACNB2, CACNA2D1, CACNA1H,KCNQl 和 KCNEl 的基因表达水平。板 C 显示 KCNH2、KCNE2、KCNA5、KCNAB 1、KCNAB2、 KCNJ2、KCNJ12 和 KCNJ3 的基因表达水平。板 D 显示 KCNJ5、KCNJ11、ABCC9、KCND3、KCNA4、 Kcnip2、HCN4 和 KCNKl 的基因表达水平。板 E 显示 CFTR、GJA5、GJA1、GJA7、ATP2A2、SLC8A1、 RYR2和FKBPlB的基因表达水平。板F显示SLC9A1，MYL2, MYLK, MYH6和MYH7的基因表达 水平。图5.显示当增加药物浓度(0，IOOpM, InM, IOnM, IOOnM, IOOOnM)时在添加阿司咪 唑(抗组胺剂)和多非利特(III类抗心律失常药物)后作为心脏场电位的延迟复极化测 定的累积剂量应答曲线。如在图5a中所示，阿司咪唑以纳摩尔浓度引起复极化组分的选择 性阻断和持续延长。使用多非利特观察到类似的效应(图5b)。此外，图5c显示特非那定 对场动作电位的剂量依赖性效应，和图5d显示引起动作电位的剂量依赖性延长的钾离子 通道阻断剂西沙必利的效应。图6. CMLC如实施例1中所述衍生自未分化的hBS细胞(SA002)。在3D形成(预 铺平板)期间，将激动素A(10ng/ml)和bFGF(12ng/ml)补充至培养基。对照接收不添加因 子的培养基。铺平板后，具有20% FBS但无因子的培养基用于两个组。将数据针对内源性 对照标准化，并且表达为相对基因表达，对照设定至100%。该数据显示为在两个试验中各
40基因的基因表达的平均值；A)Nxk2. 5，B)GATA4，C)肌钙蛋白T2和D) α -心脏肌动蛋白。板 E显示在3个试验中产生的搏动CMLC的数量的平均值。误差棒表示S. D0图7.关于全基因表达谱分析和人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞样簇的表征的海 报(Poster)。图7a显示该海报，并且图7b显示表1的特写镜头。图7al_3给出图7a的详 细原文。图8.过表达基因的本体论诠释(Ontology annotations)。在hBSC-衍生的CMCL 中的530个上调基因中的显著过表达基因的本体论诠释(Ontology annotations)。仅显著 表达基因的本体论诠释(Ontologyannotations) (ρ < 0. 01)显示在该图中。板A表示〃生 物学过程"，板B表示"分子功能"和板C表示"细胞成分"。X轴表示具有特定注释的基 因的数量。图9.蛋白质相互作用图谱板A显示来自在hBSC-衍生CMCL中的530个显著上 调基因的基因产物的相互作用图谱，板B显示随机产生的蛋白质组之一的相应的相互作用 图谱。图10.在hBSC-衍生CMCL中的枢纽(Hub)蛋白网络。如果它们具有在上调基因 的产物中的至少5个试验确定的蛋白质相互作用，蛋白质鉴定为枢纽(Hub)。图11.使用SAM算法鉴定的与未分化hBS相比在CMCL中显著上调的530个基因 的全部列表。“Avg FC"栏显示在两个试验之间的平均倍数变化，右面的下一栏显示整个 不同的样品的计算的倍数变化的范围。最右栏表示关于这些基因已经报道在心脏组织中如 何表达的不同分类。在通过WebGestalt鉴定的417个基因中，331个已经之前报道为在心 脏中表达。尚未报道在心脏中表达或在WebGestalt (例如，MYL6)中缺乏组织表达记录的 基因用X标记(86个基因)。将报道为显著过度表达的基因用0标记(100个基因)，显著 表达不足的基因用U标记(25个基因)。用N标记的基因(206个基因)报道在心脏中表达 但无表达上的显著性。用虚线(_)标记的基因，总共113个基因代表通过WebGestalt工具 箱在CMLC中显著上调的基因。图12.与未分化hBSC相比在hBSC-衍生CMCL中显著下调的基因。其中40个基 因为多能性的已知标记，例如 NAN0G，P0U5F1, S0X2, TDGFl, DPPA4, LEFTY1，和 DNMT3B。图13. CMLC如实施例1中所示衍生自未分化hBS细胞(SA002)。在3D形成(预铺 平板)期间，将不同种类的FBS如图中所示补充至培养基(20%)。对照接收标准FBS和这 与透析过和炭处理(charcoal stripped)的FBS比较。铺平板后，具有20%标准FBS的培 养基用于所有组。搏动CMLC的数量在铺平板后14天使用光学显微镜计数并与对照比较。 显示的数据为在3个试验中产生的搏动CMLC的数量的平均值。误差棒表示S. D。