一种携带scc抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种携带鳞状上皮细胞癌(SCC)抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为SCC抗原基因得到。本发明的rAAV的病毒载体可将其携带的SCC抗原基因输送入单核细胞?树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制SCC抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗抗SCC抗原阳性的鳞状上皮细胞癌的药物。
【专利说明】一种携带see抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法 与应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种鳞状上皮细胞癌（see， 又称存活素)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗see阳性的肿 瘤药物中的应用。 【【背景技术】】
[0002] 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年， Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ， Srivastava A,Berns KI，Muzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)。1984年，Hennonat等人描述了 AAV的低感染颗粒（lip)基因和包膜 (cap)基因 （Hermonat PL,Labow MA,ffright R，Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of adeno- associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells .Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A.81:6466-6470.) D1986年，Labow 等人鉴定了位于上游 5'端片段和rep基因之间的p5启动子（Labow MA，Hermonat PL，Berns Kl.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.l60:25卜258·)。
[0003] 1984年，美国Paul L.Hennonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主 要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管 理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因 的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对 治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海 默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27 个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型 (AAV-Ι)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。
[0004] AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才 能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1~AAV-12)。其中，2 型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为 当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重 复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不 稳定性及其携带外源性基因（治疗基因）长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重 组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)〇
[0005] 如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域 技术人员努力的方向。 【
【发明内容】
】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是:弥补上述现有技术的不足，提出一种稳定性高、携 带鳞状上皮细胞癌（SCC)抗原基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与应用。
[0007] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0008] -种携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体，将腺相关病毒载体中的腺相关病 毒的结构基因替换为SCCA1抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
[0009] 已知的腺相关病毒载体具有P5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步 将SCC抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动 子、SV40早期启动子中的一种的AAV载体中。
[0010] 本发明还提供携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法:在腺相关病 毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入SCCA1抗原基因，得到重组 腺相关病毒载体。
[0011] 本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载 体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因 SCCA1与被切断的AAV载体DNA进行连 接，得到携带SCCA1抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为ρ5启动子或者 下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动 子。
