专利名称：外周血白细胞中FC受体介导的肿瘤坏死因子超家族mRNA表达的制作方法
技术领域：
本公开涉及用于预测患者对涉及肿瘤坏死因子超家族成员或细胞因子的类风湿 性关节炎疗法的应答性的方法，涉及监测这种疗法的有效性的方法，以及涉及用于筛选用 于治疗类风湿性关节炎的化合物的方法。本公开也涉及用于监测类风湿性关节炎患者中疾 病状态的方法。相关技术的描述自身免疫病以产生与宿主细胞反应的抗体或具有自身反应性的免疫效应T细胞 为特征。经常在某些类型的自身免疫病中鉴定到自身抗体，如重症肌无力中的抗乙酰胆碱 受体抗体和系统性红斑狼疮中的抗DNA抗体。然而，在许多类型的自身免疫病中见不到此 类自身抗体。此外，在健康个体中经常检测到自身抗体，不过此类抗体不诱导自身免疫病。 因而，除了自身抗体外，仍待鉴定的其它机制显然参与自身免疫病的发病机理。—旦自身抗体与靶宿主细胞结合，则认为补体级联被激活以在靶细胞膜上形成 导致宿主细胞死亡的C5-9攻膜复合物(见Esser，Toxicology 87,229(1994))。副产物 趋化因子如C3a、C4a或C5a召集更多白细胞至损害处(见Hugli，Crit. Rev. Immunol. 1， 321 (1981))，所召集的白细胞或在损害处的天然存在的白细胞通过Fc受体(“FcR”)识别 结合抗体的细胞(免疫复合物)。一旦FcR被免疫复合物交联，则白细胞释放TNF- a (见 Debets等，T. Immunol. 141，1197 (1988))，所述TNF-a与宿主细胞表面上存在的特异性受 体结合并诱导细胞凋亡或细胞损伤(见Micheau等，Cell 114,181(2003))。激活的FcR 也启动趋化性细胞因子释放以召集不同亚群的白细胞至损害处(见Chantry等人，Eur. J. Immunol 19,189(1989))。这是FcR相关性自身免疫病的分子机制的总体假设。类风湿性关节炎(“RA”)是涉及胃肠道炎症的免疫疾病。虽然该疾病在临床上被 充分表征，然而对其发病机理了解甚少。RA以持续的炎性滑膜炎为特征，通常涉及对称分布 的外周关节。这可以导致软骨破坏、骨糜烂和关节完整性的改变。RA的病因仍未知，不过高 度怀疑CD4+T细胞在本病中发挥作用，原因是这种细胞在滑膜中占优势、RA患者的血液和血 清中(由激活的T细胞产生的)可溶性IL-2受体增加以及本病通过除去T-细胞而明显改 善。RA与关节中TNF-a (也称作TNFSF-2)的堆积有关。TNF-a通常起到动员白细胞以对 抗感染和其它入侵者，从而在患部(affected area)引起炎症的作用。健康身体自身可以去除过多的TNF-a，但是类风湿性关节炎患者的身体不能。因而，越来越多的白细胞迁移至 患部。尤其在类风湿性关节中，TNF-a的堆积引起炎症、疼痛和组织损伤。已知IgG Fc受体(Fc y R)与免疫复合物(IC)( 一个表位与针对该表位的抗体的 组合)反应引发各种炎症反应。经常在RA患者的关节损害处鉴定到IC，尽管具体抗原没有 得到充分表征。也已知IC激活补体级联以形成炎症以及通过结合至各种白细胞的FcyR 以形成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。先前已经从滑膜液中收集并研究了局部浸 润性白细胞。然而，因为这些收集物含有新来细胞和衰竭细胞，故而结果难以解释。由于移 行至疾病部位时，外周血白细胞在RA的发病机理中发挥重要作用，因而已经开展众多实验 以体外模拟此类功能。一般地，将单核白细胞分离、悬浮于培养基中并在C02培养箱中与各 种刺激物或效应细胞孵育。然而，实施测定法的条件并不接近生理条件，原因是缺少不同细 胞群体之间的通讯、缺少来自红细胞的氧供应以及缺少与血浆蛋白和其它组分的复杂相互 作用。次级反应可能在冗长的孵育期间出现。此外，因繁琐的技术和巨大的实验对实验的 变化，这些体外试验较少应用于诊断检验中。RA的治疗集中在缓解疼痛、减少炎症、保护关节结构、维持功能和控制系统受累 上。选项包括阿司匹林和其它非留体类抗炎药物；抗风湿药如甲氨蝶呤、金化合物、D-青 霉胺、抗疟药和柳氮磺吡啶；糖皮质激素；TNF-a中和剂如英夫利昔单抗(infliximab)和 依那西普(etanerc印t)；和免疫抑制药如硫唑嘌呤、来氟米特、环孢霉素和环磷酰胺。因为 治疗选项的选择取决于对RA患者中疾病状态的评估，故开发评价疾病状态和监测疾病加 重的新方法将是受欢迎的。附图简述
图1A-1C显示了外周全血中人白细胞内各种TNFSF mRNA的Fc y R介导的基因表