图14. CMLC如实施例1中所示衍生自未分化hBS细胞(SA002)。在3D形成(预铺 平板)期间，将培养基补充以激动素A和bFGF(F)。对照(C)仅接收标准培养基。铺平板 后，一些组接收补充有1000U/ml LIF(F+LIF)的培养基，而其它仅接收标准培养基。铺平板 后4天，所有组接收标准培养基。搏动CMLC的数量在铺平板后第7和14天使用光学显微 镜计数并与对照比较。显示的数据为相对于设定为1的对照在3个试验中产生的搏动CMLC 的数量的平均值。误差棒表示S. D。图15. SB 216763和SKF-86002对搏动CMLC产率的影响。CMLC如实施例9中所示 衍生自未分化hBS细胞(SA002)。在3D形成(预铺平板)期间，除了以激动素A (lOng/ml)和bFGF(12ng/ml)之外，将SB 216763 (5 μ M)或SKF-86002 (5 μ Μ)补充至培养基。对照接收 仅添加激动素A和bFGF的培养基。铺平板后，无因子的标准培养基用于所有组。该图显示 与在试验中使用的hBS细胞克隆的数量相关的搏动区域的收集数量。AF =激动素A+bFGF， SB = SB 216763，和 SKF = SKF-86002。图16.在哪一天将分化hBS细胞的3D聚集体从96-孔板转移至新的培养皿的那 天显著地影响能够产生的搏动CMLC的数量，在这些试验中，CMLC如实施例1中所示衍生自 未分化hBS细胞(SA002)。更多的CMLC从当与在第7天转移相比更早转移的3D聚集体生 产。显示的数据为在不同的铺平板天(5、4和3)相对于设定为100的对照(7天)产生的 搏动CMLC的数量的平均值。误差棒表示S. D图17.通过微电极记录，证实了 3种不同类型动作电位证明了形态学为心 室-样、心房-样和结节-样。图18.心室-样AP的实例具有97mV的振幅和342ms的长APD90。图19.各CMLC簇特征在于显著的AP形态学。该图显示在16种不同簇中的APD90， 并且它们在相同簇内显示重复刺穿(Impalement)的类似的值。图20.在暴露至1，2和3Hz的场刺激期间CMLC簇的速率自适应(Rate adaptation)。左板显示该簇在180ms上具有起始APD90的簇的图显示速率自适应起搏频 率(pacing frequency)增加。右板在1，2和3Hz起搏下AP的重叠图。图21.通过记录动作电位的微电极，在用扎替雷定孵育CMLC簇期间进行测定。右 图显示重叠图(overlay plot)。图22. IKr阻断(E-4031)对AP的影响。E-4031的施用在CMLC簇中引起APD延 长、三角剖分(triangulation)和 EAD。图23. IKr阻断对AP的影响。左上板E_4031的施用在所有情况下都引起延长 的APD，从AP的形状看出的三角剖分(triangulation)的清楚信号和与APD50相比APD90 的更大延长。右上板在多数情况下，在APD延长后触发活性。底板还记录去极化后早期 (EADs)。图24.激动素A、bFGF、SB 216763和SKF-86002对搏动CMLC的产率上的影响。 CMLC如实施例1中所示衍生自未分化hBS细胞(SA002)。在3D形成(预铺平板)期间，将 不同浓度的激动素A、bFGF、SB 216763和SKF-86002另外地补充至培养基。铺平板后，无因 子的培养基用于所有组。该图显示与每组在一个皿中使用的克隆的数量相关的搏动区域的 收集数量(collective number)。该试验重复 3 次。AF =激动素 A+bFGF，SB = SB 216763， 和 SKF = SKF-86002。图25.在hBSC衍生的CMLC中没有0ct_3/4hBS细胞标记表达。免疫组织化学检 查在生长的hBS细胞克隆(A-B)中和在hBS细胞衍生CMLC(C-H)中的干细胞标记0ct_3/4 表达。(A)细胞核用4'，6-diaminidine-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染成蓝色。(B)hBS 细胞克隆显示使用针对Oct-3/4的抗体的阳性染色(绿色)。来自至少10个CMLC(此处 仅显示3个)的切片用针对心脏肌钙蛋白I (cTnl ；红色)和0ct-3/4(绿色)的抗体标记， 以及对于细胞核用DAPI (蓝色)标记。左板(C，E和G)显示cTnl (红色)和DAPI (蓝色) 染色的重叠，而右板(D，F和H)显示0ct-3/4(绿色)和DAPI (蓝色)染色的重叠。而所有 CMLC显示使用cTnl (C，E和G)的阳性染色。