专利名称：一种长距离pcr扩增方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域的DNA热循环扩增方法。
背景技术：
长距离PCR扩增技术方法是进一步分析序列结构基因组学的基础，能够从核基因组中扩增超过20kb的片段，包括从cDNA中分离完整的基因(Rose，1991；Ohler and Rose，1992；Ohler et al.，1993)；包括分析一个群体中的高分子量限制性片段长度多态性(Ohler and Rose，1992；Ohler et al.，1993)。在生命科学研究中许多扑朔迷离的问题终将由核基因组研究的开启来回答。
长距离PCR的优点是对组织材料的量要求较小，可以从1ng或更少的样品(少于300拷贝，理论上可以是单细胞)中扩增出足够拷贝数的目的基因DNA序列(Barnes，1994)，因此，实验中就不必杀死整个动物就可以获取足够的材料，这非常有利于保护稀有珍稀动物。长距离PCR技术是1990年以后才逐渐发展起来的(Frood and Rose，1995)，目前还远不是一项常规技术，许多长距离PCR反应条件需要摸索，实验设计不容易实现。现在成功报导扩增片段长度多在3～7kb之间，文献报导扩增长度超过16kb序列并获得成功的例子只有少数(Erlich etal.，1991；Rychlik et al.，1990；Krishnan et al.，1991；Maga andRrichardson，1991；Kainz et al.，1992；Ohler and Rose，1992；Barnes，1994；Ponce and Micol，1991)。
当要扩增的PCR产物大小超过3～4kb时，一些普遍接受的“常规”PCR方案应该作一些改动，因为PCR混合物中的各种成分都对长距离PCR有影响。概括起来，高质量的DNA模板(Rychlik et al.，1990；Kainz et al.，1992)，DNA聚合酶的选择(Jeffreys et al.，1988；Krishnan et al.，1991；Maga and Richardson，1991；Poncce and Micol，1991)，引物的正确设计(Dieffenbanch et al.，1993；Ohler et al.，1993)，适宜的缓冲液条件(Ohler and Rose，1992；Myers andGelfand，1991)，都需要逐一摸索最适条件。另外，方法问题和热循环条件同样影响长距离PCR扩增(Frood and Rose，1994)。在PCR扩增产物的大小超过10kb时，这些条件要求更加苛刻。
发明内容
在对长距离PCR反应条件进行研究的基础上，本发明公开了一种长距离PCR扩增方法。
本发明方法主要包括以下步骤引物设计，反应体系建立，将按照设计合成的引物加入建立好的反应体系后，再在一定条件下进行热循环反应，反应完成后用电泳检测扩增的分子大小以确认目标片段的扩增完成。
具体操作按扩增要求设计并合成适合的引物；建立50～100μl反应体系，其中含DNA模板，引物，Taq DNA聚合酶，PCR buffer，dNTP，MgCl2，ddH2O，可加适当的辅助剂，并调节溶液pH值；热循环72℃预变性后，30～40个热循环，然后68℃完全延伸，最后在4℃终止反应并保温；琼脂糖凝胶电泳检测扩增分子的大小。
本发明可以通过以下操作得以实现第一步 引物设计在目的基因(目标片段)的两头设计引物，要求设计的上下游引物之间和引物自身之间，不能存在连续3个或以上的配位碱基；保证引物3’末端有8个碱基的游离；引物GC含量要达到30％以上；引物设计以GC开头，而以AT结尾。
用Primer 5程序设计长度为25个碱基的引物容易实现，该程序可以检测引物并确保长距离PCR扩增的效率。
第二步 反应体系建立采用50～100μl反应体系，含以下成分DNA模板 1～60ng每条引物 10～20pmolPCR buffer10μl
dNTP 0.02～0.04pmolTaq DNA polymerase 2.5～5UMgCl20.125～0.25pmolBSA 10～30ngTris-base1.5～3pmolddH2O 补足反应体积差额第三步 热循环PCR反应循环参数设置预加热72℃ 4～7min30个热循环变性98℃ 3～8sec复性65℃ 20～60sec延伸68℃ 10～40min延伸 68℃ 10～40min保温 4℃1～9h根据引物不同，热循环中复性温度和延伸温度可有所不同。
第四步 电泳检测用合适浓度的琼脂糖凝胶，加扩增产物到样品孔，加合适的分子量标准(Marker)作为分子量标记，电泳，EB染色，紫外灯下观察、记录。
本发明公开了一种长距离PCR扩增方法，可应用于动物学、植物学、微生物、细菌、病毒等基因组大片段DNA或者RNA的扩增，扩增产物大小可达到35kb。
长距离PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计，计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效；所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值。
所设计的上下游引物之间和引物自身之间，不能存在连续3个或以上的配位碱基；保证引物3’末端有8个碱基的游离；引物GC含量30％以上；引物设计以GC开头，而以AT结尾。
