快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法
【专利摘要】快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，属于基因工程的技术领域，通过检测待测谷子中ALS基因第1877位脱氧核糖核苷酸来进行鉴定，采用能够扩增含有ALS基因第1877位碱基的引物对扩增待测谷子材料的基因组DNA，得到PCR扩增产物，用限制性内切酶酶切所述PCR扩增产物，得到大小不等的酶切产物片段，通过琼脂糖凝胶电泳查看酶切片段，鉴别纯合、杂合或敏感基因型，若酶切后为单条带，则待测谷子材料为不抗烟嘧磺隆谷子材料；若酶切后为两条带，则待测谷子材料为纯合抗烟嘧磺隆谷子材料；酶切后为三条带，则待测谷子材料为杂合抗烟嘧磺隆谷子材料。本方法简单，易操作，鉴定准确度高，成本低。
【专利说明】
快速鉴定谷子抗烟略横隆基因纯合、杂合、不抗型的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于基因工程技术领域，设及植物基因工程技术，具体设及一种快速鉴定 谷子抗烟喀横隆基因纯合、杂合或不抗的方法。
【背景技术】
[0002] 谷子本身不抗除草剂，谷子种植一直依靠人工间苗和除草，费工费时，制约谷子集 约化、规模化生产。抗除草剂谷子品种的培育，对谷子生产具有重要意义。近年来，河北省农 林科学院谷子研究所通过远缘杂交育成了系列抗咪挫乙烟酸除草剂的谷子新品种，实现了 谷田的化学除草；同时，提出通过选育抗、感拿捕净的同型姊妹系，二者按一定比例混合播 种，利用二者对除草剂的抗性差异，苗期通过喷施除草剂同步实现了谷子化学间苗、化学除 草的简化栽培谷子品种选育方法与栽培技术，并育成了系列品种，使谷子集约化、规模化生 产成为可能。目前生产中应用的抗除草剂谷子主要是拿捕净和咪挫乙烟酸类型。但长期使 用单一除草剂具有使杂草产生抗药性的潜在风险。因此，挖掘和利用可用于谷子育种的新 型除草剂抗性基因，对于拓宽谷子抗除草剂育种、增加谷子除草剂抗性的多样性具有重要 意义。
[0003] 对此本课题从加拿大引进的抗咪挫乙烟酸野生青狗尾草群体中筛选获得的抗烟 喀横隆突变体为材料，并与国内谷子杂交，创制了抗烟喀横隆除草剂谷子新种质YM15。烟喀 横隆属于横酷脈类除草剂，是ALS(乙酷乳酸合成酶)抑制类除草剂的主导产品，世界范围内 使用，具有高效、低毒、用量低、对环境友好等的特点，能有效防除多数一年生、多年生禾本 科杂草和阔叶杂草及莎草。培育抗烟喀横隆谷子对增加加谷子除草剂抗性的多样性具有重 要意义。
[0004] 然而，为了培育能够实现谷子化学间苗和除草的抗烟喀横隆谷子新品种，需要选 择抗、感烟喀横隆同型姊妹系，因此无法通过喷施除草剂来达到选育目的。目前鉴定除草剂 抗、感、杂合植株的主要方法有田间鉴定法和室内培养皿法。田间鉴定法即对穗行中的部分 植株喷施除草剂，通过抗性差异，判断其抗、感、杂合情况。室内培养皿法是收获种子后，取 部分用于室内培养皿发芽，通过喷施除草剂，观察其抗性差异，从而判断其抗、感、杂合情 况。然而该两种方法工作量大，不适于大批量鉴定；同时，该方法易受环境因素的影响，影响 判断结果。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术中的不足，提供了一种快速鉴定谷子抗烟喀横隆基因纯合、 杂合或不抗的方法。
[0006] 本发明为实现其目的采用的技术方案是：
[0007] 快速鉴定谷子抗烟喀横隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，通过检测待测谷子材料 中ALS基因第1877位的碱基进行鉴定，包括W下步骤：
[000引 A、基因组PCR扩增:采用扩增引物W待测谷子材料的基因组DNA为模板，进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物；