在簇中不能观察到0ct_3/4hBS细胞标记的可检测染色(D，F和H)。基准尺100 μ m。图26.在hBS细胞衍生CMLC中没有SSEA_4hBS细胞标记表达。免疫组织化学检查 在生长的hBS细胞克隆(A-B)中和在hBS细胞衍生CMLC(C-H)中的干细胞标记SSEA-4表 达，(A)细胞核用4'，6-diaminidine-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染成蓝色。(B)hBS细 胞克隆显示使用针对SSEA-4的抗体的阳性染色(绿色)。来自至少10个CMLC(此处仅显 示3个)的切片用针对心脏肌钙蛋白I (cTnl ；红色)和SSEA-4(绿色)的抗体标记，以及 对于细胞核用DAPI (蓝色)标记。左板(C，E和G)显示cTnl (红色)和DAPI (蓝色)染色 的重叠，而右板(D，F和H)显示SSEA-4 (绿色)和DAPI (蓝色)染色的重叠。而所有CMLC 簇显示使用cTnl (C，E和G)的阳性染色。在簇中不能观察到SSEA-4hBSC细胞标记的可检 测染色(D，F和H)。基准尺50 μ m。图27.在hBS细胞衍生CMLC中无TRA_l_60hBS细胞标记表达。免疫组织化学检 查在生长的hBS细胞克隆(A-B)中和在hBS细胞衍生CMLC (C-H)中的干细胞标记TRA-1-60 表达。(A)细胞核用4'，6-diaminidine-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染成蓝色。(B)hBS 细胞克隆显示使用针对SSEA-4的抗体的阳性染色(绿色)。来自至少10个CMLC (此处仅 显示3个)的切片用针对心脏肌钙蛋白I(cTnl ；红色)和TRA-l-60(绿色)的抗体标记， 以及对于细胞核用DAPI (蓝色)标记。左板(C，E和G)显示cTnl (红色)和DAPI (蓝色) 染色的重叠，而右板(D，F和H)显示TRA-l-60(绿色)和DAPI (蓝色)染色的重叠。而所 有CMLC显示使用cTnl (C，E和G)的阳性染色。在簇中不能观察到SSEA_4hBS细胞标记的 可检测染色(D，F和H)。基准尺100 μ m。图28.扎替雷定对衍生自hBS细胞的收缩性CMLC的搏动频率的影响。板A显示 试验结果，其中5μπι扎替雷定施用至32个不同龄的自发搏动CMLC。在搏动频率上的变化 通过目视记录扎替雷定施用前和后的收缩率来计算。值表达为搏动每分钟士SEM，n = 32， * * * = ρ < 0. 001。统计学显著性使用配对的t-测试计算。 板B显示搏动频率和HCN4的mRNA表达之间的相关性(ρ = 0. 0116)，板C显示肌 钙蛋白Τ2的mRNA表达和搏动频率之间的相关性(ρ = 0. 0314)。板D显示HCMmRNA表达 和CMLC的年龄之间的相关性(ρ = 0. 0262)。HCN4和肌钙蛋白Τ2的mRNA表达使用实时RT 定量PCR进行测定并与内源性对照CREBBP的表达相关。值表达为与设定为100%的参考样 品相比的相对基因表达(η = 32)。统计学分析使用线性回归分析来进行。图29.衍生自hBS细胞的CMLC的免疫组织化学分析。该图显示用于针对hERG离 子通道(KCNH2)(板A)、细胞核(DAPI)(板B)和心脏肌钙蛋白1(板C)的抗体的阳性染色。 基准尺50μπι。图30.hES细胞衍生的心肌细胞的微电极阵列(MEA)分析。板A显示直接在 MEA(Multichannel Systems, Germany)上培养的 hES 细胞衍生的心肌细胞簇(hES-CMCTM， Cellartis AB)。MEA技术允许多个场电位波形同时地被记录，允许分析波传播和传导速度 (板B)。板C显示在添加阿司咪唑(具有已知QT-延长作用的抗组胺剂)后，当增加的药 物浓度(0. InM, IOnM, IOOnM, 1 μ M，10 μ M)时的累积剂量应答曲线。如通过心脏场电位的延 迟的复极化所测定的，以纳摩尔浓度的复极化成分的选择性阻断和持续延长是明显的。本发明进一步在以下非限制性实例中描述。