寡核苷酸引物、核酸模板在纯度、GC含量和二级结构方面的差别，DNA可能的化学修饰、核酸类似物或其它的特征，这些都能够影响PCR扩增的效率；PCR反应比较粗放时，一定的引物模板复合体会导致非特异扩增或者期望的PCR产物得率很低；通过修改特定条件下扩增反应的缓冲液组分，将可能提高期望的PCR产物的产率和特异性，比如使用增强反应特异性的辅助剂小牛血清BSA，并用Tris调节反应体系的pH值至pH9.0～9.8。
长距离PCR扩增中，一个非常短的加热步骤是非常必要的；因此需要一个预热步骤，预热温度设置在72℃，4～7min便于引物和模板DNA的结合。
变性温度达到98℃时，3～8sec处理将会得到大小10～35kb的扩增产物。延伸温度设定在68℃，延伸时间根据DNA聚合酶延伸速度(1kb/min)来设定；相应的减少反应体积(30μl)，会得到更好的结果。
本发明具有以下优点药品费用低，主要费用在后期的测序；技术简单可靠，对设备要求低，在普通的分子生物学实验室即可实现；材料要求量少，仅微量动物组织(如1ng线粒体DNA)即可，特别适用于稀有的不可重复得到的生物材料。
具体实施例方式
实施例1线粒体DNA(mtDNA)长距离PCR扩增实验材料冷冻整体材料(液氮冷冻后在-20℃保存)皱纹齿突蟾(Scutigerruginosus)，标本编号为XM956，XM957，XM958，XM972。标本保存在中国科学院成都生物研究所两栖爬行动物研究室。
肌肉组织mtDNA提取10g冷冻肌肉组织，剪碎，放入研钵，加液氮迅速研磨成粉末状；加50ml SE液，混匀，转入6个10ml离心管；吸管吹打，静置10min；重复吹打3次；静置10min；小心吸取上清液，转入数个2ml的Eppendorf管，1000g离心10min，弃沉淀，转移上清液至新的Eppendorf管，12000g离心15min，弃上清；收集沉淀至2ml的Eppendorf管，加PBS缓冲液清洗3次；加1ml的SDS提取缓冲液，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，50℃温浴2小时；500g离心10min，用口径φ3mm的宽枪头吸取上清、转入新的2mlEppendorf管，酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；取上清液转入新的2mlEppendorf管，加2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA；5000g离心3min，无菌条件下风干；加500μl TE溶解，4℃保存备用；分别测定以上DNA溶液在260nm、280nm、310nm的光吸收值，以确定DNA的浓度和纯度，依照本方法提取的肌肉组织mtDNA的产率为1.8μg/g，光吸收值A260/A280的比值为1.6759；用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA，EB染色，紫外灯下观察并照相记录。
PCR预扩增以所提取的皱纹齿突蟾(XM958)mtDNA溶液为模板，作PCR扩增。采用的通用引物P7/P8和L1091/H1478序列见表1，PCR扩增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段，PCR产物的纯化和序列测定由上海基康公司完成。
采用常规PCR扩增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段。
电泳检测，用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，EB染色，紫外灯下观察并照相记录。采用通用的特异引物P7/P8，L1091/H1478(见下表)分别扩增出约420bp、530bp的片段。测序和BLAST检索，证明该扩增片段是线粒体rRNA基因片段。
Name SequenceReferenceP75’-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’Kocher etP85’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’ al(1989)L1091 5’-GCTTGAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’ Kocher etH1478 5’-TGACTCTGCAGAGGGTGACGGGCGGGTGTGT-3’ al(1989)引物设计原理是根据扩增出的12S rRNA基因和16S rRNA基因两个片段的两头设计引物，因为mtDNA是环形，这样就可以反方向将整个mtDNA序列扩增出来。
已测定393bp的12S rRNA基因部分片段序列，正链5’-GCTTCGACTGGGCTTTGATTCCTTACATTTTATTCGCCAGGGGACTACGAGCGCAGCTTAAAAC
