检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法

专利名称：检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法
技术领域：
本发明涉及检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法。
背景技术：
和现有技术国际专利申请PCT/EP96/01745描述了一种重组的核酸序列，和包含此核酸序列的宿主微生物，以及此宿主微生物用来检测样品中基因毒性化合物的用途。所述细菌基因毒性测验是根据生物发光，而使基因毒性化合物得到简易、迅捷、低成本的检测。此测验表现出与埃姆斯测验法和SOS显色法至少一样灵敏，且可给出基因毒性动力学测定，并同时评价受测化合物或材料的毒性(Van der Lelie等人，1977)。因此，称为VITOTOX的这种新测验被认为是一种有价值的、短期基因毒性和毒性测验，可用于许多不同目的。
这种测验基于含lux操纵子的细菌，lux操纵子源于弗氏弧菌(Vibriofishcheri)，其转录受到recN基因的调控，是SOS系统的一部分。这种细菌在基因毒性化合物存在的条件下培养后，recN启动子被去阻遏，导致lux操纵子表达。这种表达在基因毒性作用下导致光的产生。起初，此测验是利用经改造的大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的不同菌株而完成的。作为周知的用于诱变性测验的菌株，使用鼠伤寒沙门氏菌菌株(TA98，TA100和TA104)。而且，一旦需要相同菌株也可用于″经典的″埃姆斯测验法。在所有菌株中，利用recN启动子启动区突变构建体(recN 2-4)给出的测验结果最好。此外，由于所有的沙门氏菌菌株给出相近的结果，已建议只进一步使用TA104构建体(称为TA 104(recN2-4))，因其有时比其它杂交菌株表现更灵敏(Vander Lelie等人，1997)。
然而，某些化合物可直接作用于光的产生(如醛类、有机溶剂)，或增强细菌代谢造成假阳性的结果。
发明目的本发明旨在提供一种新的诊断系统和方法，用于检测环境胁迫(environmentol insult)物质，如样品中的基因毒性化合物的存在，这种方法不存在现有技术的种种缺点。
本发明的主要目的是提供一种新的诊断系统和方法，这种系统和方法去除了假阳性和假阴性的结果。
本发明的另一个目的在于提供一种诊断系统和方法，其能够用于筛选源于化学的、化妆品的和制药工业领域的基因毒性化合物，作为中间产物或活性化学、化妆品和/或药物化合物的报批前期研究。
本发明的最后一个目的是提供一种诊断系统和方法，其可对很小体积的样品进行自动筛选。发明描述本发明涉及的诊断系统包括-一种暴露于环境胁迫物质中便能提高报道基因活性的转化微生物，优选地暴露于基因毒性化合物下。这种微生物含应激可诱导型启动子序列，优选地是基因毒性化合物可诱导型启动子序列。此启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，此核酸序列编码报道分子，报道分子产生可供检测的信号。
-一种转化的微生物，其含组成型和非应激诱导型启动子序列，优选地，为不能得到基因毒性化合物诱导的组成型启动子序列，所述启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该序列编码产生可检测的信号的报道分子。
优选的，两种转化微生物是生物发光微生物，可检测的信号是光的产生。其它可用的有过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-gal和gus的遗传序列，因色谱改变或产生化学发光，其信号可利用比色分析仪或光电倍增器来检测。
有利地，根据此发明的诊断系统由两种转化的生物发光微生物组成，第一种生物发光微生物在基因毒性化合物存在时是“激活的”，产生可供检测的光信号；相反，另一种生物发光微生物中，光的产生不受样品中基因毒性化合物存在的影响。
编码报道分子的核酸序列产生可检测的光信号，这在本领域已早有描述。优选的，根据本发明的转化的生物发光微生物含有萤光素酶A和B基因，也被确认为表达性的lux基因复合体，其含有luxA和luxB基因或翻译性luxAB融合基因。转化的生物发光微生物也可包含萤光素酶C，D和E基因，这些基因是产生用于循环的有限脂肪酸底物所必需的。