[0009] B、酶切处理:用限制性内切酶酶切得到的PCR扩增产物，得到酶切产物片段；
[0010] C、抗烟喀横隆基因的鉴定:通过琼脂糖凝胶电泳查看酶切产物片段，若酶切后为 单条带，则待测谷子材料为不抗烟喀横隆谷子材料;若酶切后为两条带，则待测谷子材料为 纯合抗烟喀横隆谷子材料;酶切后为=条带，则待测谷子材料为杂合抗烟喀横隆谷子材料。
[0011] 所述的扩增引物的引物名称与核巧酸序列如下：
[0012] Nicaps-F:3 '-TGCAAGCAGGGCTAAGATTG;
[0013] Nicaps-R:3 '-GTACCCCCTTTCATGCACAA。
[0014] 所述限制性内切酶为PvuK
[0015] 待测谷子材料的基因组DNA由下述方法获得:取待测谷子叶片100-200mg，用CTAB 法提取基因组DNA。
[0016] 步骤 A 基因组 PCR 扩增中，PCR 反应体系为：2XPCR mix，10i^l;Nicaps-F，0.扣l; Nicaps-R，0.5iil;待测谷子基因组DNA模板，化1; dd出0，祉1;总体积，20山。
[0017] 步骤A基因组PCR扩增中，PCR反应程序为：94 °C预变性4min，94 °C变性40 s，57 °C退 火 30s，72°C 延伸 8〇3,35个循环，72°(：保溫7111111。
[0018] 步骤B酶切处理中，酶切体系为:PCR扩增产物，7iU ; 10 X buf f er，1山;PvuI，0.化1; dd出0，1.祉1;总体积，10山，37 °C酶切30min。
[0019] 快速鉴定谷子抗烟喀横隆基因纯合、杂合或不抗型的试剂盒，所述试剂盒包括快 速鉴定谷子抗烟喀横隆基因纯合、杂合或不抗性的试剂，所述试剂为由SEQ ID NO. 1所示的 DNA分子组成的扩增产物。
[0020] 所述试剂盒在鉴定待测谷子烟喀横隆性状中的应用。
[0021] 本发明的有益效果是:本发明通过挖掘和利用可用于谷子育种的新型除草剂抗性 基因，对于拓宽谷子抗除草剂育种、增加谷子除草剂抗性的多样性具有重要意义，抗烟喀横 隆谷子种质的创制为培育新型除草剂谷子奠定了基础。本发明根据抗烟喀横隆基因 ALS活 性位点处单碱基的突变，建立了精准、简单快速鉴定抗、感、杂合烟喀横隆谷子的方法。与常 规室内培养皿和田间植株鉴定法相比，该方法具有结果稳定可靠，操作简便、快捷、自动化 程度高的优点。通过该分子标记辅助育种，可加快抗烟喀横隆谷子抗、感同型姊妹系配套品 种的培育，缩短育种周期，提高育种效率。
【附图说明】
[0022] 图1是不同中ALS抗烟喀横隆活性位点序列比较结果图。
[0023] 图2是PCR扩增产物图。
[0024] 图3是PvuI酶切鉴定图。
[0025] 图4是NiALS-CAPs在衡早X YMl5F2群体中的检测结果图。附图中，1: YMl5; 2:衡谷 12号;3-13为衡早X YMl 5杂交后的F2植株。
[0026] 图5 NiALS-CAPs标记在不同品种的PCR结果图。附图中，不同品种分别对应为：1: 冀谷19;2:冀谷31 ;3:冀谷37;4:中谷2;5:S80;6:石98622;7:特选5号；8:延谷13号；9:豫谷 18; 10:保508; 11:沧368; 12:晋谷21号、13:晋谷31号；14:晋谷32号；15:衡谷12:大同25号； 17:济0626:黄金苗。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。WYM15、烟喀横隆 敏感材料衡谷12号及衡谷12号XYM15F2后代为材料，建立了一种精准简单快速鉴定抗、感、 杂合烟喀横隆除草剂谷子的CAPs分子标记方法，对加快培育抗烟喀横隆谷子育种效率，缩 短育种周期具有重要意义。
[0028] 本发明的所用谷子的品种由河北省农林科学院谷子研究所保存，其中YM15是由从 加拿大引进了抗烟喀横隆的野生青狗尾草与国内谷子杂交，得到的抗烟喀横隆除草剂谷子 新种质，试剂均可W从市面上直接采购得到。