达的量化结果。图2A-2C显示了与来自类风湿性关节炎患者和对照患者的未刺激的全血相比，所 述患者全血中由热聚IgG (HAG)刺激诱导的各种TNFSF mRNA水平的倍数增量。图3A-3C显示与来自类风湿性关节炎患者和对照患者的未刺激的全血相比，所述 患者全血中由热聚IgG (HAG)刺激诱导的各种TNFSF mRNA水平的比较性倍数增量。优选实施方案的详述本公开涉及应答于特定细胞性刺激物的白细胞中的差异性mRNA转录模式在评估 RA患者是否是特定疗法的良好候选者中的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在评估 施用于RA患者的疗法是否有效的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在筛选用于治 疗RA的候选药剂中的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在随时间评价患者内RA状 态和监控疾病加重中的用途。如上文所述，RA的病理学可能与RA患者免疫细胞中Fc Y R与IC之间的相互作用 相关。为了进一步评估这种可能性，使用热聚IgG(IC的经典模型HAG)来刺激健康成年对 照和RA患者内的人全血中的Fc y R。可以使用的其它刺激物包括豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯 (PMA)、植物凝集素(PHA)、小麦胚凝集素(WGA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、榴莲 凝素(jacalin)、墨角藻聚糖(fucoidan)、热聚IgE、热聚IgA和热聚IgM。将HAG直接添加至肝素化全血，并且评估肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)各种成员 的 mRNA 水平的改变。虽然存在多种？(；￥1 ，如？(；￥1 1、113、1113和 III(GeneBank UniGene数据库)，然而HAG充当可以与全部FcR亚型反应的通用刺激物。量化了因HAG刺激所致的 TNFSF诸成员的mRNA(见例如GeneBankUniGene数据库)水平的改变。如所述，FcyR介导的功能由IgG(IgGl-4)的Fc部分的4个亚类、多种类型的 Fc yR(Fcy RIa-c、Fc y RIIa-c和Fc y RIIIa_b)、不同亚群的携带Fc y R的白细胞和各种 下游细胞内信号传导级联组成。此外，这些蛋白质具有多种转录物变体和各种遗传多态性。 FcyR在疾病状态中的改变功能可以在任何水平发生。然而，可能做不到表征每个个体中 的每种因素。本公开构思了全血(伴有其附属离体(exvivo)条件)作为鉴定个体的筛选 工具的用途，其中所述个体为将从各种后续测定法(如单个细胞分析、各种基因的基因分 型和细胞内信号传导级联变异)获益的个体。因为已知IC诱导TNFSF-2( = TNF-a)和 TNFSF-15( = TLlA)mRNA，故以这种方式筛选全部肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员。所用方法如下。从GenBank中的UniGene数据库检索各种TNFSF基因的核苷酸序 列。针对每种基因的PCR引物由Primer Express (Applied Biosystem公司，福斯特城，加 利福尼亚州)和HYBsimulator (RNAture公司，欧文市，加利福尼亚州)(见Mitsuhashi等， Nature 367,759(1994) ；Hyndman 等，BioTechniques 20，1090 (1996))设计。序列汇总于下 面的表1中。寡核苷酸由IDT公司(科拉维尔市，爱荷华州)、筑波低聚服务公司(Tsukuba Oligo Service)(筑波市，日本)、Nipp0nEGT公司(富山市，日本)和北海道系统科学公司 (Hokkaido System Science)(札幌市，曰本)合成。表1引物序列 通过将PBS中的20mg/mL人IgG (西格玛公司，圣路易斯市)在63°C加热15分钟 (见 Ostreiko 等，Immunol. Lett. 15,311 (1987))制备热聚 IgG (HAG)。在 8 孔微量管板条 中，添加1. 4 yl HAG或对照(磷酸盐缓冲液)并贮存在_20°C直至使用。将70 yl新鲜的 肝素化全血(其保持在4°C直至用IC刺激)添加至各孔，一式三份，并关闭管盖在37°C孵 育4小时。在抽取血液的同一日处理血样。处理后，将每份血样冷冻贮存于-80°C直至使 用。按照Mitsuhashi 等，Clin. Chem. 52,634(2006)中所述方法从全血制备 mRNA 和 cDNA。也可以使用在通过引用并入本文的美国专利申请号10/796，298中所披露的方法。简 而言之，将50 yl全血转移至96孔过滤平板以捕获全血中的白细胞；将这些过滤平板置于收集平板上，并施加150 ill的5mM Tris，pH 7. 4。在4°C于120xg离心1分钟后，将50 yl血 样施加至各孔并立即在4°C于120xg离心2分钟，随后用300 u 1PBS洗涤各孔1次，在4°C于 2000xg离心5分钟。然后，施加60 yl裂解缓冲母液至过滤平板，随后在37°C孵育10分钟， 其中所述的裂解缓冲母液补充有1 % 2-巯基乙醇(Bio Rad公司，埃库莱斯(Hercules)，加 利福尼亚州，美国)、0. 