根据本发明的优选实施方案，诊断系统含有具组成型及非应激诱导型启动子序列的转化微生物，此启动子序列含有σ70共有序列(TTGACA(-35)17/18bp-----TATAAT(-10))，其转录不受启动子水平的正负调节。Hoopes BC和Mcclure WR(1987)描述了此启动子共有序列转录启始的调控策略；《大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞和分子生物学》FCNeidhart，J L Ingraham，K B Low，B maganasik，M Schaechter，H E Umbaeger(编)，美国微生物学会，华盛顿D.C.，1231-1240。
根据本发明的优选实施方案，转化的生物发光微生物选自大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌，尤其适用于埃姆斯测验法，优选地选自TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535、TA1538、TA7001到TA7006和TA7041到TA7046，和/或具有保藏号为LMG P-18318的微生物。保藏号为LMGP-18318的微生物在下文中称为“pr1”菌株。
有利地，根据本发明的诊断系统中转化的生物发光微生物的应激可诱导型启动子序列选自groEL、dnaK、grpE、phoA、glnA、lon、lysU、rpoD、clpB、clpP、uspA、katG、uvrA、frdA、micF、fabA、lac、his、sodA、sodB、soi-28、recA、xthA、narG、recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv、uvrD、ars、cad、mer、pco和sfiA。
根据本发明的一个优选实施方案，应激诱导型启动子序列是recN，有利地为recN2-4。此微生物下文称为“recN2-4”菌株。
在一个优选实施方案中，根据本发明的诊断系统包含一种具有应激可诱导型启动子序列的转化生物发光微生物，此序列是SOS调节子的启动子序列，其优选地具有高于40的诱导比率，并有利地含一个增强启动子强度或调控的突变，该突变不会损害SOS调控。
突变的recN启动子序列的一个特定例子在国际专利申请PCT/EP96/01745中有描述，在此引用作为参考。
所述应激可诱导型启动子序列还含有一个启动子启动区突变，优选的启动子启动区突变位于此启动子-35区，描述于国际专利申请PCT/EP96/01745，在此引用作为参考。
本发明也涉及诊断试剂盒，此试剂盒包含根据本发明的诊断系统的各个元件，而且可能的话，还含有一些必须的附加反应试剂、稀释剂和/或这种诊断用固体支持物，如一种缓冲液，溶液中含特殊标记物如X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)用于使用β-gal遗传序列的诊断，或如鲁米诺用于使用过氧化物酶遗传序列的诊断，等等。
本发明也涉及诊断环境应激或胁迫物质的一般方法，优选地用于检测样品中基因毒性化合物的存在。所述方法含有将根据本发明的诊断系统暴露于所述的环境胁迫物质中的步骤(优选地包括将诊断系统与样品中存在的基因毒性化合物接触的步骤)，以测定该诊断系统信号改变，优选地为发光的改变。
本发明也涉及基于上述方法测定样品中化合物的基因毒性动力学的方法，其中在不同时间点优选为连续测定可诱导型和组成型的两种转化微生物的发光性，且此外在所述点和时间测定转化微生物的信噪比(S/N)的步骤，再以可诱导型微生物的S/N比除以组成型微生物的S/N比，然后将这些数据绘图，所绘图代表了样品中基因毒性化合物的经校正的基因毒性动力学。
较有利的，根据本发明的诊断系统和方法可与埃姆斯测验法和SOS显色法联合使用，如下所述。
本发明也涉及环境胁迫物质的分析方法，这种方法包含的步骤有-按上文所述，进行环境胁迫物质的诊断，-计算两种转化微生物的信噪比，
