一种kras基因超低频突变检测试剂盒的制作方法

一种kras基因超低频突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测待测核酸样本目标区域的引物组合物及其应用，其中待检测核酸样本为双链DNA，包括第一链和与第一链互补的第二链，该引物组合物包括：通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物用于构成测序文库的5’端，所述第二通用引物的靶点位于待检测核酸样本的两条链上目标区域的5’端，用于构成测序文库的3’端；上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；以及下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组。该引物组合物能够有效地用于检测待测核酸样本目标区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测，且检测灵敏度高，结果准确可靠。
【专利说明】
-种KRAS基因超低频突变检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学领域，特别是突变检测技术领域，具体地，本发明设及一种 KRAS基因超低频突变检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 已知，疾病相关的基因及致病突变位点的检测，对于深入的遗传学和病理学研究 W及疾病治疗的用药和耐药性等研究，均有重要意义。
[0003] 然而，目前的基因突变的检测方法或者灵敏度较低，或者通量较低，无法满足多样 本同时检测的需求。
[0004] 因此，目前急需一种高通量、检测灵敏度高的基因突变检测手段。

【发明内容】

[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种高通量、检测灵敏度高的基因突变检测手段。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
[0007] 血浆游离肿瘤DNA(ci;rculating tumor DNA,CtDNA)是由肿瘤细胞释放到血浆中 的DNA，携带有与原发肿瘤组织相一致的基因突变信息，CtDNA检测作为一种无创检测方法， 能够真实反应实体瘤组织中的基因突变图谱与频率，是肿瘤早期诊断、治疗及预后评估重 要监测指标。
[000引 RAS基因家族与人类肿瘤密切相关的基因有S种-HRAS、KRAS和NRAS，运S种基因 编码的蛋白质大约有90%的氨基酸序列同源，分子量均为21KDa，又称为RASp21蛋白。RAS蛋 白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化可W有节制的调节P21对信号 系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号，从而影响细胞增殖、存活和分化过程，KRAS信 号通路是EGFR和其他信号转导的下游通路，当RAS基因发生突变时，其编码的RAS蛋白水解 GTP-RAS能力下降，使得信号转导通路一直处于持续激活状态，刺激细胞不断增殖分化，最 终导致细胞恶变。KRAS突变基因是一种常见的致癌基因，多见于恶性肿瘤，结直肠癌患者中 约有30 %~40 %存在KRAS基因突变，肺腺癌患者中约有15 %~30 %存在KRAS突变。KRAS突 变主要定位在第12、13、61和63号密码子，其中有7个突变热点：612(：、6121?、6125、612￥、 0120、6124、613￥/0，占邸45基因总突变的90%^上。
[0009]研究表明，KRAS基因突变与NS化C对吉非替尼、厄洛替尼等祀向治疗药物的原发性 耐药有关。有研究发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。 NCCN(非小细胞肺癌临床实践指南2016版)指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸 激酶抑制剂化GFT-TKI)产生耐药;使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所W NCCN(非小细胞肺癌临床实践指南2016版)提出肺腺癌患者接受EGF畔E向药物治疗之前，必 须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR祀向药物作为临床治疗措施。 因此检测KRAS基因的突变可作为EGFR祀向治疗耐药性产生的重要预测指标。
[0010] 目前临床检测DNA中基因突变的方法主要有3种：I)直接测序法:是目前应用最多 的一种检测方法，主要是Sanger测序，当突变基因得到有效富集之后，才能被测序，优点是 结果准确可靠，能读取到被检测序列信息，但有效富集突变基因区域，及在突变基因含量低 的情况下面临极大的挑战，一般用来确认其他检测阳性结果。2)巧光定量PCR法:在巧光定 量PCR平台上，利用特异的引物对DNA突变祀序列进行PCR扩增，利用巧光标记探针对扩增产 物进行突变检测，运样检测方法特异性强、灵敏度高，可检测到DNA含量低至1%的突变，但 探针成本昂贵，且只能检测已知突变位点，很难适应临床大通量样本检测。3)高通量测序技 术法:一般利用PCR技术对目标区域进行富集，然后构建适合于NGS上机测序的文库，最后上 机测序，信息分析获得感兴趣目标区域序列信息。但是在目前对目标区域富集过程中，富集 的特异性和有效性在不同的实验平台差距很大，导致最终检测的灵敏度和准确性存在很大 的波动，而且普通的建库流程繁杂，效率低，运些因素都影响到最终结果的可靠性。
[0011] 因此，目前急需一种快速，高效的检测KRAS基因突变的方法。
[0012] 进而，本发明人进行了一系列研究，并在研究游离血浆DNA的检测时发明了一种新 的CtDNA检测方法，即通过对游离血浆DNA片段连接特异的接头，然后进行高效特异性富集 目标区域，结合第二代高通量测序技术读取目标碱基序列。也即，发明人意外发现了一种高 通量、检测灵敏度高的基因突变检测手段，其不仅能够用于KRAS基因突变的检测，同样适用 于其他基因的目标区域检测，运些目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的 至少之一，尤其是超低频突变的检测。在此基础上，发明人特别基于KRAS基因对该方法进行 了改进，并针对KRAS基因设计了高效的引物，开发了一种通过血浆游离DNA检巧化RAS基因热 点突变的测序方法及其试剂盒。