5mg/ml蛋白酶K(PierCe公司，罗克福德，伊利诺斯州，美国)、0. lmg/ ml鲑鱼精DNA(5Prime Eppendorf/Brinkmann，韦斯特伯里，纽约州，美国)、0. lmg/ml大肠 杆菌tRNA(西格玛公司)、10mM每种特异性反向引物的混合物和标准RNA34寡核苷酸。随后 将过滤平板置于固定有寡(dT)的微孔板(GenePlate，RNAture公司制)(见Mitsuhashi等， Nature 357,519(1992) ；Hamaguchi 等，Clin. Chem. 44，2256 (1998)(两篇文献均通过引用 并入本文))上并在4°C于2000xg离心5分钟。在4°C贮存过夜后，将微孔板在4°C用100 yl 空白的裂解缓冲液洗涤3次，随后在4°C用150 ill洗涤缓冲液(0. 5M NaCl, lOmMTris, pH 7. 4，ImM EDTA)洗涤3次。通过添加含有1 X RT缓冲液、1. 25mM每种dNTP、4单位rRNasin 和80单位MMLV逆转录酶(Promega公司)(无引物)的缓冲液并在37°C孵育2小时，直接 在各孔内的30iU溶液中合成cDNA。特异性引物引发的cDNA存在于溶液中，并且寡(dT) 引发的 cDNA 仍固定在微孔板内(见 Hugh，Crit. Rev. Immunol. 1, 321 (1981)) 对于 SYBR Green PCR(见(通过引用并入的)Morrison 等，Biotechniques 24，954 (1998))，将 cDNA 在水中稀释4倍，并将4 ill cDNA溶液直接转移至384孔PCR平板，向其中施加5 u 1 iTaq SYBR主混合物(Bio Rad公司，埃库莱斯，加利福尼亚州)和1 yl寡核苷酸混合物(15 u M 每种正向引物和反向引物)，然后在raiSM 7900HT(ABI公司)中实施PCR :95°C、10分钟的 1个循环；随后的95°C、30秒和60°C、1分钟的45个循环。也可以使用TaqMan PCR ；在这种 情况下，将cDNA溶液直接转移至384孔PCR平板，向其中施加5 yl TaqMan通用主混合物 (ABI公司)和1 ill寡核苷酸混合物(15 u M每种正向引物和反向引物、和3-6 u M TaqMan 探针)至所述384孔PCR平板，然后在PRISM 7900HT (ABI公司)中实施PCR :95°C、10分钟 的1个循环；随后的95°C、30秒，55°C、30秒和60_65°C、1分钟的45个循环。分别扩增每 种基因。使用1 X RT缓冲液作为阴性对照以证实在SYBR Green PCR条件下无引物二聚体 生成。此外，在每种情况中分析解链曲线以证实PCR信号从单一 PCR产物衍生。通过分析软 件(SDS、ABI)确定循环阈值(Ct)，该阈值是生成某个量的PCR产物(荧光)所需要的PCR 循环次数。HAG处理的三等份样品的Ct值分别减去PBS对照的平均Ct值以计算ACt，并 且通过假设每个PCR循环的效率是100%，将与未刺激样品相比的刺激样品的倍数增量(下 文中简称为“倍数增量”)计算为2~(-ACt)。图1A-C显示外周血白细胞中FcyR-介导的mRNA表达。每个数据点代表来自全 血三等份试样的均值+标准偏差(图1A)或均值(图IB、1C)。图1A显示了表达的动力学的分析结果。70 iU每份肝素化全血的三等份试样 与PBS或200 u g/ml热聚IgG(HAG)混合并在37°C孵育0_8小时。随后量化TNFSF-2 (= TNF- a ,# )、TNFSF-8 ( ▲ )、TNFSF_15 ( = TL1A, )禾P 3 -肌动蛋白(A )mRNA 并如上文 所述计算倍数增量(y_轴)。如图1A中所示，TNFSF-2的诱导是极迅速的，约30分钟具有 峰，随后在4小时具有巨大持续峰，与TNFSF-2相反，TNFSF-8 (图1A，▲)和TNFSF-15 (= TL1A)(图1A，4)缓慢增加，在约4小时具有峰。持家基因(0-肌动蛋白)在与HAG孵育8小时期间未被诱导(图1A，A )。HAG孵育因此固定于4小时以分析TNFSF-2、-8和-15mRNA。 这种短时孵育(4小时)是基于mRNA的测定法的优势之一，因为蛋白质检测要求至少过夜 孵育以鉴定药物诱导的改变。图1B显示剂量反应。将肝素化全血与0-800 u g/ml HAG在37°C孵育4小时，随后 量化各种mRNA(每种符号如图1A中定义)。HAG诱导的TNFSF-2、TNFSF-8和TNFSF-15从 10 u g/ml HAG以剂量依赖性方式被证实并在100-200 u g/ml处饱和，同时0 -肌动蛋白未改变。图1C显示1周内从相同个体两次抽取血液并且量化HAG诱导的TNFSF-2 ( )、 TNFSF-8 ( ▲ )、TNFSF-15 ( )mRNA和外部对照mRNA(合成性RNA34)(〇)时所获得的结 果。如图1C中所示，诱导作用是可重复的并且8位健康个体当中在第1日与第2日之间的 r2值是0. 927 (n = 32，p < 0. 001)(图1C)。