专利名称：通过连接经编码的衔接子进行测序的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及测定多核苷酸的核苷酸序列的方法，更具体地涉及通过经编码的衔接子的特异性连接鉴定多核苷酸的末端核苷酸的方法。
背景几乎所有被选择用于科研和商业的DNA测序法都基于由Sanger开创的双脱氧链终止法，如Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，745463-5467(1977)。已由几个途径入手改良了此方法，多种形式的此方法已被用于所有商用的DNA测序仪中，如Hunkapiller等，科学，25459-67(1991)。
链终止法需要产生一套或多套经标记的DNA片段，每套片段具有相同的来源，以已知的碱基终止，然后必需通过大小分离一套或多套片段以得到序列资料。通常通过高分辨率的凝胶电泳来完成大小分离，所述凝胶电泳必需具有区分大小差异仅为1个核苷酸的很大的片段的能力。尽管已作了显著改良，如使用毛细管阵列进行分离和使用了非-凝胶电泳分离介质，但此技术仍不能使其自身小型化或大规模地平行实施。
已研究出的几种所谓的“一个碱基一个碱基地”或“单个碱基地”测序方法可替代基于Sanger法的DNA测序法，如Cheeseman，美国专利5,302,509；Tsien等，国际申请WO91/06678；Rosenthal等，国际申请WO93/21340；Canard等，基因，1481-6(1994)；和Metzker等，核酸研究，224259-4267(1994)。这些方法的特征在于每个化学或生物化学操作循环测定一个核苷酸，而不需要分离步骤，因此，如果它们能按预想的那样完成，“一个碱基一个碱基地”测序法保证能对结合在微粒或固相阵列上的靶多核苷酸平行地进行成千上万次测序反应，如国际专利申请PCT/US95/12678(WO96/12039)。
不幸的是，“一个碱基一个碱基地”测序方案因存在很多问题而未得到广泛应用，所述问题如阻止在完整的测序操作中测定超过几个核苷酸的任何核苷酸的无效化学。另外，在需要酶促操作的一个碱基一个碱基的测序法中随着自动化进程所用的检测设备会产生其它的问题。当在具有高表面积/体积比率和狭窄的通道尺寸的反应室中进行一系列酶促步骤时，酶可能会粘附在表面成分上，使得洗涤和相继的处理步骤变得非常困难。蛋白质的积累也会影响报道分子系统，尤其是那些利用荧光标记物的系统，从而使基于这种系统的检测结果的解释变得困难和麻烦。这些困难和类似的困难显著阻滞了“一个碱基一个碱基地”测序方案在平行测序努力中的应用。
如果可以利用另一种使利用多种酶的重复处理循环最小化或消除的方法来检测多核苷酸的末端核苷酸，一个碱基一个碱基地测序技术尤其在自动化系统中会取得重要进展。
发明概述因此，本发明的目的是提供不具有目前使用的一个碱基一个碱基的测序方法之缺点的DNA测序方案。
本发明的另一目的是提供能平行地或同时应用于同一反应管中存在的数以千计的DNA片段的DNA测序法。
本发明的另一目的是提供能允许用最少的酶促步骤鉴定靶多核苷酸之末端部分的DNA测序法。
本发明的另一目的是提供一套经编码的衔接子以鉴定一个或多个靶多核苷酸之多个末端核苷酸的序列。
本发明通过提供基于一套或更多套经编码的衔接子与靶多核苷酸的末端(或当用于平行测序操作时为多个靶多核苷酸的末端)连接的核酸分析方法来达到这些和其它目的。每个经编码的衔接子含有突出的链和选自最少交叉杂交套寡核苷酸的寡核苷酸标记物。连接经编码的衔接子，所述衔接子的突出链与靶多核苷酸之互补的突出链形成完全匹配的双螺旋。连接后，通过使经标记的标记物互补物与其在经连接的衔接子上的相应标记物特异性杂交测定或“解码”突出链中的核苷酸和排列次序。
