专利名称：在重组酵母中生产二羧酸的制作方法
在重组酵母中生产二羧酸本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转 化为延胡索酸的酶，本发明还涉及用于生产二羧酸的方法。二羧酸例如延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转 化为1，4_ 丁二醇(BD0)、四氢呋喃和丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接 琥珀酸和BD0制造的聚酯聚合物。琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并 且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使 用可再生的原料作为碳源。已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia 或 Succinimonas sp.能生产玻拍酸。对 这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。W02007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母， 用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)对所 述酵母加以转化。尽管琥珀酸的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微 生物。本发明的一个目的是用于生产二羧酸如延胡索酸和琥珀酸的替代性酵母。根据本发明用编码下述核苷酸序列的重组酵母实现了这一目的，所述核苷酸序列 编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。惊讶地发现，通过根据本发明的重组酵母，生产 出的二羧酸如延胡索酸和/或苹果酸的量与野生型酵母相比有所提高。在本文中使用时，根据本发明的重组酵母被定义为下述细胞，所述细胞含有天然 不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质，或所述细胞经天然不存在于所述酵母中 的核苷酸序列和/或蛋白质转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额 外一个或多个拷贝。野生型酵母在本文中被定义为重组酵母的亲本酵母。优选地，编码酶的核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成延胡索酸的酶在胞质溶 胶中有活性。催化苹果酸转化成延胡索酸的酶优选地具有延胡索酸酶活性，优选地所述酶为EC 4. 2. 1. 2的延胡索酸酶。催化苹果酸转化成延胡索酸的酶可以来自于任何合适的起源，例如细菌、酵母、真 菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的酶来自于Rhizopus oryzae。显示Rhizopus oryzae的异源fumR基因在Aspergillus niger中的表达在氧受 限的条件下不导致琥珀酸生产(PhD thesis, 2006 ff. A. de Jongh, Biocentrum Technical University of Denmark)。令人惊讶的是，表达本发明的异源延胡索酸酶的酵母在氧受限 的条件下生产与野生型酵母相比更大量的琥珀酸。用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系 时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子即由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所 述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。 异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组 生产的。优选地，根据本发明的酵母是包含下述核苷酸序列的酵母，所述核苷酸序列编码 催化苹果酸转化成延胡索酸的酶，其中所述酶与SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3的氨基酸 序列、优选与SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有至少70%、75%，优选至少80%、85%、90%、 92%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性，优选所述酶包含 SEQ ID NO :3。序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽 或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在被比较的序 列的整个长度上比较序列。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相 关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性的 方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性的优选的计算机程序 方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual, Altschul, S.，等， NCBI NLM NIHBethesda,MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为缺 口开放11. 0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。使用BLASTP的核酸序列比较的优选参数为缺 口开放11. 0，缺口延伸1，DNA完全矩阵(DNA同一性矩阵)。根据本发明编码在胞质溶胶中催化苹果酸转化成琥珀酸的酶的核苷酸序列也可 以通过它们在中度杂交条件或优选严格杂交条件下与编码SEQID NO :1或SEQ ID NO 3酶 的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中定义为下述条件所述条件允许 至少约25个、优选约50个核苷酸、75或100个、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在 约65°C的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC(氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相 当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在65°C下，在包含约0. 