专利名称：核酸分析用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有突变体萤火虫荧光素酶的核酸分析用组合物、使用其的核酸分析 方法和核酸分析试剂盒。
背景技术：
萤火虫荧光素酶为将ATP、D_荧光素和氧转换为AMP、氧荧光素和二氧化碳并发光 的酶。作为利用萤火虫荧光素酶进行发光检测的核酸分析法，目前已知有焦磷酸测序 (pyrosequencing method)法(例如，参照非专利文献1)、使用BAMPER法的基因多态性 (SNPs)分析法(例如，参照非专利文献2)、利用杂交法的基因检测法(例如，参照非专利文 献3)等。这些核酸分析法基于如下原理使用ATP硫酸化酶、丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase,PPDK)等酶，将由于互补链合成而摄取核苷酸时放出的焦磷酸转换成 ATP，通过荧光素-荧光素酶反应对生成的ATP测定发光。例如，焦磷酸测序法中，使引物与作为模板的单链DNA(待测核酸)杂交，向反应液 中依次地加入4种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)中的每一种，使其合成互补链。合 成互补链则会生成作为反应产物的焦磷酸。通过ATP硫酸化酶将该焦磷酸转换成ATP，通过 荧光素_荧光素酶反应对生成的ATP测定发光。接着，通过用腺苷三磷酸双磷酸酶等进行 分解的液相法或预先使模板DNA结合到固相上后用反应液冲洗而洗涤的固相法等，来除去 未反应的核苷酸。一边改变核苷酸一边反复进行该一系列的工序，从而测定待测核酸的序 列。通过焦磷酸测序法能测定的碱基序列的长度在一次中不过是100碱基左右，而通 过使用每板有数百万个孔的picotiter板进行平行分析等能以低成本进行大规模核酸分 析的方法受到广泛关注。但是，在基于上述这种原理的各种核酸分析法中，多数情况下，需要向反应液中添 加作为互补链合成反应的底物的dATP来作为试剂。进而，多数情况下，待测核酸中也含有 dATP。dATP由于结构与ATP类似，因此虽然与ATP相比极弱，但也作为荧光素酶的底物而起 作用、产生发光。因此，利用荧光素-荧光素酶反应在这类含dATP的反应液中分析核酸时， 由于混入的dATP而使背景发光量增高，结果具有分析灵敏度降低的问题。作为防止dATP导致的背景发光的方法，报导了使用作为dATP的衍生物的a _硫 代三磷酸脱氧腺苷(dATP a S)代替dATP的方法(例如，参照专利文献1)。但是，dATP a S 与dATP相比非常昂贵，另外在DNA聚合酶反应中摄取效率差，存在无法正常进行互补链合 成反应等问题。此外，还报导了在焦磷酸测序法中通过降低dATP的含有率从而抑制dATP导致的 背景发光的方法(例如，参照专利文献2)。但是，降低dATP的含有率的话，当在模板DNA序 列中存在连续的胸腺嘧啶(T)时，由于必要的dATP不足，无法完全完成互补链合成。因此，无法获得与胸腺嘧啶数量相应的信号发光量，此外，由于残存未反应的胸腺嘧啶，无法进入 下一个序列的反应，结果，存在无法准确地测定碱基序列的问题。专利文献1 国际专利申请第98/13523号小册子专利文献2 日本特开2007-68450号公报非专利文献1 :Anal Biochem. 1987 年 167 卷、p235_238非专利文献2 :Nucleic Acids Res. 2001 年 29 卷(19)、p93非专利文献3 :Anal Biochem. 2004 年 333 卷、p296_30
发明内容
发明要解决的问题本发明提供萤火虫荧光素酶、使用其的核酸分析方法和核酸分析试剂盒，其用于 使用dATP的廉价、高精度且高灵敏度的核酸分析，无需使用dATPa S这类对DNA聚合酶反 应性低且昂贵的试剂。用于解决问题的方案申请人:为了解决这样的问题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用对dATP的 反应性低的萤火虫荧光素酶，能够实现抑制了 dATP导致的背景发光且廉价、高精度、高灵 敏度的核酸分析法，基于该见解完成了本发明。即本发明涉及下述方案。1. 一种核酸分析用组合物，其含有对dATP的反应性为对ATP的反应性的1/400以 下的荧光素酶。2.根据上述1所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶的425位的氨基酸为亮 氨酸，或者438位的氨基酸为甘氨酸，或者532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸 为亮氨酸且438位的氨基酸为甘氨酸，或者425位的氨基酸为亮氨酸且532位的氨基酸为 精氨酸，或者438位的氨基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸为 亮氨酸、438位的氨基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者344位的氨基酸为丙氨 酸，或者344位的氨基酸为缬氨酸，或者344位的氨基酸为异亮氨酸，或者344位的氨基酸 为丙氨酸、425位的氨基酸为亮氨酸且438位的氨基酸为甘氨酸。