[0013] 从而，在本发明的第一方面，本发明提供了一种用于检测待测核酸样本目标区域 的引物组合物。根据本发明的实施例，所述待检测核酸样本为双链DNA，包括第一链和与第 一链互补的第二链，该引物组合物包括：
[0014] 通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物用于构成测序文库的5'端，所述第二通用引物的祀点位于待检测核酸样本的两条链上 目标区域的5 '端，用于构成测序文库的3 '端；
[001引上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；W及
[0016] 下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组；
[0017] 其中，
[0018] 所述第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组均包 含n条目标区域特异性引物，且必须满足下列条件：
[0019] (1)所述第一上游引物组和所述第二上游引物组的各上游引物均同向延伸，祀点 均位于待检测核酸样本的第一链上目标区域的3'端;所述第一下游引物组和所述第二下游 引物组的各下游引物均同向延伸，祀点均位于待检测核酸样本的第二链上目标区域的3' 端；
[0020] (2)n=l-5的任意整数，Wn = 5为例，设所述第一上游引物组的各特异性引物分别 为:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二上游引物组的各特异性引物分别为:Ml、M2、M3、M4、M5，所述第一 下游引物组的各特异性引物分别为瓜瓜、83、84、85，所述第二下游引物组的各特异性引物 分别为:？1、？2爪、？4、？5，从特异性引物的祀点与目标区域之间的距离为衡量标准，各特异性 引物之间的距离远近关系为：
[0021] 化〉化〉化〉N4〉化；
[0022] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0023] 化〉Ml;
[0024] 化〉M2;
[0025] 化〉M3;
[0026] N4〉M4;且
[0027] 化〉M己，
[002引 Bi>化〉B3〉B4>化；
[0029] Pi>P2>P3>P4>P5；
[0030] Bi〉Pi;
[0031] B2〉P2;
[0032] B3〉P3;
[0033] B4〉P4;且
[0034] Bs〉P已。
[0035] 发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够有效地用于检测待测核酸样本目标 区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测。具体地，利用本发明的引物组合物，能够有效 地通过PCR扩增富集所述待测核酸样本目标区域的序列，进而进行建库、测序，从而能够有 效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基 因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠。
[0036] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒 包含:前面所述的引物组合物。根据本发明的实施例，该试剂盒能够有效地用于检测待测核 酸样本目标区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测。具体地，利用该试剂盒中的引物组 合物，能够有效地通过PCR扩增富集所述待测核酸样本目标区域的序列，进而进行建库、测 序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中所包含的点突变、 插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠，尤其适用于低频率突变的 检测。
[0037] 在本发明的第=方面，本发明提供了一种构建待测核酸样本的目标区域检测文库 的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的引物组合物或试剂盒，通过PCR扩增 富集所述待测核酸样本目标区域的序列。由此，能够有效地基于前述的本发明的引物组合 物或试剂盒进行建库，进而能够有效地用于测序，W确定待测核酸样本目标区域序列信息， 包括目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准 确可靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0038] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种确定待测核酸样本目标区域序列信息的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括:根据前面所述的构建待测核酸样本的目标区域检 测文库的方法，构建所述待测核酸样本的目标区域检测文库;对所述待测核酸样本的目标 区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及基于所述测序结果，确定所述待测核酸样 本目标区域的序列信息。
[0039] 发明人发现，利用该方法能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂盒构 建目标区域的测序文库和测序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括 目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可 靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0040] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种构建待测核酸样本目标区域检测文库的 装置。根据本发明的实施例，该装置设置有前面所述的引物组合物，所述装置包括：
[0041] 预扩增单元，所述预扩增单元用于对待测核酸样本进行预扩增，并将预扩增产物 均分为2份，分别作为第一预文库和第二预文库；