1M或更少盐、优选0. 2x SSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即 至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些 条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的序列的特异性杂交。中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200 或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6xSSC)或 具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及室温下，在包含约1M盐的溶液(优 选6xSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即 至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少进行1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。 这些条件通常会允许具有多达50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当 能够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因 为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸 可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特 定的序列及其互补序列。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。 该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸 的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物 的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完 全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰， 所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的Y "羧基化、羟基化和 ADP-核糖基化。在本文中使用时，术语“酶”被定义为在细胞例如酵母细胞中催化(生物)化学反 应的蛋白质。为了提高引入的酶在本发明的酵母中以活性形式表达的可能性，可以改变相应 的编码核苷酸序列，从而使其密码子选择针对选用的酵母细胞而优化。用于密码子优化 的若干方法是本领域已知的。针对酵母优化核苷酸序列密码子选择的一种优选的方法是 W02008/000632中公开的密码子对优化技术。密码子对优化是在宿主细胞中生产多肽的一 种方法，其中在其密码子使用方面(特别是使用的密码子对)，对编码多肽的核苷酸序列进 行了修饰、，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或提高的多肽生产。密码子对 被定义为编码序列中两个相继三联体(密码子)的集合。通常，编码酶(例如催化苹果酸转化成延胡索酸)的核苷酸序列与使得相应核苷 酸序列在本发明酵母中充分表达的启动子可操作地连接，从而赋予酵母生产延胡索酸和/ 或琥珀酸的能力。在本文中使用时，“可操作地连接”是指处于功能性关系中的多核苷酸元件(或编 码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被放置为与另一核酸序列处于功能性关系时，其 是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子能影响编码序列的转录，则其与编码序 列可操作地连接。在本文中使用时，术语“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因 转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，并且在结构上通过DNA-依赖型 RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在而被识 别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是 在环境或发育调节下有活性的启动子。能够用于实现编码酶(例如催化苹果酸转化成延胡索酸的酶)的核苷酸序列表达 的启动子对编码待表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的 核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。优选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源 的，即内源的。本文上下文中合适的启动子既包括组成型又包括诱导型的天然启动子以及经改 造的启动子，所述启动子是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是 GAL7、GAL10 或 GAL 1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI和A0X1。其它合适的启动子包括？0(、6 01、？61(1、1￡ 1和TDH。通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在真核细胞中有功能 的任何终止子。优选的终止子得自宿主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知 的。优选地，这类终止子与下述突变组合，所述突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA 衰退(见例如 Shirley 等，2002，Genetics 161 :1465_1482)。在一个优选的实施方案中，过量表达编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶(例如 延胡索酸酶)的核苷酸序列，从而通过根据本发明的重组酵母实现提高的延胡索酸和/或 琥珀酸生产。本领域可获得多种手段用于在本发明的酵母细胞中过量表达编码酶的核苷酸序 列。具体地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合 额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过 引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过量表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用 (强)组成型启动子实现根据本发明的酶的过量表达。