具体实施例方式实施例实施例1 :hBS细胞分化成心肌细胞_样细胞簇自发性收缩细胞衍生自在MEF细胞(Heins et al 2004 Stem Cells)上培养的 未分化hBS细胞。用于该试验的细胞系可以为hBS细胞系SA002，SA121，SAOO1, SA002. 5， SA461 (Cellartis AB, Goteborg, Sweden, http//www. cellartis. com)，^ ^ΙΠ ηΤ^ ,^Μ Heins et al. 2004所述增殖。这些细胞系在NIH stem cell registry 和 the UK StemCell bank中列举。hBS细胞通过与胶原酶IV(200U/ml) —起在37°C下孵育10-15分钟来从饲养 层分离。将该细胞悬浮液转移至15ml管，使细胞沉淀后，除去上清液。使克隆再悬浮于补 充有20% FBS，青霉素-链霉素，Glutamax, 0. 5mmol/l β -巯基乙醇和非必需氨 基酸(都来自 Invitrogen，Carlsbad, California)的 Knock OutDMEM，并且使用移液管机 械地分离成未分化细胞的小聚集体(0. 2-0. 4mm)。使该细胞悬浮液以约4_6个克隆每孔的 浓度分配至 96-孔 ν-底板(200 μ 1/ 孔)(Corning Incorporated, NY, USA)并且在 400xg 下离心5min，该板然后在37°C下孵育3_8天。将形成的3D结构然后转移至包含培养基的 明胶包被的皿(与上述相同)。培养几天(正常1-4天)后，具有收缩细胞的簇(CMLC)的 自发性收缩区域出现并且可以使用光学显微镜目视地鉴定。每2至3天更换培养基。新的 自发性搏动区域持续地出现达铺平板后20天，该簇使用光学显微镜在目视检查下通过机 械解剖来从3D结构分离，并进行进一步表征。图la，b和c显示衍生自hBS细胞的CMLC的 出现的代表性描述。hBS衍生的CMLC如上所述分化。这些然后手动地从周围细胞分离，并 且在层粘连蛋白包被的玻璃上铺平板。培养3天后，将所述簇固定并且就细胞核和蛋白质 心脏肌钙蛋白I (其已知对于心脏组织是特异的)染色。这些簇然后用共聚焦显微镜检查。 在图2中的显微图显示已经染色显示细胞核(圆形物体)和心脏肌钙蛋白1(线形结构) 的CMLC(放大率x600)。在搏动频率上的分布通过确定109个不同的自发性收缩区域的搏动每分钟(bpm) 来评价。平均搏动频率为44bpm士24(Std. dev.)。总的分布列举在图3中。为了提高来自hBS细胞的CMLC的产率，所述培养基可以在试验期间的各种时间点 补充有不同的因子例如蛋白质生长因子、化学化合物、矿物质或其它信号传导分子。此类因 子的实例为 BMP-2、BMP-4、BMP-5、TGF- β 1、激动素 A、bFGF、生长激素、LIF 和 PDGF。实施例2.衍生自hBS细胞的心肌细胞样细胞簇(CMLC)的微阵列分析细胞培养和分化如Heins et al. 2004 中所述使 hBS 细胞系 SA002 (Cellartis AB, Goteborg, Sweden,http://www, cellartis. com)增殖。该细胞系列举于NIH stem cell registry禾口UK Stem Cell bank。hBS细胞的分化如上述实施例1中所述进行。当hBS细胞通过该策略分 化时，使用光学显微镜，对自发性收缩心肌细胞样细胞簇(CMLC)的簇进行频繁的观察。为 了微阵列试验，收集CMLC的3个分别的样品(生物性复制份(biological replicates)). 为了比较目的，也收集来自未分化hBS细胞的两个独立的样品和来自分化细胞的混合群体 (即不存在收缩CMLC)的一个样品以用于分析。如实施例1中所述分化的在培养物中的自 发性收缩CMLC的选择和除去后，将所述混合群体收集为分化细胞的剩余群体。来自3个独 立运行的样品如下所述收集。将混合群体用作对照因此代表分化的细胞群体，减去CMLC，除
44去在获得的所有分化细胞中的上调的基因。样品1.未分化 hBS 细胞(从传代(passage) 33，36，37，39 和 40 收集)2.未分化hBS细胞(从传代35-37收集)3. CMLC 1 (从传代 23-25，29 和 35 收集)4. CMLC 2 (从传代 39_41 收集)5. CMLC 3 (从传代 23-28，32-34，36-40 和 49 收集)6.分化的hBSC的混合群体(从传代22，28和32收集)RNA提取和微阵列试验总RNA使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从未分化和分化的hBS细胞提取，并随