[0042] 特异性引物扩增单元，所述特异性引物扩增单元与所述预扩增单元相连，用于利 用第一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一 PCR扩增，然后利用第二上 游引物组和第二通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，W便获得第二PCR扩增产 物；同时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库进行第SPCR扩增，然后 利用利用第二下游引物组和第二通用引物对第SPCR扩增产物进行第四PCR扩增，W便获得 第四PCR扩增产物；W及
[00创通用引物扩增单元，所述通用引物扩增单元与所述特异性引物扩增单元相连，用 于混合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第二通用引 物对所述混合物进行第五PCR扩增，W便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增产物构成 所述待测核酸样本的目标区域检测文库。
[0044] 由此，利用该装置能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂盒进行建 库，进而能够有效地用于测序，W确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中所 包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠，尤其适用于 超低频突变的检测。
[0045] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种确定待测核酸样本目标区域序列信息的 系统。根据本发明的实施例，该系统包括：
[0046] 前面所述的构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置，用于构建所述待测核酸 样本的目标区域检测文库；
[0047] 测序装置，所述测序装置与所述构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置相 连，用于对所述待测核酸样本的目标区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及
[0048] 序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果， 确定所述待测核酸样本目标区域的序列信息。
[0049] 发明人发现，利用该系统能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂盒构 建目标区域的测序文库和测序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括 目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可 靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0050] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0051] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0052] 图I显示了实施例1中预文库扩增的PCR产物的电泳检测结果；
[0053] 图2显示了实施例1中通用引物扩增产物的电泳检测结果；
[0054] 图3显示了实施例2中预文库扩增的PCR产物的电泳检测结果；
[0055] 图4显示了实施例2中通用引物扩增产物的电泳检测结果；
[0056] 图5显示了根据本发明实施例，本发明的引物组合物的各引物的位置关系示意图；
[0057] 图6显示了根据本发明实施例的构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置的结 构示意图；W及
[0058] 图7显示了根据本发明实施例的确定待测核酸样本目标区域序列信息的系统的结 构示意图。
【具体实施方式】
[0059] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0060] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种用于检测待测核酸样本目标区域的引物 组合物。根据本发明的实施例，所述待检测核酸样本为双链DNA，包括第一链和与第一链互 补的第二链，该引物组合物包括：
[0061] 通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物用于构成测序文库的5'端，所述第二通用引物的祀点位于待检测核酸样本的两条链上 目标区域的5 '端，用于构成测序文库的3 '端；
[0062] 上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；W及
[0063] 下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组；
[0064] 其中，
[0065] 所述第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组均包 含n条目标区域特异性引物，且必须满足下列条件：
[0066] (1)所述第一上游引物组和所述第二上游引物组的各上游引物均同向延伸，祀点 均位于待检测核酸样本的第一链上目标区域的3'端;所述第一下游引物组和所述第二下游 引物组的各下游引物均同向延伸，祀点均位于待检测核酸样本的第二链上目标区域的3' 端；
[0067] (2)n=l-5的任意整数，Wn = 5为例，设所述第一上游引物组的各特异性引物分别 为:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二上游引物组的各特异性引物分别为:Ml、M2、M3、M4、M5，所述第一 下游引物组的各特异性引物分别为瓜瓜、83、84、85，所述第二下游引物组的各特异性引物 分别为:？1、？2爪、？4、？5，从特异性引物的祀点与目标区域之间的距离为衡量标准，各特异性 引物之间的距离远近关系为：
[006引化〉化〉化〉N4〉化；
[0069] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0070] 化〉Ml;