掺混到裂解缓冲液中的外部合成性RNA (RNA34， 图1C，〇)的倍数增量总是低于1. 5，表明在每个实验中正确实施了该测定法。虽然用于mRNA分析的实际血液体积是50iU，然而该测定法使用每个反应70iU 全血(20 yl是从8孔板条转移至过滤平板期间的裕量)。因此，每个试验消耗少至 420 u 1 ( = 70iU/孔X2(HAG和PBS) X3(三等份))全血。从50 yl全血/孔中，通过 RT-PCR (30 u 1 cDNA 加 90 ii 1 水(1 4 稀释),4u 1 cDNA/PCR)量化 30 种不同的 mRNA。甚 至从1 4的cDNA稀释物中，实现了对各种TNFSF mRNA的测量。不同于基于血清的试验 (其中血清体积因个体之间血细胞比容的变异而是不可预测的)，全血容易操作。表2显示了外周全血中人白细胞内FcR-介导的TNFSF mRNA的基因表达的分析结 果。所示结果表述为“应答”受试者的百分数，其中所述的“应答”受试者定义为在应答HAG 刺激时展示大于2的倍数增量的那些试者。使用x 2检验来比较健康受试者与RA患者之 间就每种TNFSF mRNA的阳性应答发生率。由于存在两种群体(阳性和阴性应答)，故t_检 验仅施用于倍数增量大于2的受试者。表2.免疫复合物诱导的TNFSF mRNA表达
TNFSF-1
TNFSF-2
TNFSF-3
TNFSF-4
TNFSF-5
TNFSF-6
TNFSF-7
TNFSF-8
TNFSF-9
TNFSF-12
TNFSF-13
TNFSF-13B
TNFSF-14
TNFSF-15
7/39
15/40
2/40
1/40
0/40
1/40
8/40
25/40
7/36
0/40
0/40
1/40
19/40
38/38
8 8 o 3 9 800 13530326100341
2/16 30/59 4/60 4/57 0/61 7/61 6/58 25/61 7/52 1/26 0/26 0/24 20/57 58/61
13 51
0 11 10 41 13 4 0 0 35 95
n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s* 倍数增量> 2. 0如表2中所示，HAG在全部健康捐助者中诱导出TNFSF_15( = TLlA)mRNA(倍数 增量>2)并在61位RA患者中的59位患者内诱导出TNFSF-15。在离体条件，这些结果 重现了最近发表的报告(见 Prehn 等，The T cell costimulator TL1A isinduced by FcgammaR signaling in human monocytes and dendritic cells (T 细胞共刺激物 TL1A 由人单核细胞和树突细胞中的Fc y R信号传导作用诱导)，J. Immunol. 178,4033(2007)； Cassatella Soluble TNF-like cytokine(TL1A1)production by immune complexes stimulated monocytes in rheumatoid arthritis ( ^^IKMt^^Ti^.'i^-^
合物刺激的单核细胞所进行的可溶性TNF样细胞因子(TL1A1)的产生)，J. Immunol. 178， 7325(2007)(这两篇文献均通过引用并入本文))。已知HAG也诱导TNFSF-2 ( = TNF- a ) mRNA (见 Satoh 等，Endogenous production of TNF in mice with immune complex as a primer (以免疫复合物作为引子在小鼠中内源性产生TNF)，J. Biol Response Mod. 5， 140 (1986) ；Chouchakova等，Fc gamma Rill-mediated production of TNF-alphainduces immune complex alveolitis independently of CXC chemokine generation(FcyRIII介 导的TNF-a的产生诱导了与CXC趋化因子生成无关的免疫复合物肺泡炎)，J. Immunol 166, 5193(2001)(这两篇文献均通过引用的方式并入))。然而，如表2中所示，并未在全部个 体中发现TNFSF-2诱导，并且超过一半的受试者无应答。此外，HAG刺激作用在超过1/3的对照和 RA 患者中诱导出 TNFSF-8 ( = CD153, CD30 配体)和 TNFSF_14( = LIGHT)mRNA, 并在一些患者中诱导出TNFSF-1(=淋巴毒素a，LTA)、TNFSF-3 (=淋巴毒素3，LTB)、 TNFSF-4 ( = CD252，CD134 配体)、TNFSF_6 ( = Fas 配体)、TNFSF_7 ( = CD70，CD27 配体)和 TNFSF-9,而在 TNFSF-5 ( = CD154, CD40 配体)、TNFSF_12 ( = TWEAK)、TNFSF_13 ( = CD256) 和TNFSF-13B (=⑶257)方面显示微小诱导作用或不显示诱导作用。