3.根据上述1或2所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶为平家萤来源。4.根据上述1所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶为下述的嵌合型荧光素 酶荧光素酶中，N末端侧具有源氏萤的1 448位的氨基酸序列，且217位、219位、239位 分别变为异亮氨酸(I)，C末端侧具有北美产萤火虫荧光素酶的447 550位的氨基酸序 列。5. 一种核酸分析方法，其特征在于，使用上述1 4所述的组合物。6.核酸分析用试剂盒，其含有上述1 4所述的组合物。发明的效果根据本发明，能够抑制dATP导致的背景发光的影响，能进行高灵敏度的核酸分 析。
图1是dATP/ATP比和互补链合成试验中添加dATP时的发光量的关系。
具体实施例方式(荧光素酶)作为本发明使用的荧光素酶(EC 1. 13. 12. 7)的来源，可举出鞘翅目例如源氏萤、 平家萤、北美产萤火虫等，只要是以ATP为底物显示发光反应且对dATP为低反应性的荧光 素酶，则也可以是其他起源。此外，可以具有天然的序列，也可以进一步具有各种公知突变。 也可以利用含有在耐热性、化学药品耐性、发光强度、发光持续性、发光的色调等与dATP的 反应性以外的目的下导入的突变的荧光素酶。此外，也可以利用含有在耐热性、化学药品耐 性等其他目的下引入的突变的酶。本发明使用的荧光素酶优选源氏萤荧光素酶、平家萤荧光素酶或北美产萤火虫荧 光素酶，更优选平家萤荧光素酶。(对dATP的反应性)本发明中，发光反应中使用的荧光素酶对dATP为低反应性这点极重要。“对dATP 为低反应性”是指在同一条件下进行反应时，与对ATP的反应性相比，对dATP的反应性相 对低，低的程度在一定值以下。将具有这种特性的荧光素酶用于本发明的方法的情况下，能 抑制dATP导致的背景发光而获得高精度且高灵敏度的测定值。(ATP/dATP 比测定方法)为了表示本发明中的、荧光素酶对dATP的反应性，例如，可利用对ATP的反应性与 对dATP的反应性之比(ATP/dATP比)。可以以该比率为指标来规定适于本发明中使用的 荧光素酶。但是，该ATP/dATP比随着测定时使用的ATP、dATP的浓度、pH、反应温度、试剂 组成、测定装置等反应条件而改变。此外，这些条件也综合地改变。例如，有时可通过改变 PH、反应温度、试剂组成等中任意一个或多个，使产生的发光的最大波长发生变化。另一方 面，由于测定发光的装置侧的灵敏度在每个波长下不同，这种情况下，有时也会由于测定装 置而获得不同的结果。考虑这些情况而用于规定本发明中使用的酶的ATP/dATP比，需要在 一定条件下测定。例如，用于规定本发明中使用的酶的ATP/dATP比能够在以下条件下测定。为了研究对dATP和对ATP的反应性，作为发光试剂，制备含荧光素酶的ATP/dATP 比测定用试剂(pH7. 5士0. l、60mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、2mM EDTA、20mM醋酸镁、 0. 2mM 二硫苏糖醇(DTT)、0.4mM D-荧光素、0. 牛血清白蛋白(BSA))。荧光素酶浓度依 据作为测定对象的荧光素酶的比活性而不同，期望调整到用Lumitester C-100N(龟甲万公 司制)等检测器能稳定地测定的浓度。期望为0. 01 u g/mL 10mg/mL。ATP测定中，向0. lmL ATP/dATP比测定试剂(含荧光素酶)中添加0. lmL的 1X1(T7M ATP，通过Lumitester C-100N测定刚添加后的发光量。dATP测定中，向0. lmL ATP/dATP比测定用试剂中添加0. lmL的1 X 1(T5M dATP,通 过Lumitester C-100N测定刚添加后的发光量。为了修正ATP浓度和dATP浓度，可使添加ATP时的发光量为100倍，再将该值除 以添加dATP时的发光量，将获得的值作为“ATP/dATP比”。测定优选在25士 1°C下进行。测定器使用如下的测定器以光电倍增管(photomultiplier)为检测部的 Lumitester C-100N或与其具有同等性能的测定器。