[0071] 化〉M2;
[0072] 化〉M3;
[0073] N4〉M4;且
[0074] 化〉M己，
[0075] Bi>化〉B3〉B4>化；
[0076] Pi>P2>P3>P4>P5；
[0077] Bi〉Pi;
[007引 B2〉P2;
[0079] B3〉P3;
[0080] B4〉P4;且
[0081] B己〉P己。
[0082] 发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够有效地用于检测待测核酸样本目标 区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测。具体地，利用本发明的引物组合物，能够有效 地通过PCR扩增富集所述待测核酸样本目标区域的序列，进而进行建库、测序，从而能够有 效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基 因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠。
[0083] 进一步，为方便理解，发明人用图5示出了上述引物组合物中各引物的位置关系。 如图5所示，?为待检测位点（即目标区域），USPl为第一上游引物，USP2为第二上游引物， DSPl为第一下游引物，DSP2为第二下游引物，UNP2为第二通用引物，其中图中未示出的"第 一通用引物"能够与第二上游引物和第二下游引物结合，用于构成测序文库的5'端。
[0084] 根据本发明的实施例，针对所述第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物 组和第二下游引物组中每一个，其包含的各特异性引物基于基因组位置上的顺序依次间隔 0-50对碱基对。由此，PCR扩增富集效果好。
[00化]根据本发明的实施例，化与化对应的基因组位置有重叠，化与M2对应的基因组位置 有重叠，N3与M3对应的基因组位置有重叠，N4与M4对应的基因组位置有重叠，化与Ms对应的基 因组位置有重叠，Bi与Pi对应的基因组位置有重叠，B2与P2对应的基因组位置有重叠，B3与P3 对应的基因组位置有重叠，恥与?4对应的基因组位置有重叠，Bs与Ps对应的基因组位置有重 叠，优选重叠10-15个碱基。由此，PCR扩增富集效果好。
[0086] 根据本发明的实施例，各特异性引物的GC含量均为30%-70%，时1值为55-68°C。由 此，扩增效果好。
[0087] 根据本发明的实施例，所述第一上游引物组和所述第一下游引物组的各特异性引 物的5'端均有生物素修饰。
[0088] 所述第二上游引物组和所述第二下游引物组的各特异性引物的5'端均含有第一 通用引物的祀点。由此，方便进行测序分析。
[0089] 根据本发明的实施例，第一通用引物： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO：7)；
[0090] 第二通用引物:〔446〔464464〔66〔414〔64(569 10^:8)。由此，利用本发明的引物 组合物富集目标区域序列后，能够方便地利用111皿ina测序平台（例如化xtSeqSOO)进行后 续的建库和测序，W便实现目标区域的检测。
[0091] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因2号外显子上，n=l，所述所述 第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组的各特异性引物分 别为：
[0092] 第一上游引物:TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGT(沈Q ID N0:3)，
[0093] 第二上游引物：AGATGTGTATAAGAGACAGCTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT(沈Q ID N0:4)，
[0094] 第一下游引物:CCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCG(SEQ ID N0:5)，
[00巧]第二下游引物：AGATGTGTATAAGAGACAGGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTG(SEQ ID N0:6)。由此，本发明的引物组合物能够用于KRAS基因 2号外显子的突变检测，并且检测灵敏 度高，结果准确可靠，且能够有效检测到超低频突变。
[0096] 根据本发明的实施例，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变 的至少之一。
[0097] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因上。
[0098] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒 包含:前面所述的引物组合物。根据本发明的实施例，该试剂盒能够有效地用于检测待测核 酸样本目标区域的序列信息，尤其是超低频突变的检测。具体地，利用该试剂盒中的引物组 合物，能够有效地通过PCR扩增富集所述待测核酸样本目标区域的序列，进而进行建库、测 序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中所包含的点突变、 插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠，尤其适用于低频率突变的 检测。
[0099] 在本发明的第=方面，本发明提供了一种构建待测核酸样本的目标区域检测文库 的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的引物组合物或试剂盒，通过PCR扩增 富集所述待测核酸样本目标区域的序列。由此，能够有效地基于前述的本发明的引物组合 物或试剂盒进行建库，进而能够有效地用于测序，W确定待测核酸样本目标区域序列信息， 包括目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准 确可靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0100] 根据本发明的实施例，其特征在于，所述方法包括：
[0101] 对待测核酸样本进行预扩增，并将预扩增产物均分为2份，分别作为第一预文库和 第二预文库；