[0012] -种与携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括SCC重组腺相关 病毒的质粒载体、SCC重组腺相关病毒的病毒载体、被所述SCC重组腺相关病毒的病毒载体 感染或转染的细胞系，所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带SCC抗原基因的重组 腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体制得； 所述SCC重组腺相关病毒的病毒载体由所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养 得到。
[0013] -种与携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，SCC重组 腺相关病毒的质粒载体的制备:将如上述携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上 述构建方法制得的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌感受态 细胞，用含氨苄青霉素的培养基进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到SCC 重组腺相关病毒的质粒载体;SCC重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述SCC重组腺相 关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到SCC重组腺相关病毒的病毒载体； SCC重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备:用所述SCC重组腺相关病毒的病毒载体感 染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞 系、T淋巴细胞系。
[0014] -种如上所述的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的相关产 品在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0015] 具体地，肿瘤为SCC阳性的恶性肿瘤。所述SCC阳性的恶性肿瘤包括但不限于宫颈 癌、肺癌、喉癌、舌癌、食道癌等。药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多 样的，如细胞培养液(基）、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还 可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促 进剂和表面活性剂等。
[0016] 用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/SCC的病毒载体感染 或转染患者的单核细胞。或将转化有SCC的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴 细胞回输肿瘤患者。
[0017] 上述药物的用量一般为1〇〇μ1/5Χ106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个 月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
[0018] 为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行 组合治疗。
[0019] 本发明与现有技术对比的有益效果是：
[0020] 本发明提供了一种稳定性高、携带外源性基因（SCC)的重组腺相关病毒(rAAV)载 体。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/SCC)载体可将其携带的SCCA1抗原基因输送入单核细 胞-树突状细胞系中，存在SCC抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T 淋巴细胞和B淋巴细胞）。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒 性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细 胞，因而，本发明的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载 体相关的产品可被用于制备抗SCC抗原阳性的恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿 瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。 【【附图说明】】
[0021] 图1是本发明【具体实施方式】的携带生存素（SCC)抗原基因的重组腺相关病毒载体 的结构示意图；
[0022] 图2是本发明【具体实施方式】的构建携带生存素 (SCC)抗原基因的重组腺相关病毒 载体以及制备具有感染性的重组腺相关病毒AAV/SCC的流程图；
[0023]图3a是本发明【具体实施方式】中PCR扩增获得SCCAlcDNA的结果图；
[0024]图3b是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)载体的双酶切鉴定结果 图；
[0025]图4是本发明【具体实施方式】的所获得的SCC基因序列与美国NCI Gene Bank公布的 基因序列的对比图；
[0026] 图5是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体的病毒滴度 检测结果图；
[0027] 图6是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染肿瘤患 者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验流程图；
[0028] 图7是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染外周血 单个核细胞的效率检测结果图；
[0029]图8a是本发明【具体实施方式】的对照组(无抗原刺激的DC)表达⑶80、⑶83以及⑶86 水平的检测结果图；
[0030] 图8b是本发明【具体实施方式】的携带SV40p启动子的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的 病毒载体感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果图；
