基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法
【专利摘要】基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，包括：步骤1，选用6?7周龄大鼠，收集处死后大鼠的肾脏，剪除结缔组织，取肾皮质剪碎成50?100mg组织小块，采用液氮速冻并保存于?80℃冰箱中；步骤2，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；步骤3，用核酸定量仪测量基因组DNA的浓度和纯度，通过0.5％?1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，并将检测合格的DNA样本置于?20℃至?80℃的冰箱备用；步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪确定修饰好的基因组DNA浓度；步骤5，在多种不同的实验条件下进行PCR扩增；步骤6，从步骤5中选定后续步骤所用的样本。本发明提高了钙黏蛋白甲基化实验的成功率。
【专利说明】
基于亚硫酸氨盐测序法的巧黏蛋白甲基化检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物领域，特别设及一种基于亚硫酸氨盐测序法的巧黏蛋白甲基化检 测方法。
【背景技术】
[0002] 目前，亚硫酸氨盐测序法是国内外学者公认的脱氧核糖核酸(DNA)甲基化位点检 测金标准，可准确而灵敏地检测出特定DNA序列不同胞喀晚鸟嚷岭二核巧酸(CpG)位点的甲 基化状态，但是在实验过程中频繁出现的聚合酶链式反应(PCR)扩增效率低下是该试验停 滞不前的重要原因之一。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种基于亚硫酸氨盐测序法的巧黏蛋白甲基化检测方法，W解决现 有技术中失败率高的问题。
[0004] 为解决上述问题，作为本发明的一个方面，提供了一种基于亚硫酸氨盐测序法的 巧黏蛋白甲基化检测方法，包括W下步骤：
[0005] 步骤1，选用SPF级6-7周龄大鼠，将其处死后，收集处死后的大鼠肾脏，剪除结缔组 织，取肾皮质剪碎成50-lOOmg小块组织后液氮速冻并保存于-80°C冰箱中；优选地，所述步 骤1中的处死方法为股动脉放血法。优选地，SPF级动物房的溫度控制在22-25°C，湿度控制 在30%-40%，光线控制在12/12-h循环。
[0006] 步骤2，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
[0007] 步骤3，用核酸定量仪测量基因组DNA的浓度和纯度，通过0.5%-1.0%的琼脂糖凝 胶电泳检测基因组DNA完整性，并将检测合格的DNA样本置于-20°C至-80°C的冰箱备用；
[000引步骤4,采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪测量修饰好的基因 组DNA浓度，再将其置于-20°C冰箱备用；
[0009] 步骤5,在多种不同的实验条件下进行PCR扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，凝胶成像系统观察、拍照，并将回收完毕的目的PCR产物置于4°C备用;所述不同的实 验条件是指保持引物序列及其它组分终浓度均不变、但改变转化后基因组DNA和Mg 2+的终浓 度;优选地，PCR采用SOiiL反应体系，扩增产物长度为36化P。
[0010] 步骤6,根据5的拍照结果中选定后续步骤所用的样本为化L的25mmol/L MgCb和 50ng基因组DNA。
[0011] 步骤7，纯化回收步骤5中的样本后与载体连接、转化入化ans 1 -Tl感受态细菌中， 行蓝白克隆筛选，并通过通用引物做PCR扩增，产物经2 %琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系 统观察、拍照，W确认阳性克隆；
[0012] 步骤8，选取步骤7中阳性克隆斑中的菌体，在37 °C恒溫震荡培养8-12h后，取变浑 浊的样本进行测序。
[0013] 优选地，所述步骤5中进行PCR扩增时的引物序列为：
[0014] F:5 '-GGAATAAGGAAGTAAGGAAGTT-3，
[0015] R:5，-CCACATACCTACAACAAAAACA-3 '
[0016] 优选地，所述步骤5中进行PCR扩增时的反应条件为：
[0017]步骤 A，94°c 预加热 IOmin;
[001 引步骤 B，94°C 变性 30s，56°C 退火 30s，72°C 延伸 60s;