后用于微阵列试验，该试验使用GeneChip HumanGenome U133 Plus 2. 0 (Affymetrix Inc，Santa Clara, CA, USA)，靶向54，675个转录物。由于RNA的少量，在该试验中的一些 样品使用双循环体外转录(IVT)来扩增。分别使用Agilent 2100生物分析仪和Nanodrop ND-1000 测定 RNA 质量和浓度。按照GeneChip Expression 3 ‘ -Amplification Reagents Two-cycle cDNA synthesis kit * * instructions (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, USA)处理总RNA以产生双链cDNA。其用作模板以按照制造商说明书产生生物 素-靶向cRNA。使15微克的生物素标记的cRNA片段化成长度上为35至200碱基的链， 10 微克的其使用标准方法在GeneChip Hybridisationoven 6400 中在 Gene Chip Human Genome U133 Plus 2. 0 (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, USA)上杂交过夜。将 该阵列洗涤并然后在GeneChip Fluidics station 450中染色。用GeneChip Scanner 3000进行扫描，并使用GeneChip Operating Software进行图像分析。在 Lund University 的 SCIBLU-Swegene Centre forlntegrative Biology (http://www. 1th. se/sciblu)进行质量控制，RNA处理和阵列的杂交。使代表未分化hBS细胞、分化的收缩 CMLC和分化细胞的混合群体的样品与阵列杂交。该阵列一式两份的进行。数据分析为了定义在CMLC中上调的基因的家族，计算在未分化hBS细胞和三个不同的CMLC 生物复制份之间的基因表达上的倍数变化(FC)。注意，在这些计算中，扩增和未扩增的RNA 样品是保持分离的。将在所有软件中被MAS软件称为Absent的基因过滤并使其不包括在 进一步的分析中。在扩增的样品中在所有样品中17，436个探针被称为Absent，在未扩增样 品中在所有样品中18，534个被称为Absent，并且将这些基因过滤出数据组。当FC-值已经 就各CMLC样品计算时，确定FC-值(扩增和未扩增的FC-值二者)的的平均数并当过滤基 因时随后使用。将当与未分化hBS细胞样品相比时在所有CMLC样品上具有平均FC值< 2 的基因从数据组过滤，考虑仅剩下的9，801个基因以用于进一步分析。表I列出上调基因 的分布并且总结在特定FC水平(2、3、5和10)的基因的数量。表I.在数据组上应用不同过滤器后剩余的基因的数量。
45 为了进一步细化选择方法，将"混合的分化hBS细胞"的群体作为对照材料以将 在所有种类分化细胞中的上调的基因与在心肌细胞样细胞簇中特异性上调的基因区分开。 这样"混合的分化hBS细胞"代表自发性分化hBS细胞的群体，其中可能存在来自所有3 个胚层中胚层、内胚层和外胚层的细胞。为了鉴定在CMLC中而不是在混合的分化hBS细胞群体中特异性上调的基因，计算 以下参数1.在CMLC和未分化hBS细胞(FCqk)之间的基因表达的倍数变化(FCaac)2.在混合的分化hBS细胞和未分化hBS细胞之间的基因表达的FC (FCmc)对于所有计算，使用CMLC的三个平行测定(replicates)的平均值。以下标准用 于选出在CMLC中仅特异性上调的基因i)除去在CMLC中表达值为500之下的基因ii)除去FCcmc为10之下的基因iii)除去FCCMLC/FCMC比为10之下的基因。剩余的56个基因列于表II，并且对于CMLC这些代表合适的标记基因。表II.在CMLC中特异性上调的基因的总结。如上所示，在表中的所有FC相对于 未分化的hBS细胞计算。基于CMLC的表达值将基因以降序分类。
46 特别注意的是在表II中的多数基因可以分类成两个不同组。第一组由与心脏细 胞之前相关的基因组成和与内胚层细胞之前相关的第二基因组成，例如肝细胞。属于第一 组的基因的实例为(在表II中以浅灰色标记):MYH6，MYL7，MYL4，TNNC1，TNNT2，PLN, TTN, MYH7，LDB3，NPPB，GATA6，MYL3，CSRP3，ACTN2，MB，MY0Z2，TBX5，和 HSP27。属于第二组的基因 的实例为(在表 II 中以深灰色标记)=AFP, TF, AP0A2, AHSG, SERPI ΝΑΙ, APOA1, ALB, AP0C3, TTR, APOB 和 RBP4。为了得到更严格的在CMLC中特异性上调的基因的选择，所述标准缩小为iv)除去在CMLC中表达值为2000之下的基因ν)除去FCcmlc为100之下的基因vi)除去FCCMLC/FCMC比为100之下的基因。剩余的9个基因列于表III，并且对于CMLC这些代表合适的标记基因。表III.在用更严格标准选择后在CMLC中特异性上调基因的总结。如上所示，在