[0031] 图9是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC所 诱导的CTL的IFN- γ水平的检结果图；
[0032] 图10是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC所 诱导的CTL体外杀伤SCC抗原阳性和阴性细胞的 51Cr(铬-51)实验结果图；
[0033] 图11是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC所 诱导的CTL杀伤作用的MHC Class I限制性以及杀伤SCCA2抗原阳性肿瘤细胞的验证结果 图；
[0034] 图12a是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC 所诱导的CTL治疗过程中宫颈癌患者的血清SCC水平的变化情况示意图；
[0035] 图12b是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC 所诱导的CTL治疗过程中肺鳞癌患者的血清SCC水平的变化情况示意图；
[0036] 图12c是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC 所诱导的CTL治疗过程中喉癌患者的血清SCC水平的变化情况示意图；
[0037] 图12d是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC 所诱导的CTL治疗过程中舌癌患者的血清SCC水平的变化情况示意图；
[0038] 图12e是本发明【具体实施方式】的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的病毒载体感染的DC 所诱导的CTL治疗过程中食道癌患者的血清SCC水平的变化情况示意图。 【【具体实施方式】】
[0039] 下面结合【具体实施方式】并对照附图对本发明做进一步详细说明。
[0040] 发明人已经成功地将携带AAV 2型全基因组DNA的PBR322质粒（PBR-AAV2)中的 AAV-2的包括rep和cap基因在内的全部结构基因删除，经保留末端重复片段和/或p5启动 子，并插入寡核苷酸片断，以提高重组腺相关病毒(rAAV)DNA复制的效率和重组腺相关病毒 的稳定性，由此获得AAV-2载体的基本骨架。此外，也成功地用巨细胞病毒(CMV)启动子、猴 空泡病毒40(SV40)早期启动子、beta肌动蛋白启动子取代AAV-2载体中的p5启动子。而且在 此基础上成功地制备具有感染性的rAAV病毒颗粒(参见中国专利ZL201110125683.X)，为研 制新的rAAV产品奠定了基础。
[0041 ] 鳞状细胞癌抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen;SCC)，又称鳞状上皮细胞 癌抗原，是肿瘤相关抗原TA-4的亚型，是一种分子量48KD的酸性糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶 抑制剂家族成员。最初从宫颈癌组织中分离获得，广泛存在于子宫、子宫颈、肺、头颈等鳞状 上皮细胞癌的细胞浆中，特别在非角化癌的细胞中，含量更丰富。由于SCC是一种高特异性 的鳞状细胞癌的标志物。因而它可以作为肿瘤特异性诊断和免疫治疗的理想靶点。
[0042] SCC包括两个基因 SCCA1和SCCA2,在血清中至少有四种形式的SCC:游离SCCA1、游 离SCCA2、以及与相对应的丝氨酸蛋白酶结合物。SCCA1编码中性蛋白，而SCCA2编码酸性蛋 白。这两段基因在核苷酸水平上有98%的同源性，在氨基酸水平上有92%的同源性。SCCA1 有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和通过诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞侵袭转移的作用。 SCCA2可通过影响p38MAPK通路抑制肿瘤细胞凋亡。由于二者的氨基酸序列具有高度的一致 性，导致人体的免疫系统对二者的交叉免疫反应程度极高。因此，医学上所称的SCC，可指 SCCA1，也可指SCCA2，通常情况下，临床检测患者的血清SCC抗原位阳性，是指二者皆为阳 性。SCC被认为是抗肿瘤的细胞免疫反应的一个非常理想的靶子。
[0043]本发明的AAV/SCC即是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入 SCC抗原基因得到重组腺相关病毒载体，与载体相关的产品包括质粒、病毒和细胞系。
[0044] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，Russel1，David ff., Molecular Cloning : A Laboratory Manual? 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0045] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/ V)百分比浓度。
[0046] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Life Technologies公司完成。
[0047]实施例1、SCC重组腺相关病毒载体的构建及鉴定 [0048] 一、材料及其来源：
[0049] 1.四种具有不同启动子的AAV 2型(AAV-2)pBR322质粒(pBR-AAV2):该质粒由发明 人构建成功（见中国专利21^201110125683.乂，0056~0059段口81?-44￥2质粒的改建、？0財广增 启动子、将扩增的启动子插入改建的PBR-AAV2质粒中等内容）。四种启动子分别为AAV p5启 动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(CMV)启动子(CMVp)、SV40早期启动子(SV40p)和人β-肌动蛋 白（β-actin)启动子(β-actinp)。该质粒的特点为两端完整的重复末端片断(TR)序列，并在 两端TR的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG，目的是提高重组 AAV病毒(r AAV)的稳定性以及提尚病毒的复制效率，并且剔除AAV-2的包括复制蛋白基因 (rep)和包膜蛋白基因（cap)在内的全部结构基因。
[0050] 2.人食道癌组织:来源于手术切除的癌组织，免疫组化证实SCC抗原阳性。
[0051] 3.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的人鳞状细胞癌抗原 (SCCA1)基因序列设计(美国NCI基因库:U19556.1)。
[0052] 二、构建本实施例携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体