-如果计算出的信噪比中至少有一个低于0.8，则将该环境胁迫物质归为有毒的，-如果含有应激诱导型启动子序列的微生物的信噪比在0.8-1.2之间时，将此环境胁迫物质归类为无影响的，-当含有应激诱导型启动子序列的微生物信噪比高于1.2，且至少比含组成型启动子序列的微生物的信噪比高50％时，将环境胁迫物质归类为诱导和基因毒性的。
本发明也涉及用于检测样品中化合物是否具基因毒性和/或具有毒性的装置，它包括如上述可由样品诱导的诊断系统；还包括一检测系统，此系统包含可对来源于该诊断系统的信号进行分析的检测装置，所述检测系统与一计算机相连，计算机通过编程完成上述的分析。
下面将以无限定条件的实施例和附图详细叙述本发明。
附图的简单说明

图1表示recN2-4和pr1菌株对表氯醇的信噪比。
图2表示recN2-4和pr1菌株对ZnCl2的信噪比。
图3表示recN2-4和pr1菌株对叠氮化钠的信噪比。
图4表示recN2-4和pr1菌株对硝呋酚酰肼的信噪比。
图5表示一检测表，用以区分根据本发明的诊断测验的可能结果。
图6表示根据本发明的装置。
发明详述材料与方法Ames测验和SOS显色法SOS显色法和埃姆斯测验法是众所周知和广泛使用的细菌基因毒性测验(如Quillorde和Hofnung，1993；Merch-Sundermann等人，1994；Mortelmans等人，1986)。″经典″埃姆斯测验法按惯例使用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98和TA100，采用Maron和Ames(1983)描述的标准程序进行。SOS显色试剂盒购于Orgenics有限公司(Yavne，以色列)，检验按厂家说明进行。VITOTOX测验鼠伤寒沙门氏菌菌株recN启动子区是大肠杆菌recN基因的一部分(Rostas等人，1987)，它含两个LexA结合位点。一个LexA结合位点与-35区重叠，第二个与recN启动子的-10区和转录起始位点重叠。大肠杆菌recN启动子克隆于表达载体pMOL 877中luxCDABE操纵子的上游(Vander，Lelie等人，1997)，得到克隆pMOL 1066。由于细菌SOS系统控制recN启动子，因此lux操纵子的表达也要受SOS调控。这就导致在基因毒素存在下光的产生。一些recN启动子衍生物也克隆到pMOL 877。其中一个缺少LexA2位点的是pMOL1067，一个含启动子启动区突变(pMOL 1068)，另一个两者都有(pMOL 1069)。将所有构建体引入到埃姆斯测验法菌株TA98、TA100和TA104，可用来检测基因毒性化合物。结果使用TA104(pMOL 1068)菌株得到的结果最好，因此在VITOTOX测验中进一步应用该菌株。此前对之已有深入描述并定名为TA104 recN 2-4，因为它含recN2-4 PCR片段(Vander Lelie等人，1997)。除TA104 recN2-4(测验株)外，现增加TA104 pr1菌株作为“对照菌株”。将来自真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)CH34用EcoR I随机切割产生的DNA片段克隆到luxCDABE表达载体(pMOL 877)构建成质粒pMOL1046。真养产碱菌CH34(ATCC 43123)是一种革兰氏阴性非致病土壤细菌，由锌厂废弃池中分离而来(Mergeay等人，1985，细菌学杂志(J.Bact))。转化大肠杆菌1106后(Murray等人，1977，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.))，选择产生光的克隆。从不同质粒转化子(＝质粒pMOL1046)筛选最好的组成型产光克隆，如通过发光计所定量它可给出最高的光产生量。将之转化进鼠伤寒沙门氏菌TA104中，定名为″pr1″菌株。它含受组成型启动子控制的lux CDABE基因，因此其光的产生不受基因毒性化合物的影响。pr1和recN2-4菌株平行使用，培养和处理均采用几乎相同的方式。测验步骤1.培养细菌于869培养基中在旋转摇床上37℃培养过夜；869培养基与补加额外CaCl2的LB培养基相当，可使细菌得到最适生长，Vandelelie等人(1997，突变研究(Mutation Res))描述了此培养基。