核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的酵母可包 含单个、但是优选地包含多个拷贝的编码延胡索酸酶的核苷酸序列，例如通过多拷贝的核 苷酸构建体来实现。核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色 体复制序列序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母或pKDl质粒(Gleer 等，1991，Biotechnology 9:968-975)或 AMA 质粒(Fierro 等，1995，Curr Genet. 29 482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进酵母细胞的基因组中。进 入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，但是优选地，可以如本领域所公知的， 通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中(见例如W090/14423、EP-A-0481008、 EP-A-0635 574 和 US 6，265，186)。在一个优选的实施方案中，在编码核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成延胡索 酸的酶在胞质溶胶中有活性。就真核细胞对延胡索酸和/或琥珀酸的高生产力而言，酶的 胞质溶胶活性是优选的。编码催化苹果酸转化成琥珀酸的酶的核苷酸序列可包含过氧化物酶体或线粒体 靴向信号，例如通过 Schliiter 等，Nucleic acid Research 2007，Vol25，D815-D822 公开 的方法所确定的。在酶包含靶向信号的事件中，优选地，根据本发明的酵母包含截短形式的 酶，其中所述靶向信号被去除。根据本发明的酵母优选地属于Saccharomyces、Pichia、Kluyveromyces或 Zygosaccharomyces 属之一。更优选地，真核细胞是 Saccharomycescerevisiae、 Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Pichiastipidis、Kluyveromyces marxianus、K. lactis、K. thermotolerans 或 Zygosaccharomyces bailii。优选地，酵母是Saccharomyces cerevisiae,优选是包含 SEQ ID NO 4 的 Saccharomyces cerevisiae。除了编码催化苹果酸转化成延胡索酸的本发明酶的核苷酸序列以外，根据本发明 的重组酵母可包含其它遗传修饰，例如同源核苷酸序列中的突变、缺失或断裂，和/或用编 码同源或异源的下述酶的核苷酸序列转化，所述酶在细胞中催化反应，导致提高的朝向延
6胡索酸和/或琥珀酸的通量。例如可有利地引入、遗传修饰和/或过量表达下述异源和/ 或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列编码i)催化磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸转化成草酰乙 酸的酶；ii)催化从草酰乙酸转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶；或iii)催化延胡索酸转化成 琥珀酸的延胡索酸还原酶。优选地，i)、ii)和iii)的酶在胞质溶胶中表达。胞质溶胶表 达可以如本文之前所述，通过线粒体或过氧化物酶体靶向信号的缺失或修饰来实现。另外， 如上文所述的分子DNA技术(例如过量表达和密码子优化)也适用于这些核苷酸序列。可以用催化C3到C4碳分子反应的任何合适的核苷酸序列转化或遗传修饰酵母， 所述反应例如为磷酸烯醇丙酮酸(PEP，C3)到草酰乙酸(0AA，C4)和丙酮酸(C3)到0AA或 苹果酸。合适的酶是催化PEP转化成0AA的PEP羧激酶(EC 4. 1. 1. 49，EC 4. 1. 1. 38)和 PEP羧化酶(EC 4. 1. 1. 31)；催化丙酮酸反应成为0AA的丙酮酸羧化酶(EC 6. 4. 1. 1.)；或 催化丙酮酸反应成为苹果酸的苹果酸酶(EC 1. 1. 1. 38)。优选地，根据本发明的酵母中的内源延胡索酸酶活性被降低，例如通过缺失，断裂 或突变编码酵母内源延胡索酸酶的基因来实现。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞还包含同源或异源的苹果酸脱氢 酶(MDH)。优选地，通过本文所述本领域已知的方法通过过量表达来提高苹果酸脱氢酶的活 性。优选地，如例如W02007/061590中所述，在胞质溶胶中表达MDH。优选地，根据本发明的酵母是其中至少一种编码醇脱氢酶的基因没有功能的酵 母。无功能的醇脱氢酶在本文中用于描述下述酵母，其中通过突变、断裂或缺失，例如通过 Gueldener 等 2002，Nucleic Acids Research, Vol. 30，No. 6，e23 所公开的方法，使编码醇 脱氢酶的基因失活。优选地，所述酵母是Saccharomyces cerevisiae，其中编码醇脱氢酶的 一个或多个adhl和/或adh2基因失活。优选地，根据本发明的酵母还包含至少一种编码无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶的 基因。无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶在本文中用于描述下述酵母细胞，其中通过突变、断裂 或缺失使编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因失活，导致与野生型酵母相比甘油形成降低。在一个优选的实施方案中，根据本发明的酵母可以能够在本领域已知的任何合适 的碳源上生长，并将其转化为二羧酸，例如延胡索酸和/或琥珀酸。酵母可以能够直接转化 植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核 酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的酵母细胞表达将纤维素转化 为葡萄糖单体和将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体的酶，例如纤维素酶(内切纤维素 酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶 转化为葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。酵母表达 这类酶的能力可已通过对酵母的遗传修饰获得。