例如，如果具有4个核苷酸，即5’-AGGT之突出链的经编码的衔接子与靶多核苷酸之互补的突出链形成完全匹配的双螺旋，并且被连接的话，通过选自一套各针对突出链每一种可能的4个核苷酸序列的256个这种标记物的独特的寡核苷酸标记物，可鉴定出多核苷酸上的4个互补的核苷酸3’-TCCA。在仅允许那些与经连接的衔接子的寡核苷酸标记物形成完全匹配的双螺旋(或三螺旋)的标记物互补物特异性杂交的条件下，将标记物互补物用于经连接的衔接子。标记物互补物可以单独使用，或作为一个或多个混合物使用，以测定寡核苷酸标记物，从而测定突出链的序列。
下文将更详细地解释，在序列分析中可将经编码的衔接子(i)如Brenner美国专利5,599,675和PCT公布号WO95/27080所述，作为涉及连接，鉴定和裂解之重复循环的处理步骤来鉴定一个或多个核苷酸，或(ii)作为“独立(stand alone)”的鉴定法，其中将多套经编码的衔接子应用于靶多核苷酸以使每套能鉴定靶多核苷酸不同部分的核苷酸序列；即在后一实施方案中，对每套衔接子单次连接，随后进行鉴定即可进行序列分析。
经编码的衔接子的重要特征是使用了寡核苷酸标记物，所述标记物是最少交叉杂交套寡核苷酸的成员，例见国际专利申请PCT/US95/12791(WO96/12041)和PCT/US96/09513(WO96/41011)。此套寡核苷酸的序列与相同套的其它每个成员的序列至少有2个核苷酸的差异，因此，此套的每个成员不能与其它任何成员具有少于2个错配的互补物形成双螺旋(或三螺旋)。优选最少交叉杂交套的每个成员与其它每个成员有与特殊应用所需套的大小一致的尽可能多的核苷酸有所不同。例如，当使用较长的寡核苷酸标记物，如12-至20-聚体以将标记物给予经编码的衔接子时，则优选最少交叉杂交套的成员之间的差异显著大于2。优选此套的每个成员与其它每个成员至少有4个核苷酸的差异，更优选此套的每个成员与其它每个成员至少有6个核苷酸的差异。本文将本发明的寡核苷酸标记物的互补物称为“标记物互补物”。
寡核苷酸标记物可以是单链，并被设计成可通过双螺旋的形成与单链的标记物互补物特异性杂交。寡核苷酸标记物可以是双链，并被设计成可通过三螺旋的形成与单链的标记物互补物特异性杂交。优选经编码的衔接子的寡核苷酸标记物是双链，它们的标记物互补物是单链，以通过三螺旋结构的形成使标记物与其互补物发生特异性杂交。
优选本发明的方法包括下列步骤(a)将经编码的衔接子与多核苷酸的末端连接，所述衔接子具有选自最少交叉杂交套寡核苷酸的寡核苷酸标记物和与多核苷酸突出链互补的突出链；和(b)通过将标记物互补物与经编码的衔接子的寡核苷酸标记物特异性杂交来鉴定多核苷酸突出链中的一个或多个核苷酸。
附图简述
图1A-1E图示阐明使用经编码的衔接子测定多个经标记的多核苷酸的末端核苷酸序列。
图2阐明了锚定于固相支持物上的完全相同的多核苷酸的自身连接现象。
图3A阐明了本发明优选方法中的步骤，所述方法中具有封闭的3’碳的双链衔接子与靶多核苷酸连接。
图3B阐明了在经由连接和裂解分段循环进行DNA测序的方法中优选实施方案的使用。
图4阐明了使用本发明的方法测定受试多核苷酸之末端核苷酸的资料。
图5图解描述了流动室和用于观察荷载有待测序cDNA分子的平面排列的微粒的检测装置。
定义本文所用术语“经编码的衔接子”与优先权文本美国专利申请流水号08/689,587中的术语“经编码的探针”是同义词。
本文所用术语“连接”是指一个或多个(通常为2个)寡核苷酸的末端之间共价键的形成。此术语通常指的是因下列反应导致的磷酸二酯键的形成寡1(5’)-OP(O-)(＝O)O+HO-(3’)寡2-5’→寡1(5’)-OP(O-)(＝O)O-(3’)寡2-5’所述反应通常由连接酶催化，其中寡1和寡2是两个不同的寡核苷酸或是相同寡核苷酸的不同末端。此术语包含寡核苷酸末端之间磷酸二酯键的非酶促形成以及非磷酸二酯共价键，如硫代磷酸酯键，二硫键等的形成。连接反应通常是模板驱动的，其中寡1和寡2的末端通过与模板链的特异性杂交而成为并列状态。模板驱动连接的特殊例子是具有互补突出链的两个双链寡核苷酸的连接。