[0029] 一、YMl 5中抗烟喀横隆基因 ALS抗性位点验证
[0030] 烟喀横隆为乙酷乳酸合成酶（ALS)抑制类除草剂，通过抑制乙酷乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS)活性导致植物体内支链氨基酸的生物合成受阻，抑制细胞 分化，从而导致植物生长。ALS活性位点中保守位点的突变，往往会导致其对ALS抑制剂类除 草剂产生不同水平的抗性。Laplante等(2009)对野生突变抗烟喀横隆青狗尾草，研究表明 其抗性是由3'端活性位点处的单碱基G突变为T，导致密码子AGC突变为ATC，引起异亮氨基 酸替换甘氨酸引起的。
[0031] 为了验证该抗性位点，参考NCBI公布的抗烟喀横隆青狗尾草ALS基因序列 (GenBank accession no. :KF020517)和豫谷 1 号ALS基因 （GenBank accession no. :XM_ 004952503.2)序列，设计引物扩增了YM15、衡谷12号、及其他4份烟喀横隆敏感谷子材料矮 宁黄、冀谷19、豫谷18号、冀谷31、矮宁黄的3'端ALS序列，并对其进行测序。测序结果表明衡 谷12号和5份谷子材料在该位点处都为G，为不抗性烟喀横隆谷子，而YM15中为T与预测结果 一致(如图1)，说明YM15为抗性烟喀横隆谷子。说明该位点处的突变导致其产生烟喀横隆抗 性。将该抗性基因命名为NiALS。
[0032] 二、快速鉴定谷子纯合、杂合、敏感烟喀横隆除草剂基因的分子标记
[0033] 实施例1
[0034] 快速鉴定谷子抗烟喀横隆基因纯合、杂合或不抗的方法，待鉴定的谷子材料为 YM15、衡谷12号。
[0035] 通过检测待测谷子材料YM15、衡谷12号中ALS基因活性位点的单碱基进行鉴定，所 述ALS基因的核巧酸序列如GenBank accession no. :XM_004952503.2所示，通过研究设计 扩增引物，进行基因组PCR扩增，然后将PCR扩增后的扩增产物进行酶切，用琼脂糖凝胶电泳 进行鉴定：
[0036] 发明人通过对NiALS和敏感型ALS碱基突变处进行限制性内切酶分析，结果表明在 NiALS碱基突变处存在Pvun限制性内切酶识别序列CGATCG，而敏感型基因中该位点序列为 CGAGCG，不能被PvuII识别。因此通过研究设计引物，PCR扩增包含该位点的片段，用PvuII酶 切时，通过产生大小不同的带型，进而区分纯合、杂合、敏感基因型。如果纯合抗性基因则被 PvuII酶切后，产生两条大小不等的带型；如果是敏感型基因，则不能切开，带型为单带;如 果是杂合抗性则酶切后会出现纯合和敏感的两种带型，即=条带。通过琼脂糖凝胶电泳、紫 外成像仪观察便可区分。与聚丙締酷胺凝胶电泳相比，琼脂糖凝胶电泳具有方便、快捷、简 单的特点。
[0037] ①扩增引物的设计
[0038] 由于NiALS活性位点位于3'端，经过研究发现在该基因内设计引物，酶切后因片段 较小无法用琼脂糖凝胶电泳区分开。为了开发可用琼脂糖凝胶电泳鉴别的分子标记，通过 研究，获得该基因3'端外序列(如序列表所示）。W基因模板设计正向引物，3'端外序列设计 反向引物。
[0039] 引物序列为:化 caps-F: 3 ' -TGCAAGCAGGGCTAAGATTG;
[0040] Nicaps-R:3 '-GTACCCCCTTTCATGCACAA。
[0041 ]②待测谷子材料的基因组DNA模板的制备：
[0042] YM15基因组DNA模板的获得:取待测谷子YM15叶片100-200mg，用CTAB法提取基因 组DNA，得到YMl 5基因组DNA;
[0043] 衡谷12号基因组DNA模板的获得:取待测谷子衡谷12号叶片100-200mg，用CTAB法 提取基因组DNA，得到衡谷12号基因组DNA。
[0044] ③基因组PCR扩增
[0045] 按下述反应体系和反应程序进行PCR扩增：