次日清晨，取细菌悬浮物于869培养基中稀释10倍，然后取50μl稀释液，接种于2.5ml 869培养基中，37℃旋转摇床(170转/分)上继续培养一小时。2.96孔板的准备同时准备96孔板，加入10μl的溶剂或不同浓度的测验化合物，或是有(2-AF)或无(4-NQO)S9-混合物的基因毒性测验的阳性对照。按Maron和Ames(1983，突变研究)制备的S9-混合物用于代谢激活后变成有基因毒性的化合物的检测，现用现配。对于采用S9-混合物的检测，取140μl的细菌培养物(recN2-4或pr1)加到860μl 869培养基和400μlS9-混合物中。从此混合物中取90μl加入到已存在于板孔中的10μl溶液中。对于无S9-混合物的检测，取1260μl差(poor)869培养基加入到140μl细菌悬浮液中，取90μl混合物转移到含10μl测验化合物或对照的板孔中。3.基因毒性和毒性测定接触待测化合物后，光产生量的测量采用96孔微板测光计(光扫描仪购自Berthold)来检测。在5小时内，每隔5分钟测定每个孔的光释放量(30℃，1秒/孔，每300秒60个循环)。测定完成后，将数据转换成MSExcel宏表格，计算出每次测得的信噪比(S/N)。信噪比是接触细胞的光产生量除以未接触细胞的光产生量。当至少有2个浓度下的信噪比S/N大于2并可观察到很明显的剂量效应关系时，可认定此化合物具基因毒性。在第2个实验中引入了TA104 pr1菌株。对于recN2-4和pr1菌株分别计算S/N，以及recN2-4和pr1菌株的最高S/N值和S/N平均值的比值(rec/pr1)。在60-240分钟的培养时间内进行所有的计算。当recN2-4菌株中的S/N大于1.5×溶液对照值(而不是前述的2)，但仅当这种增加并不伴随pr1菌株中的相应增长(这表示非基因毒性诱导的机制)时，可认定此化合物具基因毒性。当recN2-4与pr1菌株的S/N比值相等或高于1.5(实验条件下的限定值)时，化合物具有基因毒性。采用这种方式可避免″假阳性″的结果。
当recN2-4菌株的S/N比值位于0.8和1.2之间，而pr1敏感菌的S/N比减至0.8以下时，可认定为″假阴性″结果。这对于既有基因毒性又有毒性的样品来说是通常的情况。
另外pr1菌株对毒性的评价也非常有价值。在测验的最初30分钟内，光的产生量按剂量依赖方式显著降低，所得S/N值低于0.8，这时认定为细菌毒性。
利用图6描述的装置，系统的自动化也是可能的。检测装置(2)包含至少一个检测器，可检测上述诊断系统释放的信号，检测装置与计算机(1)相连，计算机接收和处理按上述和图5所示的分析方法所得的检测器数据。以这种方法，可以自动分析样品并按毒性和/或基因毒性分类。待测化合物在与单独使用TA104 recN2-4菌株检测之前，许多市售的为人所熟知的化合物已经得到评价(见Van der Lelie等人，1997)。本工作中使用TA104 recN2-4和TA104 pr1菌株对它们进行了再次评价。表1给出了这些化合物。
表1 VITOTOX测验对选定的化学物质测验结果化学物质*S9**测验剂量范围 S/N＞2 rec/pr1的S/N比值＞1.5时的浓度值(recN2-4)最大值 平均值毒性(pri)呋喃唑酮 - 0.125-32ppb0.25ppb 0.5ppb 0.25ppb -4萘醌(NQO)- 0.4-102ppb 0.8ppb 1.6ppb 0.8ppb-硝呋酚酰肼- 2-256ppb 8ppb16ppb 8ppb +甲基化汞(MMC) - 3.9-500ppb 31.2ppb 31.2ppb15.6ppb -3-硝基荧蒽- 7.9-1000ppb15.7ppb 31.3ppb15.7ppb -3-硝基荧蒽+25 7.9-1000ppb15.7ppb 31.2ppb15.7ppb -硝呋酚酰肼- 0.04-5.12ppm 0.04ppm 0.04ppm0.04ppm +3-硝基荧蒽- 0.004-0.512ppm 0.032ppm0.064ppm 0.032ppm -卡巴氧- 0.04-5.12ppm 0.08ppm 0.08ppm0.04ppm -萘啶酮酸 - 0.02-2.56ppm 0.16ppm 0.16ppm0.16ppm +2，4，5，7-四硝基9- - 0.01-1.28ppm 0.08ppm 0.16ppm0.04ppm +芴酮B(a)P +25 0.025-6.4ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.1ppm-2AF +25 0.2-3.