[0053] 构建时:包括以下步骤：1)改建AAV 2型pBR322质粒:使用限制性内切酶Bst98I和 Hpa I将AAV 2型pBR322质粒中的AAV 2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制 性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留 两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段 CTGCGCTGG2)将启动子插入步骤1)得到的改建的AAV 2型pBR322质粒中，构建携带有启动 子的AAV 2型pBR322质粒;所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞 病毒启动子、肌动蛋白启动子或SV40早期启动子。3)获取SCCAlcDNAj)将步骤2)构建的 质粒和步骤3)得到的SCCA1 cDNA分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切，然后进行 DNA连接反应，得到携带有启动子和SCCA1抗原基因的重组腺相关病毒载体(可命名为AAV/ SCC)〇
[0054] 如图1和2所示，具体过程包括以下步骤：
[0055] 1.获取总c DNA，具体方法为:采用Trizol试剂（美国Life Technology公司生产） 获取肿瘤组织的总mRNA。首先将SCC抗原阳性的食道癌组织反复碾磨后，加入5ml Trizol， 按照其说明书进行操作。离心获取上清液后，以75%(V/V)乙醇洗涤二次，再加入无水乙醇， 离心沉淀。沉淀物以去离子水溶解，得到总mRNA溶液，将浓度调至1 Ong/μL。以1 ΟμL总mRNA溶 液为模板，进行逆转录反应(RT)，合成总cDNA。逆转录反应体系，以总反应体系为25μ1为例， 包括：0 · 5yg oligo(dT) 15(美国Promega公司）、0 · 5mM dNTPs(美国Promega公司）以及200U M-MLV逆转录酶(美国Promega公司）。反应条件为37°C，1小时，得到总cDNA。
[0056] 2.获取SCC cDNA，具体方法为：以所述总cDNA为模板，SCCA1为靶基因，在引物1 (如 SEQIDN0:1):CCAGATCACATCGAGTTCA和引物2(如SEQIDN0:2):CATCTGCAGGTGAACATT的弓丨 导下PCR扩增，得到SCCA1 cDNA。PCR扩增条件为:先94 °C 4分钟;再94 °C 30秒，60 °C 35秒，72 °C 70秒，共30个循环;最后72°C8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2% (W/V)琼脂糖凝胶电 泳检测，在1250bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度为 1250bp SCCAlcDNA。图3A所示，为从所获得的cDNA经PCR扩增获得SCCAlcDNA的PCR检测结 果。
[0057] 3.构建携带SCC cDNA的重组腺相关病毒载体:分别对携带4种不同启动子的pBR- AAV2质粒和SCCA1 cDNA分别用限制性内切酶进行酶切后，进行DNA连接反应。所用限制性内 切酶均购自美国Promega公司。酶切反应体系为：lyg pBR-AAV2质粒或SCCAlcDNA; 10U限制 性内切酶BamH I和Xho I(购自美国Promega公司），2.5μ1 10X缓冲液C以及19.5μ1去离子 水;反应条件为：在37°C下水浴4小时。连接反应体系为:500ng酶切后的质粒，300ng酶切后 的SCCAlcDNA，10IU T4DNA连接酶（购自美国Promega公司），1.5μ1 10 XT4DNA连接缓冲液以 及11.5μ1去离子水；反应条件为：在4°C下8小时。分别得到携带有AAV的ρ5启动子和 SCCAlcDNA的重组腺相关病毒载体、携带有CMV启动子和SCCAlcDNA的重组腺相关病毒载体、 携带有SV40早期启动子和SCCAlcDNA的重组腺相关病毒载体、携带有beta肌动蛋白启动子 和SCCAlcDNA的重组腺相关病毒载体。
[0058] 4.将连接后的重组腺相关病毒载体分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5a感 受态细胞(美国Invitrogen公司），用含100yg/mL氨节青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取 白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的重组腺相关病毒(AAV/SCC)的质粒载体。
[0059] 三、重组腺相关病毒的质粒载体的鉴定
[0060] 1.限制性内切酶酶切分析:将AAV/SCC的质粒载体以限制性内切酶BamH I和Xho I 进行酶切反应，反应体系、条件以及操作过程同上述构建过程二中的步骤3。分析后的结果 见图3B。图3B中，1为DNA分子量标准;2~9表示8个克隆。其中，泳道2及泳道4-9为7个阳性克 隆，说明8个克隆中7个克隆正确，证明构建AAV/SCC的质粒载体构建成功。
[0061 ] 2. DNA序列测定:将AAV/SCC进行DNA序列测定。其测序结果的核苷酸序列如图4所 示，与美国基因库中公布的SCCA1的基因序列对比，99%同源，证明所获得的AAV/SCC正确， 进一步证明构建AAV/SCC的质粒载体成功。
[0062]实施例2、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备及滴度测定（如图2和图5所 示）
[0063]材料及其来源：
[0064] A.实施例1-1构建的携带有SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体。
[0065] B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper:由美国阿肯色大学医学院 附属医院基因治疗中心刘勇教授构建(Liu，Y.，Chiriva_Internati，M.，Grizzi，F. Salati， E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0066] C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因化142八44、￥八1和￥八11基因）的 AAVp细胞株：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心建立（1^11，￥.，(：11化"&-Internati，M.，Grizzi，F.Salati，E.，Roman，J·J·，Lim S·，and Hermonat,P.L. Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0067] D.脂质体转染试剂Lipofectin:购自美国Invotrogen公司。