[0046] PCR反应体系如表1所示：
[0047] 表 1
[0049] 反应程序为:94°C预变性4min，94°C变性4〇3,57°(：退火3〇3,72°(：延伸8〇3,35个循 环，72°C 保溫 7min。
[(K)加 ]PCR扩增产物如图2，PCR扩增产物片段长度为1300bp。
[0化1 ]④酶切鉴定
[0052] 取化IPCR扩增产物，用PvuI酶切验证。酶切体系如表2所示：
[0053] 表 2
[0化4]
[0055]酶切鉴定结果如图3,衡谷12号PCR扩增产物酶切后出现1293bp的单条带，说明衡 谷12号为敏感型（不抗)烟喀横隆的谷子，YM15PCR扩增产物酶切后产生804bp和498bp大小2 条带，条带大小与预期一致，说明YM15是纯合抗烟喀横隆的谷子。说明该标记可用于区分 抗、敏感烟喀横隆材料。将该标记命名为NiALS-CAPs。
[0化6] ⑤验证
[0化7] 直接测序法验证:通过检测待测谷子材料YM15和衡谷12号中ALS基因第1877位的 碱基进行鉴定，所述ALS基因的核巧酸序列如GenBank accession no. :XM_004952503.2所 示，包括W下步骤：
[005引曰、初步鉴别抗、不抗烟喀横隆谷子材料;通过直接测序，检测待测谷子材料YM15中 ALS基因第1877位脱氧核糖核巧酸是T，说明待测谷子材料YM15为抗性烟喀横隆谷子材料； 检测待测谷子材料衡谷12号中ALS基因第1877位脱氧核糖核巧酸是G，说明待测谷子材料衡 谷12号为不抗性烟喀横隆谷子材料；
[0059] b、纯合抗、杂合抗烟喀横隆谷子材料的鉴别:将检测出待测谷子材料YM15,通过测 序套峰观察，测序峰值为单峰，说明待测谷子材料YM15为纯合抗性烟喀横隆谷子材料。
[0060] 通过直接测序法验证了本方法是正确的，待测谷子材料YM15为纯合抗性烟喀横隆 谷子材料，待测谷子材料，衡谷12号为不抗性烟喀横隆谷子材料。
[0061 ] 实施例2、化415-〔4口3在。2群体中的验证
[0062] 为了进一步验证该标记的可行性，检测衡谷12号XYM15F2植株群体。F2植株在苗 期已喷施除草剂。故检测植株应为纯合或杂合抗性植株。PCR扩增及酶切同上。共检测68株， 部分检测结果如图4。在68株中出现两条带的有21株，=条带的有47株，未出现一条带的。根 据标记原理两条带为纯合抗性植株，=条带为杂合抗性植株，单条带的为敏感型，因为苗期 该群体已喷施除草剂，故未出现敏感类带型，检测结果与预期一致，部分检测结果如图4。另 外两条带植株数与一条带植株数比值为2: UP = O.7641 ,^ = 0.0901)，符合孟德尔遗传定 律中F2植株纯合显现:杂合:纯合显性= 1:2:1的定律。进而说明该标记鉴定结果准确可靠。
[0063] 分别取扩增出=条带和两条带部分植株DNA送去测序，根据测序套峰验证标记检 测的准确性。测序结果表明单条带的在突变位点处为单峰，为纯合抗性;而=条带的测序峰 值为套峰，为杂合抗性。与标记检测结果一致。说明该标记可准确检测纯合抗、杂合抗和对 烟喀横隆敏感的基因类型，结果准确可靠。
[0064] 实施例3、NiALS-CAPs在不同品种中的检测
[0065] 为了验证引物的特异性及imALS-CAPs标记适应性，检测了50份来自不同地区的谷 子品种。结果表明该引物在50份材料中都可扩增出目的大小的特异条带，PCR扩增产物PvuI 酶切结果为单条带，与预期结果一致。部分检测结果如图5。说明该标记可用于不同生态区 域，不同品种抗烟喀横隆谷子选育的分子标记，快速精准鉴定纯合抗、杂合抗和敏感型植 株，从而加快谷子烟喀横隆抗、感同型姊妹系配套品种的选育，提高育种效率。