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使用在所述测定条件下得到的ATP/dATP比在400以上、优选在800以上、更优选 在2000以上、进一步优选在4000以上的荧光素酶的情况下，能够抑制dATP导致的背景发 光而获得高精度且高灵敏度的测定值。另一方面，在使用ATP/dATP比不足400的荧光素酶 的情况下，dATP导致的背景发光会产生不良影响，无法高精度、高灵敏度地进行测定。(对dATP为低反应性的荧光素酶的筛选)使用上述指标，从公知的各种荧光素酶、以公知的各种荧光素酶的序列为基础而 重新制备的荧光素酶中，能够筛选出对dATP为低反应性的荧光素酶。作为这样筛选出的适 合用于本发明的荧光素酶，例如，可举出荧光素酶的425位的氨基酸为亮氨酸，或者438位 的氨基酸为甘氨酸，或者532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸为亮氨酸且438位 的氨基酸为甘氨酸，或者425位的氨基酸为亮氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者438位 的氨基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸为亮氨酸、438位的氨 基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者344位的氨基酸为丙氨酸，或者344位的氨 基酸为缬氨酸，或者344位的氨基酸为异亮氨酸，或者344位的氨基酸为丙氨酸、425位的氨 基酸为亮氨酸且438位的氨基酸为甘氨酸、440位的氨基酸为丙氨酸的荧光素酶。此外，所 述氨基酸位置基于平家萤的荧光素酶的氨基酸序列(序列号1)。此外，荧光素酶还可举出如下的嵌合型荧光素酶(LUC-C)荧光素酶中，N末端侧 具有源氏萤的1 448位的氨基酸序列，且217位、219位、239位分别变为异亮氨酸(I)，C 末端侧具有北美产萤火虫荧光素酶的447 550位的氨基酸序列。(对dATP为低反应性的突变荧光素酶的制作)可使用公知的各种突变酶的制作方法，来重新制作对dATP为低反应性的荧光素 酶。作为导入突变的方法，可举出例如通常使用的方法，即，使用突变引物通过PCR来对各 个载体进行扩增的方法，但并不限定于此。此外，也可以从通过随机突变而获得的突变荧光 素酶来寻找目标物质。已知的是，鞘翅目类荧光素酶中，在全长中氨基酸序列同源性都很 高，已知在多数情况下，关于某种荧光素酶基因中的突变，通过将突变导入到不同来源的荧 光素酶相应的氨基酸残基处，能获得相同的性质改良效果，优选在导入突变时参考各种鞘 翅目中的信息。还能够制作出不仅对dATP为低反应性而且同时具有能发挥进一步改良性 质的效果的突变的荧光素酶，这些突变酶在实际应用时有用性很高。接着，用获得的含有突变荧光素酶基因的质粒转化宿主细胞。从对获得的转化体 进行培养而得到的菌体中，纯化突变荧光素酶。作为宿主，可举出大肠杆菌K-12菌株，但并 不限定于此。(核酸分析方法)将上述试剂、酶、各工序组合，进行核酸分析。具体而言，分析可包含以下工序的组合(1)在含有待测核酸的反应液中，添加与碱基AGTC相应的4种dNTP或其衍生物中 的至少1种，以所述待测核酸为模板进行互补链合成的工序。(2)由所述互补链合成所生成的焦磷酸来生成ATP的工序。(3)通过以所述ATP为反应底物的荧光素酶反应而产生发光，通过检测该发光，来 判定所述互补链有无合成以及对合成量进行定量的工序。所述工序可每个分别进行，也可以在1种液体中同时进行⑴和(2)、⑵和(3)、或⑴ ⑶。各工序中的各成分的浓度范围可以使用在公知的各种方法中已知的浓度。关于dNTP浓度，通过焦磷酸测序法等这种分步进行的互补链合成反应来进行核 酸分析的情况下，dNTP的不足会引起合成不完全，从而导致序列解析错误，因此必须加入足 够的浓度。尤其是，基因组序列分析中，在DNA序列上经常存在相同的碱基序列连续10次 的序列。为了准确测定这样的碱基序列，dNTP的添加量必须为模板DNA的至少30倍以上、 期望为60倍以上、更期望为100倍以上。该值为对于合成10碱基量所需的dNTP量(模板 DNA的10倍量)的3倍、6倍、10倍的量。荧光素酶反应所产生的发光可使用公知的测定装置进行测定。例如，可以使用 以Lumitester C-100N等光电倍增管(photomultiplier)为检测部的测定装置、以及 以光电二极管、(XD、C-M0S、一次成像照相机(instant camera)、图像增强器(imaging intensifier)等为检测部的测定装置。(待测核酸)作为本发明中使用的待测核酸，可举出各种核酸分析法中使用的各种核酸、具体 而言可举出DNA、RNA。待测核酸的来源可使用人、其他真核、原核生物、病毒等生物体来源 的待测核酸、通过PCR等扩增获得的待测核酸、通过DNA合成仪等人工合成的待测核酸。尤 其优选含有人、微生物的基因组序列的待测核酸等。