表中的所有FC相对于未分化的hBS细胞计算。基于CMLC的表达值将基因以降序分类。 该选择显示在所述簇中表达的内胚层和中胚层基因之间的均匀分布。中胚层基因 和内胚层在表III中分别以浅灰色和深灰色标记。使用微阵列的显著性分析(SAM)算法的心肌细胞样簇的微阵列分析
通过使用上述分化方法和RNA提取方法，RNA在收缩开始后的各个时间点(< 22 天)收集。未分化hBS在针对RNA提取的传代(passage)后第4_5天收获或使用在传代23-41 中的细胞分化以获得CMLC。自发性收缩簇通过光学显微镜使用目视检查来鉴定并通过机械 解剖来分割。仅为了收获具有最小量周围非收缩细胞的搏动区域可采用特定的护理。对于各试验，材料由未分化hBS的一个收集的样品和收集簇的两个不同的生物复 制份(replicates)组成。数据分析差异表达基因的鉴定与未分化hBS相比在hBS衍生的簇中显著性上调或下调的基因使用SAM算法 (Tusher VG, Tibshirani R，Chu G. Significance analysisof microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc NatlAcad Sci USA. 2001 ；98 :5116_5121)鉴定。 简要的说，该算法基于相对于重复测定的标准偏差的条件之间的表达上的差异指定分数给 各基因。错误发现率(FDR)通过使用重复测定的排列(permutations)以估计偶然鉴定的基 因的百分比。分别使用FDR <0.04将该算法应用到来自两个试验的数据组的每一个。随 后，认为与未分化hBS相比，仅在两个数据组中都标记为显著上调或下调的基因在CMLC中 差异地表达。结果使用SAM算法，和FDR < 0. 04，鉴定出与未分化hBS相比在簇中显著上调的530 个基因，图11。在图11中给出的倍数变化(FCqk)相当于在上述微阵列分析中获得的结果 (表II和III)。在倍数变化的数值上的任何差异是由于在用于计算的统计方法上的差异 导致。对于少数基因，FC值在表II和表III中给出的结果之间不同。该图已经使用相同 的原始数据计算，但用于计算平均FC的方法不相同。对于在表II中的基因，与各基因对 应的GeneChips上的个体探针分别使用，并且仅达到包含标准的探针随后用于计算平均FC 值。另一方面，对于在表III中的值，使用所有探针以首先计算与一个基因对应的探针的平 均值并随后使用该值以用于进一步计算。此外，我们还鉴定出与未分化hBSC相比在hBSC-衍生CMLC中显著下调的40个 基因的较小组，图12。其中存在与多能hBS相关的几个基因，例如NAN0G，TDGFl, P0U5F1, LEFTYl，DPPA4，DNMT3B和S0X2，证明CMLC代表分化的细胞群体。为了探索上调基因之前是 否已知在人类心脏组织中过度表达，使用WebGestalt法的Tissue Expression分析(如描 述于Zang et al.，2005)。在图11的530个基因中，通过WebGestalt鉴定出417个，并且 331个标记为在人类心脏组织中"表达"。100个这些基因(24%)指定为在心脏组织中显 著地过度表达(标记为类别0，图11)。此外，25个基因(6% )指定为在心脏组织中显著地 表达不足(标记为类别U，图11)，令人感兴趣的是，这些基因中的一些(例如，TF，FGG，TTR 和SERPINA1)被WebGestalt记录为在人类肝中过度表达，暗示在CMLC中内胚层衍生物的 存在。特别注意的是，基因MYH6由于缺乏组织表达记录未通过WebGestalt鉴定出。为此， 并且为了维持一致性，MHY6在这些表中任一个都不标记为在人类心脏中显著地过度表达。 然而，在其它研究中已经报道MYH6为心脏特异性基因。为了表征在hBSC-衍生CMLC中上调基因的家族，我们进行了基因本体论分析(Gene Ontology analysis (GO))分析(analysis) 0基因本体论(GO)注释用于根据生物 过程、分子功能和细胞成分将基因分组。通过与参照表比较，在基因的组中的注释的过度 代表(overrepresentation)能够按照0/E计算，其0为具有特定注释的基因观察的数量， E为具有该注释的基因的期望数量。E按照E = R* I/R计算，其中R为参照基因的数量， I为目的基因的数量。在阵列上代表的所有基因用作参照表。