[0068] E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清）：购自美国Cellgro公司。
[0069] F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒:购自瑞士Roche公司。
[0070] G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数（copies)Ail至10 9(copies)Ail，购自美国 ProMAGE公司。
[0071] -、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备
[0072] 参照图2,用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿 的病毒为例，当AAVp细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70%时，进行如 下操作：
[0073] A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1 .Oyg AAV/SCC的质粒载体，1. Oyg pHelper质粒，4.0μ1 Lipofectin和50.0μ1含5% (V/V)胎牛血清(或小牛血清）的DMEM培养 基混匀，室温静置20分钟。
[0074] Β.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
[0075] C. 72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
[0076] D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV的病毒液。
[0077] E.将收集的rAAV的病毒液过滤除菌。将获得的携带肿瘤抗原基因一生存素基因全 长SCCAlcDNA的AAV病毒命名为AAV/SCC的病毒载体。
[0078] 二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的病毒滴度测定
[0079] 采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的AAV/SCC的病毒载体进行病毒滴度测定， 具体方法包括以下步骤:所用的DNA探针为针对SCCA1基因的特异性探针。
[0080] A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取r AAV病毒颗粒DNA。
[00811 B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA拷 贝数标准，抽真空。
[0082] C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
[0083] D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为 "实施例1中所获得的SCCAlcDNA" JCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2% (V/V)琼脂糖 凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。
[0084] E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒 DNA进行DNA杂交。AAV/SCC的病毒载体的检测结果如图5所示。图5中，两批AAV/SCC的病毒载 体，每批的病毒滴度都高于5\1012拷贝（(：叩化8)/1111。
[0085]实施例3、AAV/SCC的病毒载体导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验 [0086]材料及其来源：
[0087] A.重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体:AAV/SCC的病毒载体。
[0088] B.AIM-V细胞培养基:购自美国Life Technologies公司。
[0089] C.细胞因子:集落细胞刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素2,4(IL-2,4)以及肿瘤坏死 因子(TNF-α)购自美国R&D公司。
[0090] D. SCC抗原阳性的原代肿瘤细胞:分别为从宫颈癌、肺鳞癌、喉癌、舌癌、食道癌患 者的肿瘤组织分离的癌细胞。
[0091 ] E. SCC抗原阴性原代细胞:SCC抗原阴性的皮肤上皮细胞、肺、乳腺细胞和肝细胞， 从人体组织中分离获得。
[0092] F.MHC I类(MHC Class I)抗原、人SCCA1以及SCCA2抗原的单克隆抗体:购自美国 Abeam公司。
[0093] 一、杀灭肿瘤实验
[0094]如图6所示，将本发明的携带SCCA1抗原基因的rAAV的病毒载体感染肿瘤患者单核 细胞为基础的杀灭肿瘤实验的整个过程包括以下步骤：
[0095] A.取肿瘤患者50-150毫升外周血，用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方 法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧 化碳培养箱中培养2小时。
[0096] B.分离细胞，除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞，monocyte，Mo)。悬浮细胞即 外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。单核细胞为树突状细胞 (Dendri t i c Ce 11 s，DC)的前提细胞，经体外细胞因子诱导成为DC。
[0097] C.在单核细胞中加入一种(或多种，效果更佳)本发明实施例1-2获得的AAV/SCC的 病毒载体，加入量为100M0I，同时再加入GM-CSF(800IU/mL)，继续培养4小时。
[0098] D.除去步骤C的旧培养基，补充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-a(20IU/mL)的 AIM-V培养基，继续培养。
[0099] E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合， 在A頂-V培养基中加入IL-2(20IU/mL)继续培养。
[0100] F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。
[0101] 二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测
[0102] A.rAAV的病毒载体感染外周血单个核细胞的效率检测