优选地，酵母能够转化选自下组的碳源， 所述组由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉子糖(raffinose)和甘油组 成。在另一方面中，本发明涉及用于制备选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，包 括在存在合适的发酵培养基时发酵根据本发明的酵母。合适的发酵培养基是本领域技术人 员已知的。优选地，根据本发明的方法中生产的二羧酸是琥珀酸。发现在生产选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法中，使用根据本发明的酵母 是有利的，因为与野生型酵母相比能生产更高量的琥珀酸和/或延胡索酸。优选地，根据本发明的酵母与野生型酵母相比，生产至少1. 1、优选至少1. 2,1. 3,1. 4,1. 5或至少2倍的琥 珀酸和/或延胡索酸。根据本发明的方法可以在需氧和缺氧的条件下进行。优选地，所述方法在缺氧条 件下或微需氧或氧受限的条件下进行。缺氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，其 在无氧时进行，或其中基本无氧(优选地少于5、2. 5或lmmol/L/h)被消耗，并且其中有机 分子发挥电子供体以及电子受体两种作用。氧受限的发酵方法是其中氧消耗受从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程 度是通过进入气流的量和组成以及使用的发酵装置的实际混合/质量转移性能决定的。优 选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率至少约为5. 5mmol/L/h，更优选地至少或约为 6mmol/L/h,甚至更优选地至少或约为7mmol/L/h。根据本发明的用于生产二羧酸的方法可以在1和9之间的任何合适的pH下进行。 优选地，发酵液中的pH在2和7之间，优选地在3和5之间。发现能够在低pH下进行根据 本发明的方法是有利的，因为这能防止细菌污染。另外，因为延胡索酸和/或琥珀酸生产期 间的PH降低，将pH保持在期望水平需要更少量的滴定剂。可以进行根据本发明的方法的合适温度在5°C和60°C之间，优选地在10°C和50°C 之间，更优选地在15°C和35°C之间，更优选地在18°C和30°C之间。本领域技术人员已知哪 些最适温度适合用于发酵特定的酵母细胞。优选地，通过本领域已知的合适方法，例如通过结晶或铵沉淀，从发酵液中回收二 羧酸例如延胡索酸和琥珀酸。优选地，在根据本发明的方法中制备的二羧酸被进一步转化成期望的产物，例如 药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。在生产琥珀酸的情况下，琥珀酸可以被进一步转化成 聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)或由其衍生的任何合适的 聚合物。遗传修饰标准的遗传技术例如宿主细胞中酶的过量表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交 技术是本领域已知的方法，例如如Sambrook和Russel(2001) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第三版)，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F. Ausubel 等编，"Currentprotocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)中所述。用于真菌宿主细胞转 化、遗传修饰等等的方法从 EP-A-0 635 574、W0 98/46772、W0 99/60102 和 W0 00/37671、 W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574 和 US 6，265，186 中已知。附图描述图 1 :pGBS415SUS-01 的质粒图谱，其编码用于在 Saccharomycescerevisiae 中表 达的来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CP0表示密码子对经优化。图2 :pGBS416FUM-l的质粒图谱，其编码用于在Saccharomycescerevisiae中表达 的来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CP0表示密码子对经优化。以下实施例仅用于阐述的目的，不应被理解为限制本发明。实施例实施例1使用E. coli DH10B作为克降载剂，在Saccharomyces cerevisiae中克降来自 Rhizopus oryzae的延胡索酸酶1. 1.表达构建体使 用 SignalP 3.0 (http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) Bendtsen, J.等(2004) Mol. Biol.，340 :783—795 禾口 TargetP 1. 1 (http: //www. cbs. dtu. dk/services/ TargetP/)Emanuelsson, 0.等(2007)NatureProtocols 2，953-971，针对信号序列的存在， 分析来自 Rhizopus oryzae 的延胡索酸酶[E. C. 4. 2. 1. 2]，GenBank 查询号 469103。鉴定了蛋白质最初23个氨基酸中推定的线粒体靶向序列。为了避免 S. cerevisiae中可能的到线粒体的靶向，从SEQ ID NO 1中去除最初23个氨基酸(SEQ ID N0:2是相应的核苷酸序列)并再引入甲硫氨酸氨基酸，得到SEQ ID NO :3。针对 S. cerevisiae，如PCT/EP2007/05594中所公开的，对SEQ ID NO 3进行密码子对方法。将 得到的序列SEQ ID N0:4置于组成型TDH 1启动子序列SEQ ID NO :5之后和TDH 1终止 子序列SEQ IDN0:6之前，并添加便利的限制性位点。将SEQ ID NO :4中的终止密码子 修饰为TAAG。得到的序列在Sloningpuchheim，德国)合成。用BamHI/NotI限制性消 化 S. cerevisiae 表达载体 pRS415(Sirkoski R. S.和 Hieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)后，随后在该载体中连接由延胡索酸(来源Rhizopus oryzae)合成基因构建体组成 的BamHI/NotI限制性消化片段，创建表达构建体pGBS415SUS_01 (