[0019] 步骤C，重复上述步骤B中的循环30次；
[0020] 步骤D，7 2 °C保持60s后，4 °C保存。
[0021] 本发明改进后的亚硫酸氨盐测序法，不仅能有效减少PCR反应中的非特异性扩增， 而且降低假阳性结果出现的可能性，更适于检测特定基因位点DNA甲基化状态，尤其提高了 传统的亚硫酸氨盐测序法对CpG岛胞喀晚鸟嚷岭富集区甲基化状态检测的特异性和敏感 性，并提高了实验的成功率。
【附图说明】
[0022] 图1示意性地示出了甲基化PCR扩增产物电泳图；
[0023] 图2示意性地示出了重组子PCR扩增产物电泳图；
[0024] 图3示意性地示出了大鼠 E-ca化erin启动子区域部分序列测序图。
【具体实施方式】
[0025] W下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可W由权利要求限定和覆盖的 多种不同方式实施。
[0026] 由于DNA甲基化与肿瘤发生发展密切相关，针对特定基因异常DNA甲基化位点的检 测是目前肿瘤生物标志物研究的热点领域之一。待检的基因组DNA经亚硫酸氨盐转化后，未 甲基化的胞喀晚转变为尿喀晚，而5-甲基化胞喀晚则保持不变。即绝大多数甲基化检测方 法就是将修饰前后化学分子的细微变化转化为碱基改变并通过PCR扩增直观地显示出来。 但过量的基因组DNA容易引起亚硫酸氨盐修饰不完全，从而导致部分未甲基化的胞喀晚无 法有效地转变为尿喀晚而出现假阳性结果。
[0027] 采用亚硫酸氨盐修饰后，DNA链因碱基发生改变而不再互补，相当于W单链为模板 扩增，同时DNA大量减少，不稳定性增加;且引物与模板易发生错配，而造成大量非特异性扩 增，在此条件下MgCl2浓度过高使PCR反应特异性降低，导致非特异性扩增的出现。
[00%]本发明采用PCR引物，通过摸索基因组DNA浓度和Mg2+浓度来探讨如何在抑制非特 异性扩增的同时提高扩增效率，成功鉴定了雄性F344大鼠 （Fischer rats)肾脏巧粘蛋白 化-Ca化erin)基因启动子区CpG岛26个CpG位点的甲基化状态，具体实验过程如下：
[0029] 1.材料与方法
[0030] 1.1材料与试剂
[0031] 选用无特异病原体(SPF)级6-7周龄的雄性F344大鼠，购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。大鼠饲养于华中科技大学同济医学院动物实验中屯、的SPF级动物房。实验动 物室溫度控制在22-25°C，湿度控制在30%-40%，光线控制在12/12-h循环。常规饲料和饮 用水由华中科技大学同济医学院动物实验中屯、提供。
[0032] W股动脉放血法处死大鼠，收集肾脏，剪除结缔组织，取肾皮质剪碎成50-lOOmg小 块组织，液氮速冻，保存于-80°C冰箱，W防止基因组DM的降解导致实验失败。
[0033] 组织基因组DNA提取试剂盒和TA克隆试剂盒分别购自中国北京市天根生物有限公 司和中国北京市全式金生物科技有限公司；
[0034] 正常烙点琼脂糖购自西班牙Biowest公司；
[003引热启动Taq酶、DNA甲基化转化试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒分别由美国 化rmen化S公司、美国天漠公司和美国Omega公司提供；
[0036] 甲基化PCR引物由上海大连宝生物工程公司提供；
[0037] 其余试剂为国产分析级的试剂。
[003引 1.2基因组DNA的制备：
[0039] 采用组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用核酸定量仪测量基因组DNA的 浓度和纯度，通过0.5 %-1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性。对检测合格的DNA 样本置于-20°C冰箱备用，W方便操作。
[0040] 1.3基因组DNA亚硫酸氨盐转化
[0041] 采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪测量修饰好的基因组DNA浓 度，再将其置于-20°C冰箱备用。
[00创 1.4 PCR扩增
[0043] E-ca化erin基因的PCR引物序列为：
[0044] F:5 '-GGAATAAGGAAGTAAGGAAGTT-3，
[0045] R:5 '-CCACATACCTACAACAAAAACA-3 '
[0046] 扩增产物长度为36化P。
[0047] PCR采用50化反应体系，改变转化后基因组DNA和Mg2+的终浓度，引物序列及其它组 分终浓度均不变，详见表1。