(dNTP)本发明中使用的dNTP是指脱氧核糖核苷三磷酸，有脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧 鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸腺嘧啶三磷酸(dTTP)、脱氧胞嘧啶三磷酸dCTP等；也可以使用 二脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)中的ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP，还可以使用其他dNTP的 衍生物，只要能通过DNA聚合酶的作用进行互补链合成而生成焦磷酸即可。此外，期望使用 不含其它dNTP以及导致背景发光的ATP、焦磷酸的高纯度产品。其以PCR、测序、导入突变、 cDNA合成等用途形式进行市售，因此可以使用这些市售的物质。也可以加入焦磷酸酶、腺苷三磷酸双磷酸酶等酶，事先分解掺入的焦磷酸、ATP。添 加的酶可通过超滤膜滤除或加入化学药品等使其失去活性，从而降低对由互补链合成所生 成的焦磷酸和ATP的分解。(互补链合成)作为本发明中使用的互补链合成工序，可使用公知的各种方法。例如，类似于SNPs 分析那样，使用加入1种dNTP来进行1个碱基量的互补链合成的方法，通过互补链合成的 有无可分析目标部分的碱基。此外，类似于焦磷酸测序法等那样，使用加入每一种类的dNTP 并分步进行互补链合成的方法，可分析目标部分的碱基序列。核酸序列的鉴定中，可加入全 部4种dNTP和已知的引物，通过互补链合成的有无，检测具有特定的序列的核酸的有无。本发明中使用的互补链合成中，可以使用PCR法、LAMP法、ICAN法等这类DNA扩增 法。在进行这些互补链合成的过程中，会生成与互补链合成量相当的焦磷酸。(DNA 聚合酶)本发明中的互补链合成工序中所使用的DNA聚合酶是指，以核酸为模板来合成具 有与其互补的碱基序列的DNA链的酶，包括以DNA为模板而复制DNA的DNA依赖性DNA聚 合酶、和以RNA为模板而复制DNA的RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)等。本发明中使用的DNA聚合酶，只要是具有以脱氧核糖核苷酸为底物而生成焦磷酸的活性的酶，则没有 特别限定。(与焦磷酸量相当的ATP的生成)作为将上述互补链合成工序所生成的焦磷酸转换为与其相当的ATP的方法，可使 用各种公知的方法，尤其优选使用酶的方法。作为使用的酶，例如可举出ATP硫酸化酶(EC 2. 7. 7. 4) (Anal Biochem. 1985 年 151 卷(2)、p504_509)、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(EC 2. 7. 7. 1)(日本特表2003-509601号公报)、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK) (US 5891659、非专利 文献3)等，但并不限定于此。(核酸分析用试剂盒)将上述试剂、酶等组合，能制作出用于本发明的核酸分析方法中的试剂盒。试剂盒 例如可含有以下成分。 1)与碱基AGTC相应的4种dNTP或其衍生物2) DNA 聚合酶3)D-荧光素和前述方案1 4所述的对dATP为低反应性的荧光素酶4)AMP和磷酸烯醇式丙酮酸以及丙酮酸磷酸双激酶、和/或腺苷_5’ -磷酸硫酸 (adenosine 5' -phosphosulfate，APS)和 ATP 硫酸化酶。所述试剂盒中的各试剂、酶的配合量可根据使用的酶的特性以及测定条件而变 化，例如反应时，可如下制备dNTP或其衍生物浓度为0. 001 1 ii M、DNA聚合酶为1 5000U/mL、D-荧光素为 0. 001 10mM、荧光素酶为 1 5000GLU/mL、AMP 为 0. 001 10mM、 磷酸烯醇式丙酮酸为0. 001 10mM、丙酮酸磷酸双激酶为0. 1 1000U/mL、APS为0. 1 100 u M、ATP 硫酸化酶为 0. 02 2U/mL。试剂盒使用时的pH可根据使用的酶的特性等而变化，例如，可调整pH为6. 0 8. 5。还可加入镁盐以及其他金属盐等和BSA、二硫苏糖醇(DTT)等酶类活化因子以及 稳定剂。此外，为了分解成为背景的ATP、焦磷酸，作为酶，可加入腺苷三磷酸双磷酸酶、焦 磷酸酶。以下通过实验例和实施例对本发明进行更具体的说明。但本发明的保护范围不受 这些例子任何限制。实施例11.荧光素酶突变体北美产萤火虫荧光素酶(野生型)使用sigma公司制造的产品。此外，LUC_H(龟 甲万公司制，制品编号61314)为平家萤的217位变为亮氨酸(L)、490位变为赖氨酸(K)从 而提高了稳定性的荧光素酶；LUC-T(龟甲万公司制、制品编号61315)为源氏萤的217位 变为异亮氨酸(I)从而提高了稳定性的荧光素酶。进而，LUC-C(龟甲万公司制、制品编号 61313)为如下的嵌合型荧光素酶荧光素酶中，N末端侧具有源氏萤的1 448位的氨基酸 序列，且217位、219位、239位分别变为异亮氨酸(I)，C末端侧具有北美产萤火虫荧光素酶 的447 550位的氨基酸序列。pET16b-BLU-Y 的制作