本文有关寡核苷酸标记物所用的“互补物”或“标记物互补物”指的是寡核苷酸标记物与之特异性杂交以形成完全匹配的双螺旋或三螺旋的寡核苷酸。在特异性杂交产生三螺旋的实施方案中，寡核苷酸标记物可被选择为双链或单链，因此，当形成三螺旋时，术语“互补物”意味着包含单链寡核苷酸标记物的双链互补物或双链寡核苷酸标记物的单链互补物。
本文所用的术语“寡核苷酸”包括能利用规则模式的单体与单体间的相互作用，如Watson-Crick型碱基配对，碱基堆积，Hoogsteen或反向Hoogsteen型碱基配对等与靶多核苷酸特异性结合的天然或经修饰的单体或连键的线性寡聚体，如脱氧核糖核苷，核糖核苷，其端基异构形式，肽核酸(PNA)等。通常通过磷酸二酯键或其类似物连接单体以形成大小范围为几个，如3-4个单体单位至几十个，如40-60个单体单位的寡核苷酸。每当寡核苷酸由字母顺序，如“ATGCCTG”表示时，应理解除非另有说明，核苷酸从左至右为5’→3’次序，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，而“T”表示胸苷。本发明的寡核苷酸通常含有4个天然的核苷酸；然而，它们也可含有非天然的核苷酸类似物。本领域技术人员清楚地知道当使用具有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸时，如当需要由酶进行处理时，通常需要由天然核苷酸组成的寡核苷酸。
与双螺旋有关的“完全匹配”指的是组成双螺旋的多-或寡核苷酸链与另一个链形成双链结构，以使每条链的每一个核苷酸与另一条链的核苷酸进行Watson-Crick碱基配对。此术语也包括可能会使用的核苷酸类似物的配对，所述类似物如脱氧肌苷，具有2-氨基嘌呤碱基的核苷等。与三螺旋有关的“完全匹配”指的是三螺旋由完全匹配的双螺旋和第三条链构成，其中第三条链中的每一个核苷酸与完全匹配的双螺旋的碱基对进行Hoogsteen或反向Hoogsteen连接。与之相反，标记物和寡核苷酸之间双螺旋中的“错配”指的是双螺旋或三螺旋中的核苷酸对或三联体无法进行Watson-Crick和/或Hoogsteen和/或反向Hoogsteen键合。
本文所用的“核苷”包括2’-脱氧和2’-羟基形式的天然核苷，例见Kornberg和Baker，DNA复制，第2版(Freeman，San Francisco，1992)。与核苷有关的“类似物”包括例如Scheit，核苷酸类似物(JohnWiley，纽约，1980)；Uhlman和Peyman，化学评论，90543-584(1990)所述的具有经修饰的碱基组成成分和/或经修饰的糖组成成分的合成核苷等，仅有的先决条件是它们能特异性杂交。这种类似物包括经设计增强了结合特性，降低了复杂度，增加了特异性的合成核苷等。
本文所用的与多核苷酸有关的“序列测定”或“测定核苷酸序列”包括测定多核苷酸的部分以及完整的序列资料，即此术语包括靶多核苷酸的序列比较，指纹分析和类似水平的资料，以及靶多核苷酸中核苷，通常为每个核苷的快速鉴定和排序。此术语也包括靶多核苷酸内4种类型核苷酸中1，2，或3种的鉴定，排序和定位的确定。例如，在一些实施方案中，通过鉴定靶多核苷酸“CATCGC…”内的单一类型的核苷酸，如胞嘧啶的排序和定位，以使其序列被表示为二进制的密码子，如“C-(非C)-(非C)-C-(非C)-C”被表示为“100101”等即可实现序列测定。
本文所用的有关多核苷酸群体的术语“复杂度”指的是群体中存在的不同类分子的数目。
发明详述本发明涉及与一个或多个靶多核苷酸之末端特异性杂交的经编码的衔接子的连接。通过“解码”如此连接的经编码的衔接子的寡核苷酸标记物可得到发生特异性杂交之区域的有关序列资料。在本发明的一个方面，在交错切割点将多套经编码的衔接子与靶多核苷酸连接，以使经编码的衔接子提供靶多核苷酸多个部分中每一个的序列资料。上述部分可以是非连接的，重叠的或邻接的；然而，优选所述部分是邻接的，它们共同允许鉴定等于各个部分长度总和的核苷酸序列。在此方面，仅需单次连接经编码的衔接子，接着可通过“解码”经连接的衔接子的标记物来鉴定。在本发明的另一方面，经编码的衔接子被用作包括连接，鉴定和裂解之重复循环的方法中的鉴定步骤，有关内容将在下文中更详细地描述。