图1)。使用连接混合物 转化 E. coli DH lOB(Invitrogen)，得到酵母表达构建体 pGBS415SUS-01 (图 1)。将构建体pGBS415SUS-01 转化进 S. cerevisiae 菌株 CEN. PK113-6B (MATA ura3-52 leu2_112 trp1-289)> RWB066(MATA ura3_52 leu2_112 trpl-289 adhl::lox adh2::Kanlox)禾口 RWB064(MATA ura3_52 leu2_112 trpl-289adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanl0X)。将转化混合物涂布于补充有合适氨基酸的酵母氮基础(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。将转化体接种进补充有合适氨基酸的包含葡萄糖的Verduyn培 养基(Verduyn等，1992，Yeast. Jul ；8 (7) :501_17)中，并在摇瓶中于需氧、缺氧和氧受限的 条件下生长。用于缺氧培养的培养基补充有溶于乙醇中的0.42g/l Tween 80和0.01g/l麦 角固醇(Andreasen 禾口 Stier, 1953，J. cell. Physiol, 41, 23-36 ；Andreasen 禾口 Stier, 1954， J. Cell. Physiol,43 =271-281)。所有酵母培养物在30°C下于250_280rpm的摇动培养箱中 生长。在不同的孵育时间取出培养物的小份试样，离心并如下文所述通过HPLC分析培养基 的草酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸形成。1. 2HPLC 分析进行HPLC来测定不同种类样品中有机酸和糖的测定。PhenomenexRezex-RHM-单 糖柱上的分离原则基于使用反相机制的离子交换、离子排除和尺寸排除。检测通过示差折 射系数(differential refractive index)和紫外检测器进行。实施例 2 在 Saccharomyces cerevisiae 中克隆来自 Rhizopus oryzae 的延胡索 酸酶。2. . 1表达构建体以与实施例1. 1中所公开相似的方式，将来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(SEQ ID NO :4)连接进 S. cerevisiae 表达载体 pRS416(Sirkoski R. S.和 Hieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)中。使用连接混合物转化E. coliTOPIO (Invitrogen)，得到 酵母表达构建体PGBS416FUM-1 (图2)。2.2.转化和微量滴定板(MTP' s)生长实验将构建体pGBS416FUM-l 转化进酿酒酵母菌株 CEN. PK1 13-5D (MATA ura3_52)中。 作为阴性对照，将空载体PRS416转化进菌株CEN.PK 113-5D中。将转化混合物涂布在酵母 氮基(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。将以下数量的各转化体一式两份(in duplo)接 种于96深孔MTP中250微升包含2%葡萄糖的Verduyn培养基(Verduyn等，1992，Yeast. Jul ；8 (7) 501-17)中，并在30°C、550rpm和80%的湿度下，在Infors微量培养板摇动培 养箱中预培养12个pGBS416FUM-l (FUMR)和24个pRS416空载体对照转化体。3天后将 MTP孔中存在的25微升预培养物转移至含有Verduyn培养基的新的96深孔MTP中，所述 Verduyn培养基含有葡萄糖和CaC03(终浓度250微升总体积中葡萄糖10%，CaC03 1% w/ v)。在30°C、550rpm和80%湿度下在Infors微量培养板摇动培养箱中生长3天和7天后， 将MTP以2000rpm离心2分钟，使用Multimek 96 (Beckman)收获200微升上清液，并如实 施例1. 2中所述通过HPLC分析上清液中琥珀酸的存在。结果展示于表1中。表 1.在 Saccaromyces cerevisae CEN.PK 113-5D 中插入来自 Rhizopusoryzae 的延胡索酸酶(FumR)对培养3天和7天后琥珀酸生产水平的影响。 表1中的结果显示，引入并过量表达来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶导致3 天的孵育后琥珀酸生产水平显著提高至1. 13倍(p = 4. 71 E-7，学生t-检验)。孵育7天 后，引入并过量表达来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶导致琥珀酸生产水平显著提高至 1. 56 倍(p = 4. 49 E-10,学生 t-检验)。
权利要求
包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。
2.根据权利要求1的酵母，其中在所述核苷酸序列表达后所述酶在胞质溶胶中有活性。
3.根据权利要求1或2的酵母，其中所述酶来自于Rhizopusoryzae。
4.根据权利要求1到3中任一项的酵母，其中所述酶是延胡索酸酶。
5.根据权利要求1到4中任一项的酵母，其中所述酶与SEQID NO 1或SEQ ID NO 3 具有至少70%的同一性。
6.根据权利要求1到5中任一项的酵母，其属于Saccharomyces、Pichia、 Kluyveromyces、Zygosaccharomyces 之一的属。
7.根据权利要求1到6中任一项的酵母，其为包含SEQID NO :4的Saccharomyces cerevisiae。
8.用于生产选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，所述方法包括在合适的发酵培养 基中发酵根据权利要求1到7中任一项的酵母，其中生产出所述二羧酸。
9.根据权利要求8的方法，其中所述二羧酸被进一步转化为药物、化妆品、食物、饲料 或化学制品。
10.使用酵母作为二羧酸生产者来生产选自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，其中 使用延胡索酸酶提高二羧酸生产。
11.根据权利要求9的方法，其中所述提高是至少1.1倍。
12.根据权利要求9或10的方法，其中所述延胡索酸酶在胞质溶胶中有活性。
全文摘要
本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。本发明还涉及生产二羧酸的方法，其中使用根据本发明的酵母。
文档编号C12P7/46GK101896606SQ200880117128
公开日2010年11月24日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月20日
发明者吴亮, 瑞内·维尔瓦尔, 科尼利斯·玛丽亚·雅各布斯·沙吉, 罗波图斯·安东尼厄斯·戴维尔德 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司