为扩增生物素化荧光素酶结构基因，合成了全长用引物(序列号2)。以日本专利 第3466765号记载的质粒pHLf248 (另外，大肠杆菌JMlOl [pHLf248]保藏于独立行政法人 产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号为FERM BP-5081。)为模板，使用所述引物 和市售M13-M4引物(宝生物公司制)进行PCR，将获得的DNA片段用NdeI和HindIII消 化后，用琼脂糖凝胶进行纯化。另一方面，将质粒载体PET 16b (诺维信公司制)用Ndel、 HindIII消化后，纯化，制作插入了所述DNA片段的质粒pET16b_BLU_Y。将制作的质粒导入 大肠杆菌JM109菌株，进行转化。由获得的转化体纯化质粒，并确认DNA序列。
pET32-LUC-H 的制作为了扩增荧光素酶结构基因，合成了全长用引物(序列号3、4)。以日本专利第 3749628号记载的质粒pHLfLK(另外，大肠杆菌JM109[pHLfLK]保藏于独立行政法人产业 技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-6147。)为模板，使用所述引物进 行PCR，将获得的DNA片段插入到用SmaI消化后的pBluescriptll中。将该质粒导入到大 肠杆菌JM109菌株中，进行转化，由获得的转化体提取质粒。将获得的质粒用BamHI和XhoI 消化，使用琼脂糖凝胶纯化荧光素酶结构基因。另一方面，插入有DNA片段的质粒载体如下 制备将pET32c (诺维信公司制)用NdeI和BamHI消化后，纯化，插入退火后的合成寡核苷 酸(序列号5、6)而制备。将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株中进行转化后，提取质粒。对 该质粒的DNA序列进行确认，用BamHI、XhoI消化后，使用琼脂糖凝胶进行纯化，制作出插入 有含所述荧光素酶结构基因的DNA片段的质粒pET32-LUC-H。将所制作的质粒导入到大肠 杆菌JM109菌株中，进行转化。由获得的转化体纯化质粒，确认DNA序列。突变荧光素酶344A、344V以及3441的制作合成出如下设计的PCR引物将平家萤荧光素酶的氨基酸序列中344位的氨基酸 残基亮氨酸转换成丙氨酸(A)、缬氨酸(V)以及异亮氨酸(I)。为了容易选择出候选株，进 行了如下设计在序列F-344V、I共用(序列号7)中导入了沉默突变，制作出天然序列中所 不具有的AatII位点。以pET16b-BLU-Y为模板，通过PCR扩增全长。引物的组合如下。pHLf344A F-344A (序列号 8)、R-344A (序列号 9)pHLf344V F-344V、I 共用、R-344V (序列号 10)pHLf344I F-344V、I 共用、R-344I (序列号 11)使用PCR反应液，通过DpnI消化而分解模板质粒，通过激酶处理而将PCR产物末 端磷酸化。使用处理后的PCR反应液转化大肠杆菌JM109菌株。由获得的转化体JM109菌 株纯化质粒，确认DNA序列。突变荧光素酶425L、438G以及532R的制作与上述同样地设计引物，使得平家萤荧光素酶的氨基酸序列中，425位的氨基酸为 亮氨酸(L)、438位的氨基酸为甘氨酸(G)以及532位的氨基酸为精氨酸(R)，来进行氨基酸 置换。使用的引物组合如下。pHLf425L F-425L (序列号 I2)、R-425L (序列号pHLf438G F-438G (序列号 I3)、R-438G (序列号 I6)pHLf532R F_532R(序列号 14)、R_532R(序列号 17)此外，分别制作这些突变的组合。以pHLf425L为模板，与前述同样地通过PCR导 入 438G 突变(pHLf425L+438G)。进而，以 pHLf425L、pHLf438G、pHLf425L+438G 为模板，与前述同样地导入 532R 突变，分别制作 pHLf425L+532R、pHLf438G+532R、pHLf425L+438G+532R。突变荧光素酶344A+425L+438G的制作将用ApaI消化pHLf425L+438G而获得的DNA片段用琼脂糖凝胶进行纯化。另一 方面，以用ApaI消化pHLf344A而获得的DNA为模板，同样地纯化，制作插入有所述片段的 质粒pHLf344A+425L+438G。