在后一种实施方案中，本发明利用了核酸酶，所述核酸酶的识别位点与其裂解位点是分开的。优选这种核酸酶是II型限制性内切核酸酶。使用核酸酶在与经编码的衔接子连接的靶多核苷酸上产生突出链。在本发明给定实施方案中得到的序列资料的量部分取决于使用了多少这种核酸酶，和通过裂解产生的突出链的长度。
本发明的重要方面是平行测定很多靶多核苷酸之序列的能力，在此方面，本发明的方法包括下列步骤(a)将得自标记物所有组成成分的第一多核苷酸标记物与多核苷酸群体中的每个多核苷酸结合，以使得自所有组成成分的每个第一寡核苷酸标记物选自第一最少交叉杂交套；(b)对多核苷酸群体进行取样，以使所述群体中基本上所有不同的多核苷酸都结合有不同的第一寡核苷酸标记物；(c)将一个或多个经编码的衔接子与所述群体中每个多核苷酸的末端连接，每个经编码的衔接子具有选自第二最少交叉杂交套的第二寡核苷酸标记物，和与所述群体中多核苷酸突出链互补的突出链；(d)通过将第一寡核苷酸标记物与其各自的互补物特异性杂交，以分选所述群体中的多核苷酸，各自的互补物作为基本上相同的寡核苷酸的均一群体结合于一个或多个固相支持物上的空间上不连续的区域内；和(e)通过使标记物互补物与一个或多个经编码的衔接子的每个第二寡核苷酸标记物特异性杂交，以鉴定所述多核苷酸突出链中的一个或多个核苷酸。在此实施方案中，可在多核苷酸已被第一寡核苷酸标记物分选至固相支持物上之前或之后，将一个或多个经编码的衔接子与多核苷酸的末端连接。在优选的实施方案中，经编码的衔接子包括II型限制性内切核酸酶位点，所述位点可使经编码的衔接子从多核苷酸上裂解下来，而经序列鉴定之后多核苷酸可被缩短。
根据优选的实施方案，此方法进一步包括连接，鉴定和裂解之重复循环，以使每个循环中可鉴定一个或多个核苷酸。优选每个循环中可鉴定2至6个核苷酸，并确定它们的次序。
不经连接和裂解循环的序列分析图1A至1E的实施方案阐明了本发明不经连接和裂解循环的序列分析。在此实施方案中，按下述制备k靶多核苷酸，也见Brenner，国际专利申请PCT/US95/12791(WO96/12041)和PCT/US96/09513(WO96/41011)。即样品取自与以小“t’s”标示的寡核苷酸标记物缀合的多核苷酸群体，这些标记物有时指的是分选用的寡核苷酸标记物，或“第一”寡核苷酸标记物。通过例如聚合酶链反应(PCR)或克隆扩增样品的标记物-多核苷酸缀合物给出图1A(14)-(18)所示的1至k缀合物群体。优选制备与(小“t”)标记物相反的缀合物末端以连接一个或多个衔接子，每个这种衔接子都含有核酸酶的识别位点，所述核酸酶的裂解位点与其识别位点是分开的。在被举例的实施方案中，使用了3个这种衔接子，本文称之为“裂解衔接子”。所用这种衔接子的数目取决于几个因素，包括所需序列资料的量，具有适当作用范围和裂解特征的II型核酸酶的可得性等等。优选使用1至3个裂解衔接子，衔接子被设计成可容纳不同的II型核酸酶，所述核酸酶裂解后能产生至少为4个核苷酸的突出链。
如果本发明的方法被用于cDNA群体的特征测序，则在连接裂解衔接子之前，可用具有高频识别位点的限制性内切核酸酶裂解标记物-多核苷酸缀合物，所述酶如TaqI，AluI，HinP1I，DpnII，NlaIII等。对于留下钝端的酶，如AluI而言，可用T4 DNA聚合酶产生交错切口的末端，例见上述Brenner的国际专利申请PCT/US95/12791和Kuijper等，基因，112147-155(1992)。如果通过用TaqI裂解制备靶多核苷酸，则可使用下列末端来连接cgannnn…-3’tnnnn…-5’因此，可按下述构建一例3个裂解衔接子套(1)NN...NGAAGA cgannnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCTTCTGCp t