[004引 PCR反应条件:94 °C预加热IOmin; 94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸60s;重复 上述循环30次。然后，72°C保持60s后，4°C保存。
[0049] 产物均采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察、拍照。也可根据琼脂糖 凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤回收目的PCR产物。将回收完毕的目的PCR产物置于4°C 待用。
[0050] 表1甲基化PCR反应体系 「00511
[0052] 1.5目的基因的克隆及筛选
[0053] 纯化回收PCR产物后与载体连接、转化入化ansl-Tl感受态细菌中，行蓝白克隆筛 选；W通用引物M13F和M13R做PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观 察、拍照，W确认阳性克隆。
[0化4] 1.6测序
[0055] 选取阳性克隆斑中的菌体，37°C恒溫震荡培养8-12h后，取变浑浊的样本送武汉华 大基因测序部进行测序。
[0056] 2.结果
[0057] 2.1比较上述1.4步骤扩增后的不同浓度MgCb和模板扩展效果
[0化引如图1所示，反应体系中加入扣L、10化的25mmol/L MgCb和25ng、50ng、IOOng基因 组DNA后，在约36加 P处均可见明亮的目的条带，其大小与预期结果一致，未见引物二聚体； 但是10化25mmol/L MgCb可观察到非特异性扩增。鉴于此，确定实验条件为扣L的25mmol/ L MgCb和50ng基因组DNA。
[0059] 其中，
[0060] M: DNA 标记物；
[0061 ] 1:10化 25mmol/L MgCb+lOOng基因组DNA;
[0062] 2:化1 25mmol/L MgCb+lOOng基因组DNA;
[0063] 3:10化25臟〇1/1]\%(：12+5〇11邑基因组0魁；
[0064] 4:化1 25mmol/L MgCl2+50ng基因组DNA;
[00化]5:化1 25mmol/L MgCh+化ng基因组DNA;
[0066] 6:空白对照。
[0067] 2.2上述1.5中PCR筛选阳性克隆分析
[0068] 阳性重组子的PCR产物长度应为插入目的DNA和部分T载体序列之和(第2列），长度 应为564bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在500bp和600bp之间出现明亮而清晰的目的条带， 见图2。
[0069] 其中；
[0070] M: DNA 标记物；
[007。 I:载体；
[0072] 2:E-ca 化 erin+载体 PCR 产物；
[0073] 3:空白对照。
[0074] 2.3利用第2.2步筛选出的克隆的测序结果
[0075] 测序结果与数据库大鼠 E-ca化erin基因 CpG岛DNA序列比对，目的片段无突变，26 个CpG位点的胞喀晚均被亚硫酸氨盐修饰，最后显示为胸腺喀晚，表明正常雄性F344大鼠肾 脏E-ca化er i n基因启动子CpG岛所有CpG位点低甲基化，见图3。
[0076] 图3测序后显示抓CM(-种毒物，一漠二氯甲烧）染毒12周的大鼠 E-ca化erin启动 子区域高甲基化，对照组（即正常组)大鼠低甲基化。
[0077] (A)显示大鼠 E-ca化erin启动子区域CpG位点分布，
[007引 （B)可见处理12周后对照组与抓CM染毒组E-ca化erin CpG位点测序图（部分测序 图）有差异，在对照组图中从左往右数第27个碱基为胸腺喀晚T，在抓CM染毒组中为胞喀晚 C。
[0079] 通过上述验证例可知，为解决传统的亚硫酸氨盐测序法未明确基因组DNA含量及 完整性，可导致后续DNA修饰不彻底和甲基化PO?非特异性扩增而造成实验失败的问题，本 发明研究改良了传统方法，调整基因组DNA的含量确保每次进行转化的基因组DNA为50ng， 并W琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA完整性;在保证模板质量和数量的基础上，在PCR实验 体系中适当调整MgCl2的浓度，既增加了扩增的敏感性又有效地降低非特异性扩增。
[0080] 发明人采用本发明中的方法反复进行了多次试验，均可获得理想的扩增产物。测 序结果表明，亚硫酸氨盐转化完全，大鼠肾脏E-ca化erin基因启动子区CpG岛的26个CpG位 点均为非甲基化，运与国外的报道一致。
