一种双功能酸性脲酶结构基因及其表达和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酸性脲酶，特别是一种酸性双功能脲酶基因，属于生物工程技术 领域。
【背景技术】
[0002]氨基甲酸乙酯(EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中，自然生成的具有致 癌性的物质，由乙醇和尿素反应产生。由于氨基甲酸乙酯的致癌性，严格控制食品及酒精饮 料中氨基甲酸乙酯的含量已经备受关注。
[0003]尿素作为产生氨基甲酸乙酯的前体物质，主要由发酵过程中精氨酸代谢产生。因 此，从去除尿素的水平来控制酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量是一种比较可行的方案。目 前，通过向酒精饮料中添加适量脲酶以酶解法的方式去除尿素被视作最具高效性和特异性 的方法。
[0004]尽管有许多被认知的细菌脲酶和植物脲酶已经被广泛研究，但由于其最适pH均在 中性或碱性，大多数脲酶在实际应用中均受到限制。并且，我国出口黄酒中所用脲酶均为日 本进口，国际上关于氨基甲酸乙酯降解酶的报道也较少。因此，表达和生产一种酒用酸性脲 酶(最适PH2-5,乙醇耐受性达10%_20%)用以提升我国酿酒业的品质以及拓展国际市场具 有重要意义。
[0005]本发明中重组大肠杆菌所表达的可溶性脲酶，虽只具有脲酶的结构亚基，但体现 出与原始菌产酸性脲酶具有相同的双功能酶性质，表现出能同时分解尿素及氨基甲酸乙酯 的特性。这一特性使得酸性脲酶对于黄酒中EC含量的控制具有双重作用。进而能进一步降 低黄酒中EC的含量，为将来此类双功能酶在黄酒中的应用奠定了基础。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的提供一种新的双功能脲酶基因核苷酸序列如下所述：
[0007] 1)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0008] 2)在SEQ ID NO. 1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90%，且具有脲酶及 氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。
[0009]含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本 发明要求保护的范围。
[0010]所述普罗维登斯菌JN-B815由本实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC No. 8326。
[0011]本发明的第二个目的是提供重组E.coli BL21(DE3)诱导表达可溶性脲酶的方法。
[0012] 本发明的第五个目的是脲酶在黄酒中的应用。
[0013]本发明技术方案：一种胞内表达来源于普罗维登斯菌JN-B815酸性脲酶的重组 E.coli BL21(DE3)的构建方法，是将来源于普罗维登斯菌JN-B815的酸性脲酶结构基因 ureABC导入E. co 1 i BL21 (DE3)中得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵制备含有结构 亚基的可溶性脲酶，并对酸性脲酶进行纯化。
[0014] 克隆方法可以采用化学合成法或PCR方法，本实验以PCR方法为例，但不限于PCR方 法，具体步骤为：
[0015] (1)用酸性脲酶结构基因序列设计一对引物Fs、Rs，以普罗维登斯菌JN-B815基因 组为模板扩增出目的基因ureABC:
[0016] Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRI)；
[0017]Rs：ACGCGTCGACTTAACCAAAGAAATAACGTTGGTTCAT(Sail)；
[0018]下划线表示酶切位点碱基序列。
[0019] (2)将目的基因ureABC连接至pET-28a载体上，获得重组载体pET-28a-ureABC，转 化E.coliJM109涂布于含有卡那抗性的LB固体平板上，培养12h，挑取阳性转化子接种于含 卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的重组载体送 往上海生工进行测序。
[0020] (3)将重组载体转化E.coliBL21(DE3)，获得重组E.coliBL21(DE3)。并以 1% 的 接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50yg/mL，37°C、200rpm培养至OD600值0.8~1.0 之间，加入IPTG至终浓度0 · 5mM，25°C、200rpm培养10h。
[0021] (4)将所得发酵液lOOOOrpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用10mL25mMpH7.0的柠 檬酸(pH4.5)缓冲液重新悬浮，超声破碎后，离心收集上清，获得脲酶粗酶液。
[0022] (5)将步骤4)中所得粗酶用镍柱亲和层析进行纯化。流动相A为含20mM咪唑的柠檬 酸缓冲液，流动相B为含500mM咪唑的柠檬酸缓冲液。
[0023]所述酸性脲酶基因来源于对本实验室筛选菌株普罗维登斯菌JN-B815提取基因组 进行克隆。酸性脲酶结构基因ureABC如SEQIDN0.1。
[0024] 所述表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0025]所获得结构亚基基因表达脲酶的粗酶液经镍柱亲和层析进行分离纯化，获得电泳 纯的酸性脲酶。
[0026] 经纯化所得可溶性酸性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活性。且脲酶与EC 降解酶活性比保持原酶一致，约为3:1。脲酶比酶活为2.lU/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活 为0.6U/mg。脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活均测于pH为4.5的柠檬酸缓冲液条件下。 [0027]经发酵条件优化，可溶性脲酶最高产量达0.69U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶酶活达 0.22U/mL〇
[0028]所用实验室模拟黄酒以先向柠檬酸缓冲液pH4.5中加无水乙醇至体积分数为 16%，后添加尿素至终浓度50mg·L-S配制而成。
[0029]模拟黄酒中尿素含量测定方法:二乙酰一肟法。
[0030] 酶活测定方法:采用靛酸蓝反应(Berthelot reaction)比色法
[0031]酶活定义:在常压，37°C，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生lwnol氨为1个酶活力单位。其中，尿素降解酶和氨基甲酸乙酯降解酶活力的测定分别采用 尿素和氨基甲酸乙酯作为底物。
[0032]本发明的有益效果:成功的构建了一种能可溶性表达结构亚基脲酶的重组菌，并 对脲酶进行纯化。证实了该酸性脲酶同时具有氨基甲酸乙酯降解酶活性，为酸性脲酶在酒 类饮料中的应用提供了优良的基础。
【附图说明】
[0033]图1阳性转化子菌落PCR电泳图(M:Marker; 1、2为真阳性，其他均为假阳性）。
[0034] 图2重组载体双酶切电泳图（M:Marker，1:重组载体2:重组载体EcoRI单酶切3:Sal I单酶切4:EcoRI，SalI双酶切）
[0035] 图3重组E·coliBL21 (DE3)全细胞SDS-PAGE图（M:Marker，1:重组载体诱导，2:重 组载体未诱导，3:pET-28a空载诱导）
[0036] 图4不同温度诱导重组E.coliBL21(DE3)SDS-PAGE图（M:Marker，l::重组载体未 诱导上清，2:重组载体未诱导沉淀，3:重组载体30°C诱导上清，4:重组载体30°C沉淀，5:重 组载体25°C诱导上清，6:重组载体25°C诱导沉淀，7:重组载体20°C诱导上清）
[0037]图5不同IPTG添加量对脲酶产量的影响
[0038] 图6不同诱导温度对脲酶产量的影响
[0039] 图7不同诱导时间对脲酶产量的影响
【具体实施方式】
[0040] LB(g/L):胰蛋白胨 10,酵母膏5，NaCl10，pH7.0;
[0041 ]大肠杆菌E.coliJM109(DE3)、E.coliBL21(DE3)和pET-28a载体由本研究室保藏 [0042]T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI、SalI、琼脂糖凝胶电泳Marker及共用Buffer购 自宝生物工程(大连)有限公司，SDS-PAGE电泳Marker购自碧云天生物科技有限公司。
[0043] 实施例1重组载体构建
[0044] 通过化