nnnnnnnnnnnnnnn...-5’(2)NN...NGCAGCA cgannnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCGTCGTGCp tnnnn
nnnnnnnnnnn...-5’(3)NN...NGGGA cgannnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCCCTGCp tnnnnnnnn
nnnnnnn....-5’其中裂解衔接子(1)，(2)和(3)以大写字母表示，其各自的核酸酶BbsI，BbvI和BsmFI的识别位点以下划线表示，5’磷酸以“p”表示。靶多核苷酸的双划线部分表示连接和裂解之后突出链的位置。在所有情况下，靶多核苷酸只留下4个核苷酸的5’突出链，显然，使用不同数目和种类的核酸酶可构建很多不同的实施方案。如Brenner，美国专利5,599,675和WO95/27080中所讨论的，优选在裂解之前，通过例如甲基化封闭内部的BbsI，BbvI和BsmFI位点以防止靶多核苷酸内部位点处不必要的裂解。
再回到举例用的上述实施方案，裂解衔接子A1，A2和A3以1∶1∶1的浓度比例与k个靶多核苷酸连接(20)，给出图1B所示的缀合物，以使每个标记物-多核苷酸缀合物群体内有大致相等数目的结合有A1，A2和A3的缀合物。连接(20)之后，用每个裂解衔接子的核酸酶相继裂解靶多核苷酸并与一套经编码的衔接子连接。首先，用裂解衔接子A1的核酸酶裂解(22)靶多核苷酸，然后，将第一套经编码的衔接子与所得的突出链连接。裂解导致约1/3各种类型的靶多核苷酸，即t1，t2，…tk可用于连接。优选经编码的衔接子可作为一种或多种衔接子的混合物被使用，所述混合物合在一起含有突出链每一种可能的序列。选择反应条件以仅连接其突出链与靶多核苷酸的突出链形成完全匹配的双螺旋的经编码的衔接子，从而形成经编码的缀合物(28)，(30)，和(32)(图1C)。具有下标的大写字母“T’s”表示经编码的衔接子携有独一无二的寡核苷酸标记物以用于标记。经编码的衔接子携有的寡核苷酸标记物有时指将标记物传递给经编码的衔接子的标记物，或“第二”寡核苷酸标记物。下文将要更详细地讨论的是，用于分选的单链寡核苷酸标记物优选仅由4种核苷酸中的3种组成，以使如Kuijper等人(见上文)所述的T4 DNA聚合酶“删除”反应可被用于制备靶多核苷酸以荷载于固相支持物上。另一方面，用于传递标记物的寡核苷酸标记物可由所有4种核苷酸组成。
如上所述，经编码的衔接子含有突出链(24)和寡核苷酸标记物(26)，因此，如果t1-多核苷酸缀合物的“A1”裂解产生下列末端5’-…nnnnnnnnn3’-…nnnnnnnnnacct那么寡核苷酸标记物T24可具有下列结构(SEQ ID NO1)tggattctagagagagagagagagagag-3’aagatctctctctctctctctctc其中双链部分可以是一套48个(＝12个核苷酸位置×4种核苷酸)双链20-聚体寡核苷酸标记物中的1个，所述标记物可与独一无二的标记物互补物形成完全匹配的三螺旋并与所有其它标记物互补物形成具有至少6个错配的三螺旋。在此例子中，经编码的衔接子可与总数为768(3×256)的一种或多种混合物中的靶多核苷酸连接。经编码的衔接子也可任选含有上文例子中所示的间隔区，其中4个核苷酸的序列“ttct”用作突出链和寡核苷酸标记物之间的间隔。