这种个体-对-个体 变异或距离刺激开始4小时处存在应答者和非应答者，是有意义的，因为如图1A和1B中所 示，与200i!g/ml HAG孵育4小时，实现饱和。这个离体测定法预期可用作各种后续测定法 的筛选平台。针对类风湿因子(RF)(2型(单克隆IgM至多克隆IgG)或3型(多克隆IgM至 多克隆IgG)冷球蛋白)的试验是在疑似RA情况下的标准诊断方法。因HAG刺激造成的 TNFSF-2、TNFSF-8和TNFSF-15诱导的结果，通过在RF水平上分解以查找相关性。结果在图 2A-2C中显示。分别采用< 30、30-100和> 100IU/ml RF，从40位健康成年志愿者(对照) 禾口 61 位 RA 患者中量化 HAG 诱导的 TNFSF-2 (A)、TNFSF_8 (B)和 TNFSF-15 (C)mRNA。因为观 察到两个群体(倍数增量> 2的应答者和非应答者)，t-检验仅应用至应答者群体。借助 x 2检验的分析没有在这四个组之间揭示显著差异。如图2中所示，借助RF量对RA患者的分类揭示TNFSF诱导作用的显著差异。如 图2C中所示，RF > 100IU/ml的RA患者中的TNFSF-15的倍数增量分别显著低于对照(p =0. 01)和RF < 30IU/ml的RA患者(p = 0. 04)的TNFSF-15的倍数增量。这可能因以 下事实产生RF是天然形式的IC并在离体添加HAG时存在于全血中。大部分RA患者维持 对HAG刺激的应答。这表明即便长时间暴露于RF，RA患者外周血中的循环性白细胞仍能够 激活IC。具有高RF的RA患者中所示的降低的TNFSF-15应答可能表示外周血白细胞中的 TNFSF-15受体功能或多或少地下调了。就通过RF激活Fc Y R而言，作出TNFSF_15mRNA的基线水平是否因连续暴露于RF 而升高的评估。就Ct方面，通过计算TNFSF-15超过TNFSF-5、-13和-13B的相对表达而测 量了结果，原因是，如表2中显示，这三种TNFSF mRNA不受HAG诱导。然而，在全部三种计 算中发现RA患者中的基线水平并没有显著不同于对照受试者。图3显示如下时所获得的结果针对对照(〇)和RA ( )，通过分别将TNFSF-2 和-8 (A)、TNFSF-2和-15 (B)及TNFSF-8和-15 (C)进行比较，将图2中所示结果转换成x_y 图。如图3C中所示，TNFSF-15的倍数增量与RA( )和健康受试者(o)中TNFSF-8的倍数 增量良好地相关，r2 值分别是 0. 48(n = 61，p < 0. 001)和 0. 27 (n = 38，p < 0. 001)。然 而，因为TNFSF-8的倍数增量低于TNFSF-15的倍数增量并且阳性应答者人数小于TNFSF-15 阳性应答者人数，故没有观察到TNFSF-8在对照与RA之间的显著差异，甚至当RA患者通过 RF的量进行分类时亦如此(图2B)。然而，如图2A中所示，与TNFSF-15相反，RF < 30和 < 100的RA患者中TNFSF-2的倍数增量显著(p < 0. 03,0. 05)高于健康受试者的TNFSF-2 的倍数增量。TNFSF-2的倍数增量不与TNFSF-8的(图3A)(对照和RA的r2分别等于0. 03 和0. 02)和TNFSF-15 (图3B)(对照和RA的r2分别等于0. 11和0. 003)的倍数增量相关， 这表明TNFSF-2和TNFSF-8/-15从不同途径衍生。这一点进一步由图1A中所示的证据证 实，其中TNFSF-2与TNFSF-8/-15之间的动力学是不同的。TNFSF-2 ( = TNF- a )是参与RA发病机理的炎性细胞因子之一，并存在于RA中的滑膜液内(见 Saxne 等人，Detection of tumor necrosis factor alpha but nottumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum(^^K ■十牛关节炎患者滑腊液和血清中检测丨肿瘤坏死因子a而非肿瘤坏死因子P). Arthritis Rheum. 31,1041(1988)(该文献通过引用并入本文))。已经通过原位杂交显示TNF-a转录 物存在于滑膜组织巨噬细胞中(见MacNaul等，Analysis ofTL-1 and TNF~ a lpha gene expression in human rheumatoid synoviocytes andnormal monocytes by in situ hybridization (诵i寸原位杂夺分析人类风湿滑腊细胞JP if常单核细胞』中的TL-1和TNF- a 基因的表汰),J. Immunol. 145,4154(1990)(该文献通过引用并入本文))。