将获得的质粒DNA导入到大肠杆菌JM109菌株中，进行转化，由 获得的转化体纯化质粒，并测定序列。突变荧光素酶440A的制作合成出如下设计的PCR引物将平家萤荧光素酶的氨基酸序列中，440位的氨基酸 残基亮氨酸转换为丙氨酸(A)。以PET32-LUC-H为模板，通过PCR扩增全长。引物的组合如 下。pHLf440A F_440A(序列号 18)、 R_440A(序列号 19)使用PCR反应液，通过DpnI消化而分解模板质粒，在80°C下孵育20分钟而使DpnI 失活，使用失活后的PCR反应液导入到大肠杆菌KRX菌株中进行转化。由获得的转化体KRX 菌株纯化质粒，并确认DNA序列。突变荧光素酶的纯化将前述制作的质粒pET32-LUC-H、pHLf344A、pHLf344V、pHLf344I、 pHLf425L、pHLf438G、pHLf532R、pHLf425L+438G、pHLf425L+532R、pHLf438G+532R, pHLf425L+438G+532R、pHLf344A+425L+438G、pHLf440A 分别导入大肠杆菌 BL21 (DE3)或大 肠杆菌KRX菌株中，使用所获得的转化体制作突变荧光素酶His-LUC-H、344A、344V、344I、 425L、438G、532R、425L+438G、425L+532R、438G+532R、425L+438G+532R、344A+425L+438G、 440A。将导入有含突变荧光素酶基因的质粒的转化体分别接种到含50 μ g/mL氨苄青霉素 的LB培地2mL中，在37°C下进行好氧培养。在培养条件为转数120rpm、37°C下培养3小时， 加入IPTG并使其终浓度为ImM，然后在30°C下进行4小时的诱导表达。将收集的菌体用生理盐水洗涤，将获得的菌体悬浮于50mM磷酸钠缓冲液(pH7. 5) 中，通过超声波进行破碎，通过离心分离去除细胞残渣。用His-tag纯化试剂盒(MagExtractor-His-tag-、东洋纺公司制)，按照实验流程 对获得的离心上清进行纯化，将其用于以下的实验。2.试齐[J添加并溶解以下物质使其达到各自的浓度，制备溶液，将其用于实验。(l)ATP/dATP 比测定用试剂(ρΗ7· 5)60mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸2mM EDTA20mM 醋酸镁0. 2mM 二硫苏糖醇(DTT)0. 4mMD-荧光素0. 牛血清白蛋白(BSA)1 μ g/mL荧光素酶(2)互补链合成确认用发光试剂(pH7. 5)60mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(同仁化学公司制)
2mM EDTA (同仁化学公司制)20mM醋酸镁(和光纯药工业公司制)0. 2mM DTT (和光纯药工业公司制)33. 8U/mL PPDK (龟甲万公司制)
658. 8GLU/mL 荧光素酶1. 8U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶(sigma公司制)0. 4mM D-荧光素(YMC公司制)0. 08mM磷酸(烯酮式)丙酮酸三钠(sigma公司制)0. 4mM AMP (Oriental Yeast 公司制)0· BSA (sigma 公司制)(3) ATP 溶液IXliT7M ATP(Oriental Yeast 公司制)(4)dATP 溶液IXliT5M dATP 溶液(GE Healthcare Life Sciences 公司制)3.对ATP、dATP的反应性的测定制作了含各种荧光素酶的ATP/dATP比测定用试剂。ATP测定中，向0. ImL ATP/ dATP比测定试剂中添加0. ImL的1 X 1(Γ7ΜΑΤΡ、通过Lumitester C-100N测定刚添加后的发 光量。dATP测定中，向0. ImL ATP/dATP比测定用试剂中添加0. ImL的1 X 10_5MdATP，通过 Lumitester C-100N测定刚添加后的发光量。使添加ATP时的发光量为100倍，再将该值除 以添加dATP时的发光量，将获得的值表示为“ATP/dATP比”。测定在25°C下进行。该结果如下所示。荧光素酶ATP/dATP比北美产荧光素酶(野生型)100LUC-H160His-LUC-H170LUC-T250LUC-C430425L500438G520532R400425L+438G690425L+532R590438G+532R640425L+438G+532R1,300344V4603441720344A7,200344A+425L+438G16,000440A240