连接第一套经编码的衔接子(28)，(30)和(32)之后，用裂解衔接子A2的核酸酶裂解(34)标记物-多核苷酸缀合物，然后，使用第二套经编码的衔接子以形成缀合物(36)，(38)和(40)(图1D)，最后，用裂解衔接子A3的核酸酶裂解(42)标记物-多核苷酸缀合物，然后，使用第三套经编码的衔接子以形成缀合物(44)，(46)和(48)(图1E)，完成了经编码的衔接子的相继裂解和连接之后，经由下文将详细描述的，也例见Brenner，PCT/US95/12791或PCT/US96/09513中所述的寡核苷酸标记物t1-tk将混合物荷载(50)于一个或多个固相支持物上。如果分析的是单个靶多核苷酸，显然不需要多个寡核苷酸标记物t1，t2，…tk。在这种实施方案中，由于不需要分选，可将生物素或类似的组成成分用于锚定多核苷酸-经编码的衔接子缀合物。裂解，连接和荷载于固相支持物之步骤的次序取决于所实施的具体方案。例如，可首先将标记物-多核苷酸缀合物荷载于固相支持物，接着连接裂解衔接子，裂解之，连接经编码的衔接子；或首先连接裂解衔接子，接着荷载，裂解，连接经编码的衔接子；等等。
经编码的衔接子与本发明靶多核苷酸的末端连接之后，通过在允许经编码的衔接子的寡核苷酸标记物及其各自的标记物互补物之间形成完全匹配的双螺旋和/或三螺旋的条件下，将经标记的标记物互补物或单独或作为混合物相继用于固定的靶多核苷酸，即可得到序列资料。混合物的数目和复杂度取决于几个因素，包括所用标记系统的类型，其序列需被鉴定之部分的长度，是否使用了复杂度有所降低的类似物等等。对于图1a至1e所示的实施方案而言，优选使用单个荧光染料标记48(＝3×16)个标记物互补物中的每一个。单独将标记物互补物用于鉴定靶多核苷酸4个核苷酸部分每一个的核苷酸(即总数为48个核苷酸的12个位置的每一个的4个标记物互补物)。显然，不同长度的部分可能需要不同数目的标记物互补物，如根据此实施方案，5-核苷酸部分可能需要20个标记物互补物，2-核苷酸部分可能需要8个标记物互补物等等。在足够严紧以致于仅形成完全匹配的双螺旋的条件下使用标记物互补物，测定得自特异性杂交的标记物互补物上的荧光标记物的信号，从经编码的标记物上洗下标记物互补物以使下一个混合物可以被使用。16个标记物互补物与靶序列的4-聚体部分的下列序列具有一一对应的关系ANNN NANN NNANNNNACNNN NCNN NNCNNNNCGNNN NGNN NNGNNNNGTNNN NTNN NNTN NNNT其中“N”是核苷酸，A，C，G或T中的任一种，因此，针对每个核苷酸位置，每种核苷酸都有可能。此实施方案中体现出显著水平的丰余部分(总共使用16个标记物互补物以鉴定4个核苷酸)以换取核苷酸测定可靠性的增加。
通过使用4种光谱有区别的荧光染料可连续使用4种标记物互补物之12种混合物中的每一种，以使染料和核苷酸类型之间有一一对应的关系。例如，4种标记物互补物的混合物可鉴定突出链序列“nnxn”中的核苷酸“x”以使如果x＝A，可观察到第一种荧光标记物，如果x＝C，可观察到第二种荧光标记物，如果x＝G，可观察到第三种荧光标记物等等。
在类似于Brenner，国际专利申请PCT/US95/03678(WO95/27080)公开的“多次分段”法的方法中使用上述实施方案可得到其它的序列资料。在此实施方案中，本文称之为“分段衔接子”的第四个衔接子与裂解衔接子A1，A2和A3一起以例如3∶1∶1∶1的浓度比例与靶多核苷酸的末端连接，因此，大约有一半可利用的末端与分段衔接子连接。分段衔接子包括位于其中的II型核酸酶的识别位点，以使其作用范围(下文中限定)允许裂解经由裂解衔接子A1，A2和A3测定的序列末端的靶多核苷酸。可与上述套裂解衔接子一起使用的分段衔接子的例子如下所述NN...NCTGGAGA cgannnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NGACCTCTGCp tnnnnnnnnnnnn
