学合成法或PCR克隆法获得脲酶结构基因ureABC，本发明以PCR克隆法为例 进行介绍。
[0045] 为实现酸性脲酶基因在大肠杆菌中的表达，以酸性脲酶结构基因ureABC设计一对 基因引物。
[0046] Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRI)；
[0047] RS：ACGCGTCGACTTAACCAAAGAAATAACGTTGGTTCAT(Sail)；
[0048] 下划线表示酶切位点碱基序列。
[0049] 以普罗维登斯菌基因组为模板，Fs及Rs为引物扩增目的基因。PCR体系为(50yL): PrimerSTAR酶 25yL;基因组lyL;FslyL;RslyL;ddH20 22μΙ^ΡΟ?条件为：95°C预变性 10min; 95°C变性 15s，59°C退火 30s，72°C延伸 3min; 72°C后延伸 10min; 35 个循环。
[0050] 将扩增获得的目的基因与质粒pET_28a用EcoRI和SalI分别单酶切，单酶切体系如 下：
[0051 ] 双酶切体系（40yL)体系：目的基因/质粒12yL，限制酶2yL，双蒸水22yL，Buffer4y匕37°(3也〇1?I和Sail酶切反应6h，胶回收目的条带。
[0052]将双酶切后的目的基因与载体按8:1的比率混合，16°C过夜连接并转化E.coli JM109。涂布于含氨苄抗性（100yg/mL)的LB培养基中培养12-16h。挑取单菌落进行LB摇瓶培 养扩增及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组载体。
[0053]大肠杆菌感受态细胞的制作：
[0054] (1)挑取E.coliJM109单菌落接种到5mLLB试管培养过夜，37°C，200rpm( 10h);
[0055] (2)以1 %接种量接到50mLLB三角摇瓶中，37°C培养2-3h，至0D_达到0.5左右； [0056] (3)将菌体转至无菌的，用冰预冷的50mL离心管，在冰上放置lOmin，使培养物冷 却，4°C、4000rpm离心lOmin，弃上清，将管倒置lmin，使培养液流尽，收集菌体细胞；
[0057] (4)用10mL预冷的O.lmol/L的CaCl2悬浮细胞，冰上放置30min;
[0058] (5)4°〇、4000印111离心10111；[11，弃上清，加入41111^预冷的含0.11]1〇1/]^3(]12的20%甘油 溶液，悬浮细胞，冰上放置；
[0059] (6)将感受态细胞分装至无菌的2mL离心管中，每管200ul，保存于-80°C冰箱。
[0060] 并将构建成功重组载体转入E.coliBL21(DE3)获得重组E.coliBL21(DE3)。
[0061] 实施例2重组E.coli BL21(DE3)诱导表达可溶性酸性脲酶挑取以上重组E.coli BL21(DE3)，并以1%的接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50yg/mL，NiS〇4〇.05g/L， 37°C、200rpm培养至0D6QQ值0·8~1·0之间，加入IPTG至终浓度0· 5mM，25°C、200rpm培养10h。 将所得发酵液l〇〇〇〇rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用10mL 25mM pH4.5的柠檬酸缓冲液 重新悬浮，超声破碎后，离心收集上清，获得脲酶粗酶液。
[0062]实施例3酸性脲酶的纯化将上步获得脲酶粗酶液置于中性PBS缓冲液中透析24h。经柱体积为30mL的镍柱进行亲和层析纯化。流动相A为含20mM咪唑roS，流动相B为含500mM 的roS，流速为0.5mL/min。最终获得脲酶经SDS-PAGE验证达到电泳纯。经纯化所得可溶性酸 性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活性。且脲酶与EC降解酶的比活比例保持与原酶 一致，约为3:1。脲酶比酶活为2.lU/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活为0.6U/mg。
[0063]实施例4脲酶发酵条件优化
[0064] (1)将实施例4中的重组E.coliBL21(DE3)接种于LB中，并置于温度分别为16°C、 20°C、25°C、30°C、37°C中进行不同诱导温度诱导，其中优选25°C，见图6。
[0065] (2)将实施例4中的重组E.coli BL21(DE3)接种于LB中，并添加不同终浓度IPTG进 行诱导，见图5。
[0066] (3)将实施例4中的重组E.coliBL21 (DE3)接种于LB中，并以不同的诱导时间进行 诱导，其中优选10小时，见图7。
[0067]经发酵条件优化后，重组E.coli BL21(DE3)最终产酶量有所增加，脲酶酶活达0.68U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶酶活达0.22U/mL。
[0068]实施例7脲酶在模拟黄酒中的应用
[0069]向实验室自制模拟黄酒50mL中加入5U实施例5中的脲酶，将装有模拟黄酒的容器 封闭，室温下静置。每隔6h，用二乙酰一肟法测定模拟黄酒中尿素含量，结果如表1所示，30h 后，尿素除去率大于50%。
[0070] 表 1
[0071]
【主权项】
1. 一种双功能脲酶结构基因，其特征在于核苷酸序列如下所述： 1) 核苷酸序列如SEQIDN0.1所示； 2) 在SEQIDNO. 1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90%，且具有脲酶及氨基 甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。2. 含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌。3. 含有权利要求1所述脲酶结构基因的表达载体或克隆载体。4. 权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为重组E.coliBL21 (DE3)〇5. 权利要求4所述表达脲酶的重组E.coliBL21 (DE3)的构建方法，其特征在于将权利 要求1所述脲酶结构基因ureABC导入E.coliBL21中得到一种基因工程菌;步骤为： (1) 克隆脲酶基因ureABC到表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-ureABC; (2) 将步骤1)中所构建的重组质粒pET-28a-ureABC送去测序； (3) 将测序正确的重组质粒pET-28a-ureABC转化E.coliBL21(DE3)获得重组E.coli BL21(DE3)〇6. -种制备权利要求1所述双功能脲酶的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将权利要求4中所述的重组E.coliBL21 (DE3)活化后培养至0D6Q()值0.8~1.0之间， 加入IPTG诱导培养； (2) 将所得发酵液高速离心，细胞沉淀用柠檬酸缓冲液重新悬浮，超声破碎后，高速离 心收集上清，获得脲酶粗酶液或加工后获得酶制剂产品。7. 权利要求6所述的方法，其特征在于:所述重组E.coliBL21 (DE3)的诱导温度为27°C 进行诱导培养。8. 权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组E.coliBL21 (DE3)诱导培养10小时。9. 权利要求1所述双功能脲酶在黄酒酿造中的应用。10. 权利要求2所述基因工程菌在黄酒酿造中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种酸性脲酶结构基因及其表达和应用。本发明是将来源于普罗维登斯菌JN-B815(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC？No.8326)的脲酶结构基因ureABC连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上，然后将重组质粒pET-28a-ureABC导入E.coli？BL21(DE3)。用此重组菌能表达含有结构亚基的可溶性酸性脲酶。经镍柱纯化后，此脲酶体现出与原始菌中提取的酸性脲酶具有相同的性质，同时体现出脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/80, C12H1/15, C12N15/55, C12N1/21, C12R1/19
【公开号】CN105462998
【申请号】CN201510981779
【发明人】田亚平, 张迁, 张智威, 周楠迪
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月23日