北美产萤火虫荧光素酶(野生型)的ATP/dATP比为100，LUC-T的ATP/dATP比 为250，LUC-H的ATP/dATP比为160。此外，在LUC-H中插入有组氨酸标签的His-LUC-H的 ATP/dATP比与LUC-H基本相同，为170，表明组氨酸标签的插入对ATP/dATP比没有影响。相对于此，LUC-C的 ATP/dATP 比为 430，425L 时为 500，532R 时为 400。438G 时为 520，425L+532G 时为 590，425L+438G 时为 690，进而 438G+532R 时为 640，在 425L+438G+532R 时为 1300。进而 344A 的 ATP/dATP 比为 7200，344V 时为 460，3441 时为 720，344A+425L+438G 时为 16000,440A 时为 240。已知LUC-C为耐热性等稳定性优异且催化效率高的荧光素酶(专利文献日本特 愿平10-548594)，但还没有关于其对dATP的反应性的研究报导，此次初次发现该酶为对 dATP反应性低的酶。344A是将平家萤的344位(相当于北美产萤火虫中的342位)的亮氨酸变成 丙氨酸的荧光素酶。作为类似于该酶的酶，Branchini等的报导中已阐明通过将北美 产萤火虫的342位的亮氨酸变成丙氨酸，其将变成发光峰降低、半衰期变长的发光模式 (Biochemistry,2003年、第42卷、p. 10429)，但没有关于其对dATP的反应性的研究报导， 此次初次发现该酶为对dATP的反应性低的酶。对于含425L、438G、532R、440A或它们的组合的突变荧光素酶，虽然将其作为发光 强度被增强的突变进行过报道(专利文献日本特开2007-97577号公报)，但这些报道并 非是对dATP的反应性进行研究，此次初次阐明了这些酶为对dATP反应性低的酶。组合了425L (ATP/dATP 为 500)和 438G (ATP/dATP 为 520)的突变的 425L+438G，其 ATP/dATP 比为 690，组合了 425L 和 532R (ATP/dATP 为 400)的 425L+532R，其 ATP/dATP 比为 590，组合了 438G和532R的438G+532R，其ATP/dATP比为640。此外，组合了这3个突变的 425L+438G+532R，其 ATP/dATP 比为 1300。进而在 344A (ATP/dATP 为 7200)中组合有 425L 和438G的344A+425L+438G，其ATP/dATP比为16000，因此可知，通过组合具有对dATP反应 性低的效果的突变，能获得对dATP的反应性更低的突变体。S卩，即使是440A(ATP/dATP为240)这种、与突变前相比对dATP的反应性降低但单 独时被认为这种效果较小的突变体，认为通过与其它具有同样效果的荧光素酶组合，效果 将变大。(本发明的使用荧光素酶的核酸分析)在核酸分析法中实施焦磷酸测序法，在该测序法中使用了利用PPDK的焦磷酸测 定法。通过实施例对本发明进行更详细的说明，但实施例并不构成对本发明的任何限定。使用LUC-H、LUC-T、LUC-C、425L+438G 突变体、344A 突变体、和 344A+425L+438G 突 变体，制作互补链合成确认用发光试剂。在0. IOOmL的互补链合成确认用发光试剂中，添加 0. 002mL 的 5 X ICT6M 的分析用模板 DNA (序列号 20)(终浓度 5 X I(T8M)、0. 002mL 的 5 X ICT6M 的分析用引物DNA (序列号21)(终浓度5 X I(T8M)，进而，加入0. 002mL的5000U/mL Exo-克 列诺片段(Exo-Klenow Fragment)(克隆)(Ambion公司制、终浓度50U/mL)，加入超纯水使 其为0. 2mL,在37°C下加温。测定时，添加0. 03mL的1 X ICT5M dCTP或dATP (含0. lU/mL焦 磷酸酶)，通过Lumat LB9507 (Berthold公司制)，对此时的发光量的经时变化以1秒的间 隔测定60秒。dATP、dCTP以分析用模板DNA、分析用引物DNA的30倍量的方式添加。
分析用模板DNA和分析用引物DNA为如下的序列添加dCTP时则进行1个碱基量 的互补链合成并显示发光，添加其它核苷酸时则不合成互补链。使用各种荧光素酶，测定进行1个碱基量的互补链合成时的发光量的经时变化。 对于LUC-H(ATP/dATP为160)，在加入模板DNA的30倍量的dATP的情况下，在dCTP时显 示最大值的添加6秒后的发光量为dCTP时的约120%。同样地，对于LUC-T(ATP/dATP为 250)，为89%，因此，不能说是能够容易地区分dATP导致的背景发光和来自于互补链合成 的发光。