[0102] 利用第一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一 PCR扩增，然后 利用第二上游引物组和第二通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，W便获得第二 PCR扩增产物；同时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库进行第SPCR 扩增，然后利用第二下游引物组和第二通用引物对第SPCR扩增产物进行第四PCR扩增，W 便获得第四PCR扩增产物；W及
[0103] 混合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第二 通用引物对所述混合物进行第五PCR扩增，W便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增产 物构成所述待测核酸样本的目标区域检测文库。
[0104] 由此，利用本发明的引物组合物，能够高效地实现对目标区域核酸序列的富集，用 于目标区域突变检测后，检测灵敏度高，结果准确可靠。
[0105] 根据本发明的实施例，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变 的至少之一。
[0106] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因上。
[0107] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种确定待测核酸样本目标区域序列信息的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括:根据前面所述的构建待测核酸样本的目标区域检 测文库的方法，构建所述待测核酸样本的目标区域检测文库;对所述待测核酸样本的目标 区域检测文库进行测序，W便获得测序结果；W及基于所述测序结果，确定所述待测核酸样 本目标区域的序列信息。
[0108] 发明人发现，利用该方法能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂盒构 建目标区域的测序文库和测序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括 目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可 靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0109] 根据本发明的实施例，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变 的至少之一。
[0110] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因上。
[0111] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种构建待测核酸样本目标区域检测文库的 装置。根据本发明的实施例，该装置100设置有前面所述的引物组合物，参照图6,所述装置 100包括:预扩增单元10、特异性引物扩增单元20和通用引物扩增单元30。
[0112] 具体地，根据本发明的实施例，预扩增单元10用于对待测核酸样本进行预扩增，并 将预扩增产物均分为2份，分别作为第一预文库和第二预文库;特异性引物扩增单元20与预 扩增单元10相连，用于利用第一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一 PCR扩增，然后利用第二上游引物组和第二通用引物对第一 PCR扩增产物进行第二PCR扩增， W便获得第二PCR扩增产物；同时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库 进行第SPCR扩增，然后利用利用第二下游引物组和第二通用引物对第SPCR扩增产物进行 第四PCR扩增，W便获得第四PCR扩增产物;通用引物扩增单元30与特异性引物扩增单元20 相连，用于混合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第 二通用引物对所述混合物进行第五PCR扩增，W便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增 产物构成所述待测核酸样本的目标区域检测文库。
[0113] 由此，利用该装置100能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂盒进行 建库，进而能够有效地用于测序，W确定待测核酸样本目标区域序列信息，包括目标区域中 所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准确可靠，尤其适用 于超低频突变的检测。
[0114] 根据本发明的实施例，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变 的至少之一。
[0115] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因上。
[0116] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种确定待测核酸样本目标区域序列信息的 系统。根据本发明的实施例，参照图6,该系统1000包括:构建待测核酸样本目标区域检测文 库的装置100、测序装置200和序列确定装置300。
[0117] 具体地，根据本发明的实施例，构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置100用 于构建所述待测核酸样本的目标区域检测文库；测序装置200与构建待测核酸样本目标区 域检测文库的装置100相连，用于对所述待测核酸样本的目标区域检测文库进行测序，W便 获得测序结果;序列确定装置300与测序装置200相连，用于基于所述测序结果，确定所述待 测核酸样本目标区域的序列信息。
[0118] 发明人发现，利用该系统1000能够有效地基于前述的本发明的引物组合物或试剂 盒构建目标区域的测序文库和测序，从而能够有效确定待测核酸样本目标区域序列信息， 包括目标区域中所包含的点突变、插入、缺失或基因融合突变，并且检测灵敏度高，结果准 确可靠，尤其适用于超低频突变的检测。