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm-B(a)P +25 0.1-1.6ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm-2，7-二硝基芴酮 +25 0.04-10ppm 0.62ppm 0.62ppm0.62ppm -B(a)P +100 0.1-12.8ppm0.8ppm 0.8ppm 0.4ppm-ICR191吖啶- 0.02-2.5ppm0.62ppm 1.25ppm0.31ppm -α-萘胺 +25 0.08-10ppm 5ppm2.5ppm 2.5ppm-4-硝基-邻苯二胺 - 0.79-100ppm3.1ppm 3.1ppm 1.57ppm +荧蒽 +100 3.1-400ppm 3.1ppm 3.1ppm 3.1ppm-过氧化氢 - 0.25-32ppm 2ppm4ppm 2ppm +重铬酸钾 - 0.5-64ppm 4ppm4ppm 4ppm +菲+100 3.1-400ppm 6.2ppm 6.2ppm 6.2ppm+甲基汞化硫酸酯(MMS) - 4-64ppm16ppm 8ppm 8ppm -甲基汞化硫酸酯(MMS) - 0.5-128ppm 8ppm8ppm 8ppm -+100 0.15-20ppm - 10ppm 5ppm -4-硝基-邻苯二胺 +25 0.79-100ppm12.5ppm 12.5ppm12.5ppm +N-亚硝基二乙胺+25 3.25-480ppm120ppm 120ppm 240ppm-表氯醇- 4-512ppm 120ppm 256ppm 120ppm-乙基乙烷磺酸酯(EMS) - 8-1024ppm 256ppm 256ppm 256ppm-表氯醇- 8-1024ppm 256ppm 512ppm 128ppm+氯化锌- 0.5-64ppm - - - +氯化镉- 0.78-100ppm- - - +香豆霉素Al- 1.56-200ppm- - - +叠氮化钠 - 2-256ppm - - - +2，7-二硝基芴酮 - 0.04-10ppm - - - -α-萘胺 - 0.08-10ppm - - - -(*某些化学物质在不同剂量范围和条件下进行多次测定；**μl/ml S9-混合物用于培养)结果较早利用VITOTOX测验的报道结果是在鼠伤寒沙门氏菌TA104recN2-4菌株中得到的(Van der Lelie等人，1997)。为了改进这种测验，我们引入了pr1菌株。由recN2-4菌株得到的结果应与pr1菌株中所得的结果对比评价，光产生量增加不能归因于基因毒性事件。因此，当recN2-4菌株中光产生量的增加，没有伴随着pr1菌株中光产生量的增加，则recN2-4菌株中光产生量的增加只能解释为有基因毒性的迹象。
使用两种菌株，我们对以前研究的许多化学物质作了重新评价。结果在表1中给出。此表给出了recN2-4测验菌株的最大S/N值≥2时的浓度值，和recN2-4 S/N及pr1 S/N的最大值和平均值的比值达到1.5或更高(rec/pr1)时的浓度值。最后此表也表示了测验的剂量范围内存在的毒性，并以pr1 S/N曲线来评价。可见已知具有基因毒性的化合物，事实上也被评价为基因毒性化合物，而非基因毒性化合物没有在给出的剂量范围内显示出所需的S/N比值。结果中的几个例子以图表形式在图1-4中表示(无S9-混合物测验的实施例)。图1给出了recN2-4和pr1菌株中表氯醇的S/N曲线。在recN2-4菌株中，S/N比值在256ppm剂量下变得大于2，而在pr1菌株中的S/N值与1没有很大的偏离。图2给出了ZnCl2的结果，其在高于7.4μM浓度下对鼠伤寒沙门氏菌TA104无基因毒性，但是有毒的。图3所示的是第三个例子叠氮化钠。这里，recN2-4和pr1菌株中的S/N比值显著大于2，随着时间增加得到有毒性的迹象(S/N＜0.8)。图4绘出了由硝呋酚酰肼得到的结果。对于recN2-4菌株，低剂量很明显比高剂量更具有基因毒性，而对pr1菌株，暗示具有毒性的光产生量按剂量依赖方式降低。