此外，阻断 TNF-a作用的抗TNF-a单克隆抗体(英夫利昔单抗，瑞米凯德(Remicade))和可溶性TNF 受体(依那西普，恩博(Enbrel))已经在RA患者中显示临床效力(见Weaver,The impact of new bioloRicals in thetreatment of rheumatoid arthritis (新生物制齐[j在治疗 类风湿件关节炎中的影响).Rheumatology (牛津)43增刊3 :iiil7_iii23 (2004)(该文献 通过引用并入本文))。因此，在我们的离体测定法中RA患者内所示升高的HAG-诱导的 TNF-a诱导作用是相当合理的。当然，mRNA诱导并不总是对应于蛋白质合成和后续的生物 学及临床结果，原因在于改变的剪接作用、翻译后修饰和抑制性级联的共激活。然而，这种 离体刺激作用将有效作为各种后续分子测定法(如受体和相关蛋白质的遗传多态性)的起 点筛选工具。我们也在HAG-诱导的TNFSF-2mRNA的应答者(倍数增量> =2)和非应答者(倍 数增量< 2)之间比较了患者的临床特征。结果在表3中显示。表3，在HAG-诱导的TNFSF-2方面的应答者和非应答者的特征 * :FI 倍数增量，# x 2检验如表3中所示，在RF < 30IU/ml组中的应答者群体显著地(p = 0. 04)比非应答 者群体年轻。在全部RF组中应答者与非应答者之间的其它临床参数，如年龄、性别、疾病持 续期、CRP、肿胀关节个数和痛的关节个数没有显著不同(表3)。有趣的是，当合并全部患 者时，在应答者群体中的用生物药剂(如抗TNF-a单克隆抗体或可溶性TNF受体)治疗的 患者数显著地(P = 0. 02)高于在非应答者群体中的对应的患者数(表3)。这些抗TNF-a 剂的使用可能通过未鉴定的负反馈机制而增强Fc Y R介导的TNF- a功能，或此类患者可能 是生物制剂疗法的良好候选人。对于在HAG诱导的TNF- a mRNA方面显示应答的RA患者而 言，TNF-a更有可能明显地参与于RA病理学中，并且因而这些患者更有可能是这些生物药 剂的良好候选人。由于生物药物极其昂贵，并非在全部患者中有效，并偶然显示不良的副作 用，因而鉴定有可能应答于这些药物的患者将具有作为个体化用药的临床用途。
通常已经使用细胞毒性检测法来研究因免疫系统活性(如认为存在于RA中的免 疫系统活性)造成的实际细胞死亡。细胞毒性检测法一般通过以各种比率将载有51Cr的 靶细胞与效应细胞一起孵育，然后量化从死亡或受损细胞释放的51Cr放射性的量而实施 (见Dunkley等，J. Immunol. Methods 6，39 (1974))。在某些情况下，已将放射性物质替换 为非放射性物质，如荧光测量物质(见Kruger-Krasagakes等，J. Immunol. Methods 156， 1(1992))，但基本原理不变。细胞毒性检测法的结果因而反映实际的细胞死亡。然而，细胞毒性检测法在非生理性实验条件下进行，并且在此类研究的过程中难 以评估复杂的细胞-对-细胞和细胞-对-血浆的相互作用。此外，细胞毒性检测法不指 示哪种TNFSF成员导致细胞死亡。一旦效应细胞识别靶细胞，则效应细胞的功能不仅是杀 死靶细胞，而且也是召集其它效应细胞，因而单种效应细胞不足以杀死多种靶细胞。这种召 集功能认为由趋化因子的释放代表。经典的细胞毒性检测法不会揭示，由效应细胞释放的 此类趋化因子的身份。然而，本公开中所述的测定法系统能够同时鉴定效应细胞中许多类 型的基因表达。相对于使用在培养基中的已分离的白细胞而言，优选使用全血，因为全血比分离 的白细胞具有更多生理性，并且可以筛选全种群的白细胞。较长时间的全血孵育可能产生 额外的人为结果(artifact)。因而，理想方式是在在短时间孵育期间通过体外(in vitro) 至离体(ex vivo)的转换来鉴定全血中的早期的杀手细胞(killer)信号和召集信号。mRNA 的转录是比蛋白质合成或最终生物学结果要早的事件。因而，mRNA是合乎逻辑的标靶。由于本方法使用全血，故该方法可以作为RA的早期诊断试验用来评价对TNFSF失 活疗法的可能应答性并用来监测治疗性应答。具体而言，在用于确定患有RA的人是否有可 能应答于疗法(所述疗法以应答于T细胞刺激时所转录的mRNA为标靶)的优选实施方案 中，如上文所述，从RA患者获得全血并使血液样品经历HAG刺激并任选地经历对照刺激物 (PBS)。可以如上所述测量样品中TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF_15mRNA的量。在HAG刺激后 这些mRNA中的一种或多种mRNA的水平显著升高(如所示，例如大于2的倍数增量)的RA 患者，是以这些mRNA为标靶的疗法的良好候选者。此外，在评价RA治疗(该治疗以患者中TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF_15mRNA中的 一种或多种为标靶)的有效性的方法的优选实施方案中，在启动所述治疗之前获得了 HAG 刺激后全血中所述mRNA的量与对照刺激后所述mRNA的量的第一比率。在启动所述治疗之 后，获得了 HAG刺激后全血中所述mRNA的量与对照刺激后mRNA的量的第二比率。所述比 率的显著差异，如在第一比率大于第二比率的情况下，可以指示该治疗的有效性。