在GO注释数据库中在水平 5的来自所有三个注释类别的上调基因中的显著过度代表的注释(P < 0.01)使用超几何 (hypergeometric)测试来鉴定。注意，在图8中显著过度代表的GO注释术语的几种与心肌细胞性质和功能相关。 例如，约10%的上调基因注释为在分子功能分类中的"钙离子结合"。此外，在生物过程 和细胞成分分类中的结果也支持在hBSC-衍生CMLC中的心脏谱系的存在。例如，上调基因 典型地与过程例如"肌肉收缩"、“细胞分化"和"发育"相关。此外，细胞成分注释具 有"细胞骨架间隔(cytoskeletal compartments)“和"肌原纤维结构的"的优势，其对 于在心肌细胞中的有活性的收缩装置是典型的。为了调查来自在CMLC中显著上调基因的蛋白质之间的可能相互作用，检索工具 STRING(http://string, embl. de/)用于寻找相邻基因的再现实例(recurring instance) (Snel B, Lehmann G, Bork P, et al. STRING ；a webserver to retrieve and display the repeatedlyoccurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 2000 ；28 3442-3444)。STRING旨在收集、预测和统一各种类型的蛋白质-蛋白质结合，包括直接(物 理的)和间接(功能的)结合。使用在CMLC中上调基因的列表作为至STRING的输入，形 成431个匹配，并且进一步调查在来自这些基因的产物间的可能相互作用。从这些基因产 物形成蛋白质相互作用图谱，并将其与来自10个不同随机产生的基因组(所有都相同尺 寸)的蛋白质相互作用图谱比较。对于各蛋白，相互作用分数计算为η女2/Ν，其中η为所 讨论的蛋白质的相互作用(在地图中的边缘)的数量，N为输入蛋白质的总数量。此外，确 定枢纽蛋白(hubprotein)蛋白的数量。按照Han et al.，如果蛋白质与其它蛋白质具有 彡5的相互作用，我们指定该蛋白作为枢纽。(Han JD, Bertin N, Hao T，et al. Evidence for dynamically organized modularity in the yeastprotein-protein interaction network, Nature. 2004 ；430 :88_93。还已经获得在与大多数其伴侣同时相互作用 的〃 party hubs"和与其伴侣在不同时间或位置相互作用的〃 date hubs"之间的区别。 由于我们的数据组不包括时间序列数据，我们仅鉴定"party hubs"。作为默认，STRING 使用四禾中不同的来源；Genomic context,High-throughputexperiments,Co-expression禾口 Previous knowledge以得出蛋白质相互作用图谱。然而，我们将我们的分析限定为包括仅 试验上确定的蛋白质相互作用，排除实例文本发掘(example text mining)，以增加结果的 有效性。如图9中所示，蛋白质相互作用在由在hBSC-衍生CMLC中上调的基因编码的蛋 白质之间比在随机产生的相同大小的蛋白质组中观察到的实质上更复杂。例如，鉴定出 显著更多的的枢纽蛋白(特征在于与其它蛋白质的相互作用> 5)，并且所有枢纽蛋白直 接或间接的彼此地相互作用，其导致完全连接的相互作用网络(图10)。在从随机产生的 基因组获得的相互作用网络中，我们典型地观察到一对缺乏彼此相互作用的较小的子网 (sub-network)0
除了鉴定在差异表达的基因之间的蛋白质相互作用网络之外，我们此处还报道许 多细胞途径的显著上调。引人注目地是，在焦点粘着(Focal adhesion)途径中的23个基因 在hBSC-衍生CMLC中显著上调。焦点粘着途径涉及各种细胞过程的阵列，包括组织重塑、 细胞迁移、胚胎发生、生长因子信号传导、细胞周期进展和细胞存活(Parsonset al. 2003, Petit et al 2000)。此外，近来已经强调焦点粘着在心肌细胞中的动力传导上的作用 (Samarel et al 2005)。令人感兴趣的是，除了影响心脏性能的逐拍(beat-to-beat)调 整之外，动力传导还影响包括人类心肌的细胞成分的增殖、分化、生长和存活。此外，在新 生大鼠心室肌细胞中已经报道焦点粘着激酶调节MEF2和JNK/c-Jim途径的激活，其在由 心肌细胞中的机械应力产生的肥大性基因程序的早期激活中具有重要作用(Nadruz et al 2005)。