讨论VITOTOX测验是一种检测基因毒性化合物的灵敏和快捷的方法(Van der Lelie等人，1997)。但是，倘若只使用recN2-4菌株(如以前所做)，可能有一些不能解释的情况。本发明是基于pr1菌株的使用。pr1菌株另外的价值可通过一些实例表示出来。图1中给出了一个基因毒性化合物(表氯醇)的例子，其在给出的剂量范围内不具有毒性。仅根据从recN2-4菌株得到的数据，可总结此化合物有基因毒性，因为可观察到光产生量的剂量依赖性增加，且已超过“噪声”值的2倍(S/N＞2)。加入了pr1菌株恰证实了这一评价。如果发现在pr1菌株中有光产生量的增加，实际上我们应将此归结为基因毒性以外的另一种诱导机制(如与未接触的培养物噪声相比，细胞增殖的增加可增强“噪声水平”，等等)。但事实上不是这样。没有光产生量的减少时也没有毒性的任何信号。很明显这对图2中以曲线表示的ZnCl2是正确的。其对recN2-4菌株的数据显示3.7μM剂量下既无基因毒性的，也无毒性，但是在较高剂量下观察到的光产生量的减少表示产生毒性效应，随之，在低剂量下得到一定恢复。这被pr1菌株证实，在pr1菌株中光恢复在达58.8μM的ZnCl2剂量下更加明显可见。从117.5μM开始，不再可能恢复。因此表明ZnCl2非基因毒性，且只在最低剂量时表现为无任何毒性。
如引言和材料与方法部分所示，VITOTOX-测验基本上基于SOS信号的检测。因此从理论上说，它产生的结果应与SOS显色法，而不是与埃姆斯测验法更一致。但是，以前也发现一些不同。例如发明人已报道在SOS显色法中对叠氮化钠的“阳性”反应，而通常此化合物一般归为“阴性”(Van der Lelie等人，1997)。产生此出入的一个原因可能是VITOTOX测验使用了埃姆斯测验法用鼠伤寒沙门氏菌TA104菌株，因此可能具有相同的特征，如DNA修复能力降低，复合体分子的渗透性增加(象大多数药物一样)。当然这对很多情况是一个有力的解释，但可能不能用于象叠氮化钠一样的小分子。与SOS显色法结果不同的另一原因是可预见的。例如，在recN2-4菌株中发现的光产生量的增加归因为基因毒性之外的另一诱导机制。通过引入pr1菌株，人们可以确证这个假设。如图3可见，recN2-4菌株中可观察到的光产生量不是由于基因毒性，因为在pr1菌株中也观察到光产生量的增加，这不可能是由于SOS反应造成的。因此叠氮化钠在我们的测验中，应解释为非基因毒性。对于仅使用recN2-4株而将化合物定为“假阳性”的测验而言这是个很好的例子。
发明人已利用其它细菌测验检测和比较了相当多的医药化合物。不同的测验得到的结果彼此之间常常完全一致。VITOTOX测验通常要比埃姆斯测验法或SOS显色法灵敏得多，因为在VITOTOX测定中可检测出的最小浓度要低1-100倍。
与仅使用recN2-4菌株相比，使用pr1菌株的另一优点是除基因毒性外，可更好地评价毒性。在毒性阈值附近的剂量水平考察一基因毒性化合物时可发现，在recN2-4菌株中的S/N位于基因毒性和毒性之间，因为光产生量的增加(由于基因毒性)和降低(归因于毒性)竞争，结果S/N≈1。因此该化合物可被解释为既非基因毒性也非毒性(假阴性结果)。而pr1菌株可很清楚地表现出光产生量的降低，表明此化合物在给定的剂量已具有毒性。这在图4中表示出来(至少对某些剂量)。图4中以硝呋酚酰肼为例，可见由于剂量依赖性毒性作用，低剂量时显出最大的基因毒性反应。pr1菌株的S/N曲线明显地表示，剂量最低达到0.16ppm是无毒性的，较高剂量可表现毒性与基因毒性相结合(如0.32ppm)，或因毒性过大而不显示基因毒性(最高剂量)。
recN2-4和pr1菌株都表明可检测化合物的毒性浓度。而在毒性测验中，pr1菌株更具价值，因为S/N曲线不会受基因毒性的影响，因而只反映毒性(或不存在毒性)。显然，对于那些仅关心毒性评定的人，pr1菌株提供了一个理想的工具。最近我们正在利用pr1菌株和Microtox测验，比较化学物质和复合体混合物的毒性评定。后者是最近得到应用和为国际接受的微生物毒性测验，它同样基于生物发光性(Hasting，1978；Ferard等人，1983)。根据我们已得到的有限数据，VITOTOX测验给出的结果与Microtox测验的结果相同，而前者更容易操作，且常常更加灵敏。因此VITOTOX测验，或仅仅它的pr1元件，可看作是相当有价值的毒性测验，至少在这些初步结果被证实时。