此类疗法 可能包括例如施用英夫利昔单抗或依那西普。重要地，这种离体方法可以用于筛选如下化合物，所述化合物抑制由抗FcR介导 的TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF_15mRNA中一种或多种mRNA的表达，并且尤其抑制由抗FcR 介导的已知参与疾病病理学的TNFSF-2的表达。此类化合物将是重要的靶药物，因为这些 新的候选药物将在转录水平阻断白细胞中的mRNA产生。这将为针对RA的药物开发提供新 策略。在使用所公开的系统筛选药物化合物并因而鉴定治疗RA的推定性药剂 (putative agent)的方法的实施方案中，从作为应答者的RA患者获得全血，其中应答者是 如下个体，所述个体的白细胞在暴露于T细胞刺激如HAG时显示出与RA相关的mRNA的水平增加至少2倍。计算了 HAG刺激后受试者全血中mRNA的量与对照刺激后mRNA的量的第一 比率。来自所述受试者的其它全血样品在体外暴露于药物化合物，并且随后如上所述被差 异性刺激。随后计算这些被暴露的样品的、HAG刺激后全血中mRNA的量与对照刺激后mRNA 的量的第二比率。这两个比率的显著差异，如在第一比率大于第二比率的情况下，可以指示 该药物化合物是作为RA潜在治疗剂而进一步研究的候选物。 此外，在通过测量从RA患者获得的包含白细胞的样品中的TNFSF-2、TNFSF-8或 TNFSF-15mRNA中的一种或多种mRNA的水平而监测RA患者的疾病状态的方法的优选实施 方案中，在首次获得了在使用热聚IgG抗体或另一种刺激物体外刺激T细胞后全血中mRNA 的量与体外对照刺激后mRNA的量的第一比率。在首次之后的第二次，获得了在体外刺激T 细胞后全血中mRNA的量与体外对照刺激后mRNA的量的第二比率。所述比率的显著差异可 以指示疾病状态的改变。例如，当第二比率大于第一比率，这可以表示疾病加重，而较大的 第一比率可以指示该疾病已经减轻。
权利要求
确定类风湿性关节炎患者是否有可能应答于抗TNF疗法的方法，包括在体外刺激来自所述患者的第一样品中的白细胞的Fc受体；测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物；测量第二样品中所述mRNA的量；确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的比率；和如果所述比率是约2∶1或更大，则确定患者有可能应答于所述疗法。
2.权利要求1的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
3.权利要求2的方法，其中刺激第一样品中的白细胞包括将热聚人IgG与第一样品相互混合。
4.权利要求2的方法，其中第一样品和第二样品中的至少一个包含全血。
5.权利要求2的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
6.权利要求2的方法，其中所述疗法包括施用选自由英夫利昔单抗和依那西普组成的 组中的药剂。
7.确定类风湿性关节炎患者是否有可能应答于疗法的方法，所述疗法为抑制抗 FcR_介导的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的表达的疗法，所述方法包 括在体外刺激来自所述患者的第一样品中的白细胞的Fc受体；测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物； 测量第二样品中所述mRNA的量；确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的比率；以及 如果所述比率是约2 1或更大，则确定患者有可能应答于疗法。
8.权利要求7的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
9.权利要求8的方法，其中刺激第一样品中的白细胞包括将热聚人IgG与第一样品相互混合。
10.权利要求8的方法，其中第一样品和第二样品中的至少一个包含全血。
11.权利要求8的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
12.鉴定用于治疗类风湿性关节炎的推定性药剂的方法，包括获得来自人的包含白细胞的第一、第二、第三和第四样品，其中所述样品的白细胞在暴 露于热聚人IgG时在编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的转录方面显示出 至少1. 5倍增加；在体外刺激第一样品中的白细胞的Fc受体； 在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物； 测量在刺激后的第一和第二样品中mRNA的量； 使第三和第四样品暴露于该药剂； 在体外刺激在暴露后的第三样品中的白细胞的Fc受体；在体外使第四样品中的白细胞暴露于对照刺激物； 测量在刺激后的第三和第四样品中mRNA的水平；以及比较从第一样品获得的数据与从第三样品获得的数据，并且比较从第二样品获得的数 据与从第四样品获得的数据，其中比较的数据之间的显著差异预示推定性药剂。