nnnnn...-5’其中，如上所述，核酸酶(此时为BpMI)的识别位点为单划线，裂解位点的核苷酸为双划线。被分段衔接子的核酸酶裂解的靶多核苷酸可与另一套裂解衔接子A4，A5和A6连接，所述裂解衔接子可含有与裂解衔接子A1，A2和A3所含相同或不同的核酸酶识别位点。是否需要扩大套的经编码的衔接子取决于信号测定装置中是否能忍受裂解和连接反应。如果如上所述需要使与信号测定相关联的酶反应最小化，则必须使用多余套的经编码的衔接子。即当需要超过768个寡核苷酸标记物和标记物互补物，6个裂解反应产生各为4个核苷酸的突出链时，会需要1536个寡核苷酸标记物和标记物互补物(64个标记物互补物各24种混合物)。例举的裂解衔接子A4，A5和A6，具有与A1，A2和A3相同的核酸酶识别位点，可与上述分段衔接子一起使用，具体如下(4)NN...NGAAGACNN nnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCTTCTGp nn
nnnnnnnnnnnnnn...-5’(5)NN...NGCAGCACNN nnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCGTCGTGp nnnnnn
nnnnnnnnnn...-5’(6)NN...NGGGACNN nnnnnnnnnnnnnnnnnn...-3’NN...NCCCTGp nnnnnnnnnn
nnnnnn...-5’其中裂解位点以双划线表示，优选裂解衔接子A4，A5和A6以混合物的形式被使用，以体现出每一种可能的2-核苷酸突出链。
一旦经编码的衔接子已被连接，即可制备靶多核苷酸以荷载于固相支持物，优选荷载于微粒，例见Brenner，国际专利由请PCT/US95/12791(WO96/12041)。简单地说，用T4 DNA聚合酶进行“删除”反应可使用于分选的寡核苷酸标记物变成单链，例见Kuijper等(见上文)。在微粒上使单链寡核苷酸标记物与其标记物互补物特异性杂交并连接，然后如Brenner(见上文)所述在仪器中分析被荷载的微粒，所述仪器允许依次传递，特异性杂交和将经标记的标记物互补物转移给经编码的衔接子。
在经编码的衔接子仅与靶多核苷酸(或靶多核苷酸群体)连接1次的实施方案中，根据本发明可使用几种非酶促的模板-驱动的连接方法。这种连接方法包括但不限于Shabarova，Biochimie 701323-1334(1988)；Dolinnaya等，核酸研究，163721-3738(1988)；Letsinger等，美国专利5,476,930；Gryaznov等，核酸研究，222366-2369(1994)；Kang等，核酸研究，232344-2345(1995)；Gryaznov等，核酸研究，211403-1408(1993)；Gryaznov，美国专利5,571,677等文献所述。优选通过Letsinger等人(见上文)的方法进行非酶促的连接。在此方法中，具有3’-溴乙酰基化末端的经编码的衔接子与在5’末端具有互补的突出链和硫代磷酸基团的多核苷酸反应。例举的利用这种化学的经编码的衔接子具有下列结构BrCH2(＝O)CNH-(B)r(B)s(B)q(B)t-3’3’-zB’B’B’B’B’(B)r(B’)s(B’)q-5’其中B和B’是核苷酸及其互补物，z，r，s，q和t如下所述，Br，C，H和N具有其平常的化学含义。如上文参考文献所解释，在模板-驱动的反应中，3’-溴乙酰基化的寡核苷酸在含水条件下自发地与具有5’-硫代磷酸基团的寡核苷酸反应以形成硫代磷酸乙酰氨基连键。按Kang等人(见上文)所述，通过在腺苷-5’-O-(1-硫代三磷酸)，即g-S-ATP存在时用T4激酶处理可使硫代磷酸基团易于与靶多核苷酸的5’羟基结合。
经连接和裂解循环进行序列分析经编码的衔接子可用于基于衔接子的DNA测序法，所述测序法包括连接，鉴定和裂解的重复循环，如Brenner，美国专利5,599,675和PCT
发明者G·阿尔布雷克特, S·布伦纳, D·H·劳埃德, R·B·杜布里奇, M·C·帕拉斯 申请人:林克斯治疗公司