[0103] 采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对肿瘤相关抗原一鳞状细胞癌抗原（SCC) 的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明AAV/SCC感染的单核细胞 或未成熟的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，重组腺相关病毒AAV/SCC感 染外周血单个核细胞的效率检测结果如图7所示。图7为携带四种不同启动子的AAV/SCC的 病毒载体感染外周血单个核细胞的效率，四种病毒载体的感染效率分别为91.2%、89.1 %、 84.6%、88.7%，即分别有约91.2%、89.1%、84.6%、88.7%的外周血单个核细胞可被"八￥ 病毒感染，证明本发明的AAV/SCC的病毒载体具有较高的感染效率。
[0104] B.树突状细胞(DC)表达的⑶分子水平的检测
[0105] DC表达⑶80、⑶83以及⑶86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方 法，即分别采用荧光标记的针对这三种CD分子的抗体(购自美国BD公司）对步骤一获得的DC 表达⑶80、CD83以及⑶86的水平进行检测，以无蛋白刺激的DC为对照。其中，以携带SV40p启 动子的AAV/SCC感染的DC为例，其表达⑶80、CD83以及⑶86水平的检测结果如图8b所示。对 照组(无抗原刺激的DC)表达⑶80、CD83以及⑶86水平的检测结果如图8a所示。对照组表达 CD80、CD83以及CD86的水平分别为44.99 %，42.94 %和40.80 %，而被AAV/SCC的病毒载体感 染的DC所表达的⑶分子的水平分别为82.30 %、83.19 %和82.76 %，本发明的AAV/SCC的病 毒载体感染的DC的表达效率明显高于对照组。证明构建和制备的携带鳞状细胞癌抗原基因 的rAAV感染外周血单核细胞后，所诱导的DC的功能强大，有利于刺激细胞免疫反应。另外， P5启动子、CMV启动子、β-肌动蛋白启动子的三种AAV/SCC的病毒载体感染的DC表达⑶80、 CD83和CD86的平均水平较高，提示可有效刺激Thl反应，细胞免疫反应。
[0106] C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素（IFN-γ )水平的检测
[0107] CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤Α类 似的方法检测被本发明rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL表达IFN- γ的水平（以无抗 原刺激的DC所诱导的CTL为对照），DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传 统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美 国BD公司），最后利用流式细胞仪检测结果。以携带AAV p5启动子的AAV/SCC的病毒载体感 染的DC所诱导的CTL为例，其IFN- γ表达水平如图9所示，其CTL表达IFN- γ的水平(平均表 达率为41.5 % )明显高于对照。证明本发明制备的AAV/SCC的病毒载体感染的DC所诱导的 CTL功能强大。另外，SV40启动子、CMV启动子、β-肌动蛋白启动子的三种AAV/SCC的病毒载体 感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平也较高，提示细胞免疫反应较强，亦即CTL的杀伤 活性尚。
[0108] 三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验
[0109]被AAV/SCC的病毒载体感染的DC与淋巴细胞混合培养结束后，将被AAV/SCC的病毒 载体感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)按20:1(淋巴 细胞:肿瘤细胞)与SCC阳性的肿瘤细胞(宫颈癌、肺鳞癌、喉癌、舌癌、食道癌)混合后，采用 传统的 51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性和杀伤特异性。检测结果如图10 所示，被本发明的AAV/SCC的病毒载体感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解(杀伤)SCC阳 性的宫颈癌、肺鳞癌、喉癌、舌癌、食道癌等肿瘤细胞，杀伤率为52%~64%。但该CTL对SCC 抗原阴性的皮肤上皮细胞、肺、乳腺细胞和肝细胞无明显杀伤作用。证明被本发明构建和制 备的AAV/SCC感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。 [0110] 为验证上述CTL的杀伤作用具有MHC Class I限制性，先用MHC class I抗体对该 CTL进行预处理后，再采用51Cr(铬-51)杀伤试验。结果表明SCC阳性的上述肿瘤细胞基本未 被杀伤，如图11所示。证明被本发明构建和制备的AAV/SC感染的DC所诱导的CTL具有MHC Class I限制性。
[0111]为验证上述CTL对SSCA2抗原阳性的肿瘤细胞仍然具有交叉免疫反应，即具有杀伤 (裂解)作用。分别先用SCCA1单抗以及同时用SCCA1单抗和SCCA2单抗对该CTL进行预处理 后，再采用51Cr(铬-51)杀伤试验。结果显示仅用SCCA1单抗处理的CTL仍然对SCC阳性的上述 肿瘤细胞具有明显的杀伤作，但用SCCA1单抗和SCCA2单抗同时处理的CTL对SCC阳性的上述 肿瘤细胞基本未被杀伤，如图11所示。证明被本发明构建和制备的AAV/SC感染的DC所诱导 的CTL对SCCA2抗原阳性的细胞仍然具有明显的杀伤作用。
[0112] 综合上述检测结果，证明被本实施例构建和制备携带鳞状细胞癌抗原SCC基因的 rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL对SCC阳性的肿瘤细胞具有明显的杀伤(裂解)作用， 可用于制备抗肿瘤药物。
[0113] 实施例4、以SCC为靶点的抗肿瘤靶向性细胞免疫治疗的初步临床试验
[0114] 应用上述本发明的技术，即将实施例1-3中被AAV/SCC的病毒载体感染从肿瘤患者 分离的树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分别回输血清SCC阳性的4例宫 颈癌、3例肺鳞癌、4例喉癌、3例舌癌、5例食道癌患者，以患者的血清SCC的变化为标准判断 疗效。