[0066] 综上所述，挖掘和利用可用于谷子育种的新型除草剂抗性基因，对于拓宽谷子抗 除草剂育种、增加谷子除草剂抗性的多样性具有重要意义。抗烟喀横隆谷子种质的创制为 培育新型除草剂谷子奠定了基础。本研究根据抗烟喀横隆基因 ALS活性位点处单碱基的突 变，建立了精准、简单快速鉴定抗、感、杂合烟喀横隆谷子的方法。与常规室内培养皿和田间 植株鉴定法相比，该方法具有结果稳定可靠，操作简便、快捷、自动化程度高的优点。通过该 分子标记辅助育种，可加快抗烟喀横隆谷子抗、感同型姊妹系配套品种的培育，缩短育种周 期，提高育种效率。
【主权项】
1. 快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其特征在于，通过检测待 测谷子材料中ALS基因第1877位的碱基进行鉴定，包括以下步骤： A、 基因组PCR扩增:采用扩增引物以待测谷子材料的基因组DNA为模板，进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； B、 酶切处理:用限制性内切酶酶切得到的PCR扩增产物，得到酶切产物片段； C、 抗烟嘧磺隆基因的鉴定:通过琼脂糖凝胶电泳查看酶切产物片段，若酶切后为单条 带，则待测谷子材料为不抗烟嘧磺隆谷子材料;若酶切后为两条带，则待测谷子材料为纯合 抗烟嘧磺隆谷子材料;酶切后为三条带，则待测谷子材料为杂合抗烟嘧磺隆谷子材料。2. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，所述的扩增引物的引物名称与核苷酸序列如下： Nicaps-F:3 '-TGCAAGCAGGGCTAAGATTG; Nicaps-R:3 '-GTACCCCCTTTCATGCACAA。3. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，所述限制性内切酶为Pvul。4. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，待测谷子材料的基因组DNA由下述方法获得:取待测谷子叶片100-200mg，用CTAB 法提取基因组DNA。5. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，步骤A基因组PCR扩增中，PCR反应体系为：2 X PCR mix，ΙΟμΙ;Nicaps-F，0 · 5μ1; Nicaps-R，0.5μ1;待测谷子基因组DNA模板，ΙμL; ddH20，8μ1;总体积，20μ1。6. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，步骤Α基因组PCR扩增中，PCR反应程序为:94 °C预变性4min，94 °C变性40 s，57 °C退 火 30s，72°C 延伸 8〇8,35个循环，72°(：保温71^11。7. 根据权利要求1所述的快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法，其 特征在于，步骤B酶切处理中，酶切体系为:PCR扩增产物，7μ1; 10 X buf f er，ΙμL; Pvul，0.2μ 1; ddH20，1 · 8μ1;总体积，ΙΟμΙ，37 °C酶切30min。8. 快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的试剂盒，其特征在于:所述试剂 盒包括快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合或不抗性的试剂，所述试剂为由SEQ ID NO. 1所示的DNA分子组成的扩增产物。9. 权利要求8所述试剂盒在鉴定待测谷子烟嘧磺隆性状中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105861734SQ201610436007
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王根平, 张婷, 程汝宏, 师志刚
【申请人】河北省农林科学院谷子研究所