总之，该强调的是鼠伤寒沙门氏菌TA104 recN2-4和TA104 pr1菌株提供了非常有价值的基因毒性和/或毒性测验系统。两种菌应同时用于基因毒性检测，而pr1菌株只是毒性测定所需的。可见在化学物质的(基因)毒性方面，VITOTOX测验提供了非常迅速(2-4小时内)、非常灵敏的方法。这也许是其在新化学物质和中间产物筛选和预筛选中非常有用的原因。由于检测是在96孔板内完成的，因此，一天可至少考察8种化学物质(加或不加代谢酶组分S9-混合物)，或一周内完成40种化学物质是可能的。测定自动化和数据收集及数据处理几乎可完全自动化。微孔板机器人操作化应能大大提高这一速度，如提高10倍。通过增加每板的孔数进行放大是显而易见的。因此可最大程度的降低劳动力成本。
最后，一个补充性的和非常重要的益处是只需要很小体积的待测化合物(少于20mg)。这对医药工业尤其重要，因为那里在发现期只能提供几百或数百毫克的化学物质。而这对于采用(大多数)其他检测系统筛选新的化学物质所是不可能的。
根据布达佩斯条约，“pr1”菌株已保藏，保藏号为LMG P-18318，保藏于BCCM/LMG，比利时微生物协调保藏中心，Universiteit Gent，K.I.Ledegenckstraat 35，B-9000Gent，比利时。
参考文献1.Ferard，J.F.等人，(1983)细菌发光的抑制试验在化合物及化学物质排出的毒理学研究中的应用，水科学法文综述，2221-237。
2.Hasting JW(1978)细菌的生物发光评论，《酶学方法》，学院出版社，125-152。
3.Maron DM，Ame BN，(1983)沙门氏菌致诱变性测验的改进方法，突变研究，113173-215。
4.Mergeay M等人，(1985)，含抗重金属特性质粒的真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)CH34是兼性矿化能营养的，细菌学杂志162，328-334。
5.Mersch-Sundermann V等人，(1994)，大肠杆菌和沙门氏菌属诱变性中的SOS诱导利用300种化合物的比较，突变(Mutagenesis)9205-224。
6.Mortelmans K等人，(1986)沙门氏菌属致突变性测验II 270种化学物质的测验结果，环境分子诱变(Environ Molec Mutagen)增刊，71-119。
7.Murray NE等人，(1977)简化体外重组体的回收的λ形噬菌体，普通分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)15053-61。
8.Qulliardet P，Hofnung M，(1993)SOS显色法，综述，突变研究297235-279。
9.Rostas K等人，(1987)大肠杆菌recN基因的核苷酸序列和LexA的调控，核酸研究(Nucl.Acids Res.)155041-5049。
10.Van der Lelie D等人，(1997)VITO-TOX测验，一种利用SOS生物发光的鼠伤寒沙门氏菌测验以测定基因毒性动力学，突变研究389279-290。
11.Van der Lilie D等人，(1997)真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)中参与重金属平衡的转录调控双组件调节系统，分子微生物学，23(3)439-503。
权利要求
1.一种诊断系统，包括--一种接触环境胁迫物质便可增加报道基因活性的转化微生物，所述微生物含应激可诱导型启动子序列，启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该核酸序列编码一种产生可供检测的信号的报道分子，以及--一种含组成型和非应激诱导型启动子序列的转化微生物，启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该核酸序列编码一种产生可供检测的信号的报道分子。
2.根据权利要求1的系统，其中的信号以光产生和/或比色改变来测定。