[0115] 输注细胞数为5 X108。治疗疗程:6个月，每月2次。如图12a~12e所示，经过6个月 的治疗，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在大部分受试患者体内能够发 挥一定的疗效，可降低血清SCC水平，甚至恢复正常以及改善症状。其中，各3例宫颈癌、肺鳞 癌、喉癌、舌癌、食道癌患者的血清SCC水平明显降低，甚至恢复正常；1例宫颈癌和1例食道 癌患者的血清SCC水平变化不明显；1喉癌和1例食道癌患者的血清SCC水平例出现上升。所 有患者在治疗过程中无明显的毒副作用发生。该初步临床试验结果提示通过本发明的所制 备的CTL具有一定的抗SCC阳性恶性肿瘤疗效，未来可用于临床抗SSC阳性的恶性肿瘤的靶 向性细胞免疫治疗。
[0116] 工业应用性
[0117] 实验证明，被本发明SCCA1基因重组腺相关病毒rAAV的病毒载体感染的树突状细 胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体内、外可有效地抑制SCC抗原阳性的肿瘤细胞的生长 或者杀灭肿瘤细胞。因而，本发明的AAV/SCC载体或与本发明AAV/SCC载体相关的产品可被 用于临床实践，在SCC阳性的恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的意义。
[0118] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为 属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种携带see抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于:将腺相关病毒载体中的 腺相关病毒的结构基因替换为SCCA1抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。2. 根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于:所述重组腺相关病毒载体 中的启动子为AAV p5启动子、巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子 中的一种。3. -种携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于:在腺相关病 毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入SCCA1抗原基因，得到重组 腺相关病毒载体。4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于:还包括以下步骤:将所述腺相关病毒 的p5启动子替换为下述三种启动子中的一种：巨细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子、 SV40早期启动子。5. 根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 获取see eDNA; 2) 将构建的携带有启动子的AAV 2型pBR3 22质粒和步骤1)得到的SCC cDNA，进行限制 性内切酶反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和SCC eDNA的重组腺相关病毒载 体。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于:所述步骤1)中包括以下步骤：11)从 SCCA1抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总eDNA; 12)以所述 总 eDNA 为模板，在引物 1: CCAGATCACATCGAGTTCA和引物2: CATCTGCAGGTGAACATT的引导下进 行PCR扩增，得到的SCCA1 eDNA。7. -种与携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，其特征在于:包括SCC 重组腺相关病毒的质粒载体、see重组腺相关病毒的病毒载体、被所述see重组腺相关病毒 的病毒载体感染或转染的细胞系;所述see重组腺相关病毒的质粒载体由权利要求1~2所 述的或者权利要求3~6任一项所述的构建方法制得的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒 载体制得;所述SCC重组腺相关病毒的病毒载体由所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体进行 细胞培养得到。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于:所述细胞系为单核细胞-树突状细胞系，该 单核-树突状细胞系为SCC阳性的肿瘤所在体系中自然产生的，被所述SCC重组腺相关病毒 的病毒载体感染或转染得到;或者所述细胞系为SCC抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞系，该 细胞系是see阳性的肿瘤所在体系中自然产生的T淋巴细胞与被所述see重组腺相关病毒的 病毒载体感染或转染的单核-树突状细胞系混合培养形成的。9. 一种与携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，其特征在 于： SCC重组腺相关病毒的质粒载体的制备:将如权利要求1~2所述的或者权利要求3~6 任一项所述的构建方法制得的携带SCC抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠 杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的培养基进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯 化，得到SCC重组腺相关病毒的质粒载体； SCC重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体和 pHelper质粒共转染AAVp细胞得到SCC重组腺相关病毒的病毒载体； see重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述see重组腺相关病 毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细 胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。10. -种如权利要求1所述的携带see抗原基因的重组腺相关病毒载体或者权利要求7 所述相关的产品在制备抗see阳性的肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK105969804SQ201610416191
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】刘勇, 冯雪, 史鹏燕, 董文娟, 李帆, 张慧, 卢敬, 高洪吉
【申请人】深圳益世康宁生物科技有限公司, 刘勇