[0081 ]可见，本发明改进后的亚硫酸氨盐测序法，不仅能有效减少PCR反应中的非特异性 扩增，而且降低假阳性结果出现的可能性，更适于检测特定基因位点DNA甲基化状态，尤其 提高了传统的亚硫酸氨盐测序法对CpG岛胞喀晚鸟嚷岭富集区甲基化状态检测的特异性和 敏感性。
[0082] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征在于，包括： 步骤1，选用SPF级6-7周龄大鼠，将其处死后收获肾脏，迅速收集处死后大鼠的肾脏，剪 除结缔组织，取肾皮质剪碎成50-100mg组织小块，采用液氮速冻并保存于-80°C冰箱中； 步骤2，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA; 步骤3，用核酸定量仪检测基因组DNA的浓度和纯度，通过0.5 % -1.0 %的琼脂糖凝胶电 泳检测基因组DNA的完整性，并将检测合格的基因组DNA样本置于-20°C至_80°C的冰箱中备 用； 步骤4,采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪检测修饰好的基因组DNA 浓度和纯度，再将其置于-20 °C冰箱备用； 步骤5,在多种不同的实验条件下进行PCR扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物， 凝胶成像系统观察、拍照，并将回收完毕的目的PCR产物置于4°C备用;上述不同的实验条件 是指保持引物序列及其它组分终浓度均不变、但改变转化后基因组DNA和Mg 2+的终浓度； 步骤6，根据5的拍照结果选定后续步骤所用的样本； 步骤7,采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收步骤6中的样本，通过载体连接将其转化入 Trans 1-T1感受态细菌中，行蓝白克隆筛选，并通过通用引物做PCR扩增，产物经2%琼脂糖 凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察、拍照，以确认阳性克隆； 步骤8，选取步骤7中阳性克隆斑中的菌体，在37 °C恒温震荡培养8-12h后，取变浑浊的 样本进行测序。2. 根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征 在于，所述步骤5中进行PCR扩增时的引物序列为： F:5，-GGAATAAGGAAGTAAGGAAGTT-3，， R:5 '-CCACATACCTACAACAAAAACA-3 '。3. 根据权利要求1至2所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特 征在于，所述步骤4中进行PCR扩增时的反应条件为： 步骤A，94°C预加热lOmin; 步骤 B，94 °C 变性 30 s，56 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 60s; 步骤C，重复上述步骤B中的循环30次； 步骤D，72 °C保持60 s后，4 °C保存。4. 根据权利要求1至3所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特 征在于，所述步骤5所确定的实验条件为:5yL的25mmol/L MgCl2和50ng基因组DNA。5. 根据权利要求1至4所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特 征在于，所述步骤1中的处死方法为股动脉放血法。6. 根据权利要求1至5所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特 征在于，所述步骤1中收集处死后的大鼠肾脏，剪除结缔组织，取肾皮质剪碎成50-100mg组 织小块后液氮速冻并保存于-80°C冰箱中。7. 根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征 在于，所述步骤1中的饲养条件为:动物室温度控制在22-25°C，湿度控制在30%-40%，光线 控制在12/12-h循环。8. 根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征 在于，所述步骤5的PCR采用50yL反应体系。9.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征 在于，所述步骤5的扩增产物长度为365bp。
【文档编号】C12Q1/68GK105861718SQ201610364992
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】廖静, 李小峰
【申请人】廖静