[0119] 根据本发明的实施例，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变 的至少之一。
[0120] 根据本发明的实施例，所述目标区域位于KRAS基因上。
[0121] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译 的《分子克隆实验指南》，第=版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器 未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品，例如可W采购自Illumina公司。
[0122] 实施例1
[0123] 根据本发明的确定待测核酸样本目标区域序列信息的方法，利用本发明的引物组 合物或试剂盒对样本进行目标区域突变检测，具体步骤如下：
[0124] 1.接头设计
[01 巧]ADT-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNATTAAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT，
[01 %] ADT-R:pGATCGGAAGAGC，
[0127] W上序列需要退火成双链。
[012引2.引物设计
[0129] 2.1预文库PCR引物如下：
[0130] pre-1ib-primer-F：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：I),
[0131] pre-lib-primer-R:GCTCTTCCGATCT(沈Q ID N0:2)，
[0132] 2.2针对KRAS基因第2外显子的第12号和第13号密码子设计同向延伸特异性引物 如下：
[0133] 第一上游引物化RAS-U-SPl):TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGT(SEQ ID NO: 3)，
[0134] 第二上游引物化RAS-U-SP2): AGATGTGTATAAGAGACAGCTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGG AGCKSEQ ID no：4),
[0135] 第一下游引物化RAS-D-SP1):CCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCG(SEQ ID N0:5)，
[0136] 第二下游引物化RAS-D-SP2): AGATGTGTATAAGAGACAGGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT CTTG(SEQ ID N0：6),
[0137] 通用引物序列如下：
[013引 第一通用引物（UNPl) :AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID N0:7)，
[0139] 第二通用引物(UNP2):CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:8)，
[0140] 3.抽取5ml健康人外周血，分离2ml血浆，提取游离DM。
[0141] 4.游离DNA末端修复
[0142] 配制如下反应：
[0143] 表1
[0144]
[0145]
[0146] PCR仪上20°C溫浴30分钟。
[0147] 使用120ulAmpure XP beads进行纯化，3化化B洗脱。
[014引 5.3'端加多聚腺嚷岭尾
[0149] 配制如下反应：
[0150] 表2
[0151]
[0152」PCR仪上37 °C温浴30分钟。
[0153] 使用SOulAmpure XP beads进行纯化，IOu化B洗脱。
[0154] 6.连接特异性标签序列 [0K5] 配制如下反应：
[0156]表3 「nic；7l L0158J PCR仪上20"C溫浴15分钟。
[0159] 使用SOulAmpure XP beads进行纯化，20u化B洗脱。
[0160] 7.预文库扩增
[0163]
[0161] 配制如下反应：[0162] 表4
[0164]
[01化]PCR程序如下：
[0166] a)98°C45 秒；
[0167] b) 10循环程序如下：
[016 引 98°C15秒
[0169] 60°C30 秒
[0170] 72°C30 秒
[0171] c)72°Cl 分钟
[0172] d)4°C 保存。
[0173] 取加1 PCR产物进行2%琼脂糖胶电泳检测。检测结果如图1所示。
[0174] 剩余PCR产物使用5化1 Ampure XP beads进行纯化，2化1 Elution Buffer洗脱。
[0175] 8.特异性引物扩增
[0176] 该样品预文库等量分成为两份，分别为第一预文库和第二预文库，利用第一上游 引物组和第二通用引物对第一预文库进行第一 PCR扩增，然后利用第二上游引物组和第二 通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，W便获得第二PCR扩增产物；同时，利用第 一下游引物组和第二通用引物对第二预文库进行第SPCR扩增，然后利用第二下游引物组 和第二通用引物对第=PCR扩增产物进行第四PCR扩增，W便获得第四PCR扩增产物。
[0177] 其中，在冰上配置如下第一PCR扩增反应体系和第SPCR扩增反应体系：
[017引表5
L0180」第一PCR扩增和第SPCR扩增的PCR反应程序如下：
[0181] a)95°C10 分钟；
[0182] b) 10循环程序如下：
[0183] 95°C30 秒
[0184] 62°C30 秒
[0185] 72。(：1 分钟
[0186] c)72°C7 分钟
[0187] d)4°C 保存。
[018引60ul Ampure XP XP回收，24ul超纯水或者洗脱液洗脱，洗脱液进行下一步扩增。
[0189] 在冰上配置如下第二PCR扩增和第四PCR扩增的反应体系：
[0190] 表6
[0191]
[0192] 第二PCR扩增和第四PCR扩增的PCR反应程序如下：
[0193] a)95°C10 分钟；
[0194] b) 10循环程序如下：
[0195] 95°C30 秒
[0196] 62°C30 秒
[0197] 72°C1 分钟
[019 引 c)72°C7 分钟
[0199] d)4°C 保存。