CCAAAGGACTTGGCGGTGCCCTACACCTCCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAATCCACGATACACCTCACCGTTTCTTGCCAAAACCGCCTATATACCGCCGTCTTCAACTTACCCTATGAAGGATTCACAGTAAGTTCAATGATCACCCATCAGAACGTCAGGTCAAGGTGTAGCGAATGAAACGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTATTTTAGACTACACGGATAATCAGTATGAAACCTGATTTTGAAGGAGGATTTAGCAGTAAAAAGAAATCAGAAAGTTCTTTTTAAGTCGGACCTAGGGCGCGTACACACCGCCCGC-3’已测定526bp的16S rRNA基因部分片段序列，正链5’-GGACGCCTGCCGGTGACACTTGTTCAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCGAAGGTAGCGTAATCACTTGTCTTTTAAATAAAGACTAGTATGAATGGCATCACGAGGACTTAACTGTCTCCCCCCTCCTATCAGTGAAACTGATCTCCACGTACAAAAGCGAGGATGACATCATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAAACTAAAATCCACCTGTTTAACCCACTGTCTTATCGCAGTGCTAAAATAATAGGACCGGTTTGAGTTTTCAGTTGGGGTGACTTTGGAGGAAAATAAATCCCCCATGAAGACTTAAGCTTTGAGCGACCACTCTATGCATTAGTAAACCTAACTTATTTGACCCAATATTTTGATCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCATTTCAAGAGTCCATATCGACAAATGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATTAGGACATCCTAATGGTGCAGCCACTACTAAGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’根据上述所测得的12S rRNA和16S rRNA基因部分序列，拼接后用primer-5程序得到设计引物W2990和W2991，序列如下W2990上游引物5’-GAA ATC CTC CCT GAT GAC TCA CAA A-3’W2991下游引物5’-CTG CTA AAT CCG CCT TCC AAC CA-3长距离PCR扩增以皱纹齿突蟾(XM958)肌肉中提取的mtDNA为模板，以上述设计的引物W2990/w2991为引物，作长距离PCR扩增。
本长距离PCR扩增采用100μl反应体系，含以下成分DNA模板(180μg/ml) 6μl每条引物(4pmol) 4μlLA-PCR buffer II(Takara) 10μldNTP(10mM) 4μlLA-Taq DNA polymerase(5U/μl)(Takara)1μl
MgCl2(25mM) 10μlBSA(1mg/ml)20μlTris-base(2M) 1.5μlddH2O 39.5μl分装3个薄壁管，每管33μl，每管再加40μl的oil。
PCR反应循环参数设置预变性72℃ 5min30个循环变性98℃ 5sec复性65℃ 30sec延伸68℃ 17min延伸68℃ 20min保温4℃9h用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测长距离PCI产物，EB染色，紫外灯下观察，产物大小与预想的一致，为16kb左右。
实施例2λDNA的扩增。
以λDNA为模板(Promega，上海)，引物，反应体系同实施例1，除30个热循环的延伸时间为38min外，其它热循环参数同实施例1。电泳检测表明，扩增得到35kb的DNA片段。
权利要求
1.一种长距离PCR扩增方法，包括以下步骤引物设计，反应体系建立，将按照设计合成的引物加入建立好的反应体系后，再在一定条件下进行热循环反应，反应完成后用电泳检测扩增的分子大小以确认目标片段的扩增完成。
2.权利要求1所述的长距离PCR扩增方法，具体步骤是按扩增要求设计并合成适合的引物；建立50～100μl反应体系，其中含DNA模板，引物，TaqDNA聚合酶，PCR buffer，dNTP，MgCl2，ddH2O，可加适当的辅助剂，并调节溶液pH值；热循环72℃预变性后，30～40个热循环，然后68℃完全延伸，最后在4℃终止反应并保温；琼脂糖凝胶电泳检测扩增分子的大小。
3.根据权利要求1或2所述的长距离PCR扩增方法，其引物设计要求设计的上下游引物之间和引物自身之间，不能存在连续3个或以上的配位碱基；保证引物3’末端有8个碱基的游离；引物设计以GC开头，而以AT结尾。
4.根据权利要求1或2所述的长距离PCR扩增方法，其反应体系中加入1.5～3pmol的Tris-base调节反应体系的pH值至pH9.0～9.8。
5.根据权利要求1或2所述的长距离PCR扩增方法，其热循环参数设置预加热72℃，时间4～7min；每个热循环采用98℃变性，时间3～8sec。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，针对较长基因序列的扩增条件苛刻等困难，公开了一种长距离PCR扩增方法，扩增方法包括以下步骤引物设计，反应体系建立，将按照设计合成的引物加入建立好的反应体系后，再在一定条件下进行热循环反应，反应完成后用电泳检测扩增的分子大小以确认目标片段的扩增完成，本发明具有费用低，需要材料少等优点。
文档编号C12P19/34GK1632130SQ20031010406
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者莫邦辉, 曾晓茂, 郭骁才 申请人:中国科学院成都生物研究所