13.权利要求12的方法，其中在测量第一和第二样品中mRNA的量后，计算第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA 的量的第一比率；在测量第三和第四样品中mRNA的水平后，计算第三样品中mRNA的量与第四样品中 mRNA的量的第二比率；比较第一比率与第二比率，其中比率的显著差异预示推定性药剂。
14.权利要求13的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
15.权利要求14的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所 述样品相互混合。
16.权利要求14的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
17.权利要求14的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
18.权利要求14的方法，其中比率的显著差异是第一比率大于第二比率。
19.权利要求14的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
20.权利要求12的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
21.权利要求20的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所 述样品相互混合。
22.权利要求20的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
23.权利要求20的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
24.权利要求20的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
25.评价患者的类风湿性关节炎的状态的方法，包括在体外刺激首次从患者获得的且包含白细胞的第一样品中的白细胞的Fc受体； 测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；在体外使首次从患者获得的包含白细胞的第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物； 测量在刺激后的第二样品中mRNA的量； 确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的第一比率； 在体外刺激在首次后第二次从患者获得的包含白细胞的第三样品中的白细胞的Fc受体；测量在刺激后的第三样品中mRNA的量；在体外使第二次从患者获得的包含白细胞的第四样品中的白细胞暴露于对照刺激物；测量在刺激后的第四样品中mRNA的量；确定第三样品中mRNA的量与第四样品中mRNA的量的第二比率；以及比较第一比率与第二比率，其中第一比率与第二比率的显著差异预示疾病状态的改
26.权利要求25的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
27.权利要求26的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所 述样品相互混合。
28.权利要求26的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
29.权利要求26的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
30.权利要求26的方法，其中比率的显著差异是第二比率大于第一比率，那么疾病状 态的改变是该疾病加重。
31.权利要求26的方法，其中比率的显著差异是第一比率大于第二比率，那么疾病状 态的改变是该疾病减轻。
32.权利要求26的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
全文摘要
本发明公开了用于预测患者对涉及改变肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)-2、TNFSF-8或TNFSF-15的表达的类风湿性关节炎疗法的应答性的方法。也公开了用于监测这种疗法的有效性的方法。此外，公开了筛选用于治疗类风湿性关节炎的化合物的方法。也公开了随时间监测类风湿性关节炎患者中疾病状态的方法。
文档编号C12Q1/68GK101855367SQ200880116017
公开日2010年10月6日 申请日期2008年11月11日 优先权日2007年11月14日
发明者三桥将人, 井筒浩, 太田修二, 小原和彦, 远藤胜也 申请人:日立化成工业株式会社;日立化成研究中心公司