注意，在钙信号传导途径中的16个基因也在hBSC-衍生CMLC中显著上调。该观察 是未预期的，因为作为细胞内信使的Ca2+，为启动和调节心脏收缩的重要成分(Ferrier GR, Howlett SE.Cardiacexcitation-contraction coupling :role of membrane potential inregulation of contraction. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2001 ；280 H1928-1944.)。此外，已经显示Ca2+在生命的开始是重要的，从而介导生殖过程，并且稍后， 其调节在早期发育期间的一些细胞循环事件(Berridge et al 1997)。在这点上，也已知在 发育过程的多血质中为关键的Hedgehog信号传导途径(Ingham et al 2006)在hBSC-衍 生CMLC中显著地上调。具体地，Sonic hedgehog对于在P19细胞中的心脏发育似乎为关 键的信号传导因子(Gianakopoulos et al 2005)。此外，缺乏hedgehog信号传导的试验小 鼠在 Nkx2. 5 的表达上显示延迟(Gianakopoulos et al. 2005)。实施例3.衍生自hBS细胞的CMLC实时QPCR细胞培养和RNA提取自发性收缩CMLC衍生自未分化hBS细胞(SA002)(参见实施例1)。hBS细胞通过 与胶原酶IV(200U/ml) —起在37°C下孵育10-15分钟来从MEF饲养层分离。将该悬浮液 转移至15ml管，细胞沉淀后，除去上清液。将克隆再悬浮于培养基中，并使用移液管机械地 分离成未分化细胞的小的聚集体。将该细胞悬浮液分配到(200 μ 1/孔)96孔板(Costar， Corning，未处理的，ν-底)，并在400xg下离心5min。将该板然后在37°C下孵育6_8天。将 形成的3D结构然后转移至包含培养基的明胶包被的皿。两天后，观察到细胞的自发性收缩 簇(CMLC)。在收缩开始后0-2周收获这些簇的一些(“早期CMLC")，而其它在收获前保 持在培养物中至少6周(“晚期CMLC")。平行地，收获未分化hBS细胞以用于随后的RNA 提取。样品1.未分化hBS (传代35-37)2. “早期 CMLC”(传代 23-28，32-34，36-40 和 49)3.“晚期 CMLC “(传代 35，36，39，40，43，46 和 48)总RNA使用the RNeasy Mini Kit使用柱上DNA酶处理(Qiagen)从未分化 hBS和CMLC细胞提取。定量实时PCR 为了调查在CMLC和未分化hBS细胞中的特定离子通道的基因表达水平，使用 TaqMan 低密度阵列(384-孔 Micro Fluidic Cards, Applied Biosystems)。为了比
52较，平行地分析来自人类成人正常心脏组织(从6个不同的男性供体收集)(Biochain )商业获得的总 RNA。使用 Superscript 3 (cat no 18080-051 Invitrogen)进行 cDNA 合 成。各PCR反应一式四份地进行。将相对基因表达水平针对GAPDH标准化，并且根据Δ ACr 法计算。分析以下基因P0U5F1 (Oct-4)，NANOG, NKX2. 5，GATA4, TNNI3, DES, SCN5A, SCN1B, SCN2B, CACNA1C, CACNBl，CACNB2, CACNA2D1, CACNA1H, KCNQl, KCNE1, KCNH2, KCNE2, KCNA5, KCNAB1，KCNAB2，KCNJ2, KCNJl2, KCNJ3, KCNJ5, KCNJl 1，ABCC9，KCND3, KCNA4, Kcnip2, HCN4, KCNKl, CFTR, GJA5, GJA1，GJA7，ATP2A2, SLC8A1, RYR2, FKBPIB, SLC9A1，MYL2，MYLK, ΜΥΗ6 和 ΜΥΗ7。来自PCR分析的结果总结于图4。基因的板集中在在心肌细胞功能上起重要作用的 离子通道表达。例如，对心脏离子通道特异性的药物可以在CMLC上测试。可以分析指示物 例如动作电位，搏动频率和形态学外观。实施例4.使用玻璃化的CMLC的冷冻保存和解冻心肌细胞样细胞簇(CMLC)如实施例1中所述衍生自未分化hBS细胞。自发性收缩 细胞的簇手动地分开并进一步分成较小的簇(直径约0. 2-0. 3mm)。如
发明者C·阿梅恩, D·斯蒂尔, J·辛纳格伦, K·奥克松, K·达莱伯格, P·萨蒂皮 申请人:塞拉提斯股份公司