然而，对于LUC-C (ATP/dATP为430)，添加dATP时的发光量为43 %，对于 425L+438G(ATP/dATP为690)，为38% ；由于其在50%以下，因此使得dATP导致的背景发光 和来源于互补链合成的发光能够容易地区分开。随着使用的荧光素酶的ATP/dATP比进一步变大，添加dATP时的发光量降低， 344A (ATP/dATP 为 7200)、344A+425L+438G (ATP/dATP 为 16000)则几乎看不到发光。图1中示意出各种荧光素酶的ATP/dATP比的倒数、即dATP/ATP比与互补链合成 试验中添加dATP时发光量的关系。观察图1，dATP/ATP比和添加dATP时的发光量存在比 例关系，近似直线的斜率为20000。为了明确区分互补链合成引起的发光量和dATP导致的发光量，在最大发光量下， 需要使dATP导致的发光量相对于互补链合成时的发光量的比例为约50%以下，优选在最 大发光量下为约10%以下。此外，考虑到基因组序列中经常存在相同的碱基序列连续10次左右的序列，为了 使dNTP不会不充分从而准确地解析碱基序列，需要添加其模板DNA的30倍、期望添加60 倍、进而期望添加100倍的dNTP。由图1的结果可知，在使dATP的添加量为模板核酸的30倍时，为了使dATP导致 的背景发光变成50%以下，需要使用ATP/dATP比为400以上的荧光素酶；为了使dATP导 致的背景发光变成10%以下，需要使用ATP/dATP比为2000以上的荧光素酶。此外，dATP的添加量与其所导致的背景发光量存在比例关系，因此在使dATP的 添加量为模板DNA的60倍时，为了使背景发光分别为50%以下、10%以下，需要使用ATP/ dATP比分别为800以上、4000以上的荧光素酶；在使dATP的添加量为模板DNA的100倍 时，需要使用ATP/dATP比为1300、6700以上的荧光素酶。目前，虽有报道使用北美产萤火虫荧光素酶、LUC-H这类ATP/dATP比在400以下 的荧光素酶的例子，但不存在使用ATP/dATP比为400以上的荧光素酶来实施碱基序列分析 的报导。发明人等发现，通过使用对dATP反应性低的荧光素酶，能将dATP导致的背景发光 抑制为较低，即使使用能廉价且稳定地进行互补链合成的dATP，也能进行高精度的核酸分 析。产业上的可利用性根据本发明，能抑制dATP导致的背景发光的影响，因此无需使用dATP α S这类昂 贵的试剂即能够进行廉价、高精度且高灵敏度的核酸分析。
权利要求
一种核酸分析用组合物，其含有对dATP的反应性为对ATP的反应性的1/400以下的荧光素酶。
2.根据权利要求1所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶的425位的氨基酸为亮 氨酸，或者438位的氨基酸为甘氨酸，或者532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸 为亮氨酸且438位的氨基酸为甘氨酸，或者425位的氨基酸为亮氨酸且532位的氨基酸为 精氨酸，或者438位的氨基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者425位的氨基酸为 亮氨酸、438位的氨基酸为甘氨酸且532位的氨基酸为精氨酸，或者344位的氨基酸为丙氨 酸，或者344位的氨基酸为缬氨酸，或者344位的氨基酸为异亮氨酸，或者344位的氨基酸 为丙氨酸、425位的氨基酸为亮氨酸且438位的氨基酸为甘氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶为平家萤(Luciola lateralis)来源。
4.根据权利要求1所述的核酸分析用组合物，其中，荧光素酶为下述的嵌合型荧光素 酶荧光素酶中，N末端侧具有源氏萤(Luciola cruciata)的1 448位的氨基酸序列，且 217位、219位、239位分别变为异亮氨酸(I)，C末端侧具有北美产萤火虫荧光素酶的447 550位的氨基酸序列。
5.一种核酸分析方法，其特征在于，使用权利要求1 4所述的组合物。
6.核酸分析用试剂盒，其含有权利要求1 4所述的组合物。
全文摘要
本发明提供萤火虫荧光素酶、使用其的核酸分析方法和核酸分析试剂盒，其用于使用dATP的廉价、高精度且高灵敏度的核酸分析，无需使用dATPαS这类对DNA聚合酶反应性低且昂贵的试剂。核酸分析用组合物含有对dATP的反应性为对ATP的反应性的1/400以下的荧光素酶；核酸分析方法，其特征在于使用所述组合物；以及含有所述组合物的核酸分析用试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101861397SQ20088011637
公开日2010年10月13日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年11月20日
发明者三重正和, 小玉侑加子, 小畠英理, 铃木繁哉, 黑泽惠子 申请人:龟甲万株式会社