[0200] 60ul Ampure XP XP回收，1化1超纯水或者洗脱液洗脱，洗脱液进行下一步扩增。
[0201] 9.通用引物扩增
[0202] 将上述得到的第二PCR扩增产物和第四PCR扩增产物混合，然后，在冰上配置如下 通用引物扩增的反应体系：
[0203] 表 7
[0204]
[0205] 通用引物扩增的PCR反应程序如下：
[0206] a)98°C45 秒；
[0207] b) 10循环程序如下：
[020引 98°C15秒
[0209] 60°C30 秒
[0210] 72°C30 秒 c)72°Cl 分钟
[0212] d)4°C 保存。
[0213] 取加 I进行2 %凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。
[0214]剩余PCR产物用54ul Ampure XP XP回收，30ul超纯水或者洗脱液洗脱，即为最终 文库。
[0215] 文库质控后，Illumina肥XTseq CN500进行75bp双端测序。
[0216] 11.测序数据信息分析
[0217] 将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，评估数据特异性，分析结 果见表8。 惦1引 表8
[0219]
[0220] 本实施例使用的样本为健康人的血浆(其待检测区域并不含有突变），上述结果表 明：利用本发明的方法及试剂盒能够有效检测到目标区域化RAS基因第2外显子12、13密码 子的突变）。
[0221] 实施例2
[0222] 根据实施例1的方法对样本进行目标区域突变检测，区别仅在于:本实施例采用的 样本来自HORIZON DISCOVERY公司的商业化标准品 MultiplexIcfDNAReferenceSl:andardSet(Catalogue#: HD780)，取该产品中在KRAS基因 12 号密码子位置突变频率分别为〇%(野生型）、0.1%和1%和5%样本进行检测，每个突变频 率的样本取IOng DNA进行。
[0223] 其中，预文库扩增的PCR产物的电泳检测结果如图3所示，通用引物扩增产物的电 泳检测结果如图4所示。
[0224] 将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，评估数据特异性，分析结 果见表9。
[02巧]表9
[0226]
[0227]进一步分析评估目标检测位点得到的序列数，分析结果见表10。
[022引 亲I O
[0229]
[0230] 上述结果表明，利用本发明的方法和试剂盒能够准确检测突变频率低至0.1%的 KRAS基因突变。
[0231 ]综上，结合实施例1与实施例2，结果表明，本发明能够成功地对核酸样本的目标区 域化RAS基因待检区域)进行特异性检测，且灵敏度高，结果准确可靠。
[0232] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可W在任何 的一个或多个实施例或示例中W合适的方式结合。
[0233] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可W理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种用于检测待测核酸样本目标区域的引物组合物，所述待检测核酸样本为双链 DNA，包括第一链和与第一链互补的第二链，其特征在于，包括： 通用引物组，所述通用引物组包括第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物 用于构成测序文库的5'端，所述第二通用引物的靶点位于待检测核酸样本的两条链上目标 区域的5 '端，用于构成测序文库的3 '端； 上游引物组，所述上游引物组包括第一上游引物组和第二上游引物组；以及 下游引物组，所述下游引物组包括第一下游引物组和第二下游引物组； 其中， 所述第一上游引物组、第二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组均包含η条 目标区域特异性引物，且必须满足下列条件： (1) 所述第一上游引物组和所述第二上游引物组的各上游引物均同向延伸，靶点均位 于待检测核酸样本的第一链上目标区域的3'端;所述第一下游引物组和所述第二下游引物 组的各下游引物均同向延伸，靶点均位于待检测核酸样本的第二链上目标区域的3'端； (2) η=1-5的任意整数，以η = 5为例，设所述第一上游引物组的各特异性引物分别为： ^^^，所述第二上游引物组的各特异性引物分别为也^^^所述第一下 游引物组的各特异性引物分别为^^，所述第二下游引物组的各特异性引物分 别为:？ 1、？2、？3、?4、内，以特异性引物的靶点与目标区域之间的距离为衡量标准，各特异性引 物之间的距离远近关系为： Νι>Ν2>Ν3>Ν4>Ν5 ； Μι>Μ2>Μ3>Μ4>Μ5 ； Νι>Μι ； Ν2>Μ2 ； Ν3>Μ3 ； Ν4>Μ4;且 Ν5>Μ5， Βι>Β2>Β3>Β4>Βδ ； Ρ?>Ρ2>Ρ3>Ρ4>Ρ5； Βι>Ρι； Β2>Ρ2； β3>ρ3； Β4>Ρ4;且 Β5>Ρ5〇2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，针对所述第一上游引物组、第二上游引 物组、第一下游引物组和第二下游引物组中每一个，其包含的各特异性引物基于基因组位 置上的顺序依次间隔0-50对碱基对， 任选地，见与％对应的基因组位置有重叠，Ν2与Μ2对应的基因组位置有重叠，Ν3与Μ3对应 的基因组位置有重叠，Ν4与Μ4对应的基因组位置有重叠，地与施对应的基因组位置有重叠 ，Bi 与Pi对应的基因组位置有重叠，B2与P2对应的基因组位置有重叠，B3与P3对应的基因组位置 有重叠，B4与P4对应的基因组位置有重叠，8 5与？5对应的基因组位置有重叠，优选重叠10-15 个碱基， 任选地，各特异性引物的GC含量均为30 %-70 %，Tm值为55-68 °C， 任选地，所述第一上游引物组和所述第一下游引物组的各特异性引物的5'端均有生物 素修饰。 所述第二上游引物组和所述第二下游引物组的各特异性引物的5'端均含有第一通用 引物的靶点。3. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于， 第一通用引物:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO:7); 第二通用引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:8)， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因2号外显子上，n = l，所述所述第一上游引物组、第 二上游引物组、第一下游引物组和第二下游引物组的各特异性引物分别为： 第一上游引物：TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGT (SEQ ID NO: 3)， 第二上游引物：AGATGTGTATAAGAGACAGCTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO: 4)， 第一下游引物：CCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCG(SEQ ID N0:5)， 第二下游引物：AGATGTGTATAAGAGACAGGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTG(SEQ ID NO: 6)， 任选地，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少之一， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因上。4. 一种试剂盒，其特征在于，包含： 权利要求1-3任一项所述的引物组合物。5. -种构建待测核酸样本的目标区域检测文库的方法，其特征在于， 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物或权利要求4所述的试剂盒，通过PCR扩增 富集所述待测核酸样本目标区域的序列。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括： 对待测核酸样本进行预扩增，并将预扩增产物均分为2份，分别作为第一预文库和第二 预文库； 利用第一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一 PCR扩增，然后利用 第二上游引物组和第二通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR 扩增产物；同时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库进行第三PCR扩 增，然后利用第二下游引物组和第二通用引物对第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增，以便 获得第四PCR扩增产物；以及 混合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第二通用 引物对所述混合物进行第五PCR扩增，以便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增产物构 成所述待测核酸样本的目标区域检测文库， 任选地，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少之一， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因上。7. -种确定待测核酸样本目标区域序列信息的方法，其特征在于，包括： 根据权利要求5或6所述的方法，构建所述待测核酸样本的目标区域检测文库； 对所述待测核酸样本的目标区域检测文库进行测序，以便获得测序结果；以及 基于所述测序结果，确定所述待测核酸样本目标区域的序列信息， 任选地，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少之一， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因上。8. -种构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置，其特征在于，设置有权利要求1-3 任一项所述的引物组合物，所述装置包括： 预扩增单元，所述预扩增单元用于对待测核酸样本进行预扩增，并将预扩增产物均分 为2份，分别作为第一预文库和第二预文库； 特异性引物扩增单元，所述特异性引物扩增单元与所述预扩增单元相连，用于利用第 一上游引物组和第二通用引物对所述第一预文库进行第一 PCR扩增，然后利用第二上游引 物组和第二通用引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物；同 时，利用第一下游引物组和第二通用引物对所述第二预文库进行第三PCR扩增，然后利用利 用第二下游引物组和第二通用引物对第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增，以便获得第四 PCR扩增产物；以及 通用引物扩增单元，所述通用引物扩增单元与所述特异性引物扩增单元相连，用于混 合所述第二PCR扩增产物和所述第四PCR扩增产物，并利用第一通用引物和第二通用引物对 所述混合物进行第五PCR扩增，以便获得第五PCR扩增产物，所述第五PCR扩增产物构成所述 待测核酸样本的目标区域检测文库。9. 根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺 失、基因融合突变的至少之一， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因上。10. -种确定待测核酸样本目标区域序列信息的系统，其特征在于，包括： 权利要求8或9所述的构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置，用于构建所述待测 核酸样本的目标区域检测文库； 测序装置，所述测序装置与所述构建待测核酸样本目标区域检测文库的装置相连，用 于对所述待测核酸样本的目标区域检测文库进行测序，以便获得测序结果；以及 序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定 所述待测核酸样本目标区域的序列信息， 任选地，所述目标区域包含选自点突变、插入、缺失、基因融合突变的至少之一， 任选地，所述目标区域位于KRAS基因上。
【文档编号】C12N15/11GK105861724SQ201610389568
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】王晓锋, 宋卓, 袁梦兮
【申请人】人和未来生物科技（长沙）有限公司