3.根据权利要求1或2的系统，其中转化的生物发光微生物是大肠杆菌。
4.根据权利要求1或2的系统，其中转化的生物发光微生物是鼠伤寒沙门氏菌，优选地为适用于埃姆斯测验法的微生物，它有利地选自TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535、TA1538、TA7001到TA7006和TA7041到TA7046，和/或保藏号为LMG P-18318的微生物。
5.根据前面的权利要求1-4中任一项的系统，其中的应激可诱导型启动子序列选自groEL、dnaK、grpE、phoA、glnA、lon、lysU、rpoD、clpB、clpP、uspA、katG、uvrA、frdA、micF、fabA、lac、his、sodA、sodB、Soi-28、recA、xthA、narG、recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv、uvrD、ars、cad、mer、pco和sfiA。
6.根据前面权利要求1到5项中任一项的系统，其中组成型和非应激诱导型启动子序列是一段具有Sigma 70共有序列(TTGACA(-35)---17/18bp---TATAAT(-10)的序列，且其转录不受启动子水平的正负调控。
7.根据前面要求1到6项中任一项的系统，其中编码报道基因的核酸序列包含萤光素酶A和B基因或LuxAB翻译融合基因。
8.根据前面权利要求1到7项中任一项的系统，其中编码报道基因的核酸序列包含萤光素酶A和B基因，以及萤光素酶C、D和E基因，这些基因是产生用于循环的有限脂肪酸底物所必需的。
9.根据前面权利要求1到8项中任一项的系统，其中环境胁迫物质是存在于样品中的基因毒性和/或毒性化合物。
10.诊断试剂盒，其包含根据前面1到9项中任一项诊断系统中的各种元件，以及可能的话，还有所需的附加反应剂、稀释剂和/或固体支持物。
11.诊断环境胁迫物质的方法，优选地用于检测样品中基因毒性和/或毒性化合物的存在，包含的步骤-将根据前面1-8项中任一项的诊断系统与环境胁迫物质接触，且-测量所述诊断系统中转化的生物发光微生物的信号。
12.用于测定样品中化合物的基因毒性动力学的方法，其中在多个时间点，优选为连续地测定诱导型和组成型的两种转化微生物发出的光，此外，进行测定此时间点转化微生物的信噪比(S/N)的步骤，以诱导型微生物的S/N比除以组成型微生物的S/N比，然后将这些数据绘图，所述图代表样品中基因毒性化合物的经校正的基因毒性动力学。
13.环境胁迫物质的分析方法，包括步骤-按权利要求11所述进行环境胁迫物质的诊断，-计算两种转化微生物的信噪比，-如果计算出的信噪比至少有一个低于0.8，将此环境胁迫物质归类为有毒的，-如果含应激诱导型启动子序列的微生物之信噪比在0.8到1.2之间，则将此环境胁迫物归类为无影响，且-如果含应激诱导型启动子序列的微生物的信噪比高于1.2，且比含组成型启动子序列的微生物之信噪比至少高50％时，将此环境胁迫物归类为具有诱导性和基因毒性。
14.检测样品中化合物是否具有基因毒性和/或毒性的设备，包括可由样品诱导的如权利要求1到9中任一项的诊断系统；还包括带有检测装置(2)的检测系统，其可以测定来自所述诊断系统中的信号，所述检测系统与计算机(1)相连，该计算机经编程按照前面权利要求11到13中任一项的方法进行分析。
全文摘要
本发明涉及一种诊断系统,包括:一种接触环境胁迫物质便能增加报道基因活性的转化微生物,此微生物具有应激诱导型启动子序列,启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接,此核酸序列编码产生可检测的信号的报道分子;和另一种转化微生物,它具有组成型和非应激诱导型启动子序列,该启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接,此核酸序列编码产生可检测的信号的报道分子。
文档编号G01N33/15GK1263561SQ99800549
公开日2000年8月16日 申请日期1999年4月12日 优先权日1998年4月14日
发明者D·范德勒里, L·A·L·J·B·雷尼尔斯, S·塔割哈威, P·G·G·科比斯尔, L·P·E.威萨维 申请人:佛兰芒技术研究所