旋毛虫副肌球蛋白b细胞抗原表位8a1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于免疫生物学领域，涉及用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途。具体地，本发明涉及一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1－4中任一项所示。本发明的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。
【专利说明】旋毛虫副肌球蛋白B细胞抗原表位8A1及其应用
[0001]本发明是申请号为201110448420.2的母案的分案申请，该母案的申请日为2011年12月29日，发明名称为“旋毛虫副肌球蛋白B细胞抗原表位、其组合物及用途”。
【技术领域】
[0002]本发明属于免疫生物学领域，涉及用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途。
【背景技术】
[0003]旋毛虫病是一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病。人的感染主要来源于高致病性的方定毛形线虫(Pozio E.World distribution of Trichinella spp.1nfections inanimals and humans.[J].Vet Parasitol, 2007, 149(1-2):3-21.)? 由于旋毛虫病临床症状复杂，包括腹泻，发热，肌痛，水肿等，令其难以正确诊断，给及时的药物治疗造成了一定困难且药物治疗不能解决该虫的反复感染问题(Gottstein B, Pozio E, Nockler K.Epidemiology, diagnosis, treatment, and control of trichinellosis.[J].Clin MicrobiolRev, 2009, 22(1):127-145.)。旋毛虫病的流行，不仅直接威胁着人类的身体健康，而且对畜牧业、肉食品业以及外贸出口等造成重大经济损失，是我国“十一五”期间重点攻克的食源性寄生虫病之一。
[0004]副肌球蛋白(paramyosin, Pmy)是多种无脊椎动物主要的结构蛋白，在寄生性蠕虫的不同发育阶段呈持续性表达，是参与肌肉收缩的粗肌丝的主要成分(EpsteinH F，Miller D Rj Ortiz I，et al.Myosin and paramyosin are organized about anewly identified core structure[J].J Cell Biol，1985，100(3):904-915.)。 在某些寄生蠕虫的非肌肉部位，如体表、消化道和生殖道也有副肌球蛋白的分布(Zhao QP，Moon S U，Na B K，et al.Paragonimus westerman1:biochemical and immunologicalcharacterizations of paramyosin.[J].Exp Parasitol, 2007, 115 (I):9-18.MatsumotoYj Perry Gj Levine R J，et al.Paramyosin and actin in schistosomal teguments[J].Nature, 1988，333 (6168): 76-78.)。副肌球蛋白同时也是免疫调节分子，在寄生性蠕虫与宿主的相互作用中发挥重要功能(Loukas A, Jones M K, King L Tj et al.Receptor forFe on the surfaces of schistosomes.[J].1nfect Immunj 2001,69 (6):3646-3651.DengJj Gold Dj Loverde P T，et al.1nhibition of the complement membrane attack complexby Schistosoma mansoni paramyosin.[J].1nfect Immunj2003，71(11):6402-6410.)。旋毛虫的副肌球蛋白基因(Ts-Pmy GenBank accession N0.:EF429310)全长为2996bp，其开放读码框架(ORF) 2655bp，编码885个氨基酸，理论分子量为102kDa。
[0005] 但是目前对旋毛虫副肌球蛋白的抗原表位的研究尚不深入。使用旋盘尾丝虫感染病人的血清对犬恶丝虫副肌球蛋白的表位作图研究显示，感染血清主要识别副肌球蛋白分子的氛基端(Steel C，Limberger R Jj Mcreynolds L A, et al.B cell responsesto paramyosin.1sotypic analysis and epitope mapping of filarial paramyosin inpatients with onchocerciasis.[J].J Immunol, 1990，145 (11):3917-3923),而在日本血吸虫和猪带绦虫的相关研究显示，感染血清主要识别蛋白的羧基端(Vazquez-TalaveraJ, Solis C F，Medina—Escutia E, et al.Human T and B cell epitope mappingof Taenia solium paramyosin.[J].Parasite Immunol, 2001, 23(11):575-579.Nara T, Tanabe K, Mahakunkijcharoen Y, et al.The B cell epitope of paramyosinrecognized by a protective monoclonal IgE antibody to Schistosoma japonicum[J].Vaccine, 1997，15(1):79-84.)。之所以识别不同的部位，可能是由于线虫纲与吸虫和绦虫纲的副肌球蛋白优势表位的分布有所不同。 [0006]故此，尚需要开发新的抗体和抗原表位，以期对旋毛虫感染及其所致疾病进行有效地防治。
【发明内容】
[0007]本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现将Ts-Pmy分三段表达部分重叠的蛋白片段(rTs-Pmy-Nl-322aa、rTs-Pmy-M286_600aa、和 rTs-Pmy-C571_885aa)，与感染后27-45天的小鼠混合血清进行识别，发现其中主要识别副肌球蛋白的是N端片段(rTs-Pmy-Nl-322aa)。本发明人基于该N端片段进行副肌球蛋白抗原分子表位的研究，得到了抗原表位。本发明人惊奇地发现，得到的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。由此提供了下述发明:
[0008]本发明的一个方面涉及一种抗原表位，其具有SEQ ID NO:1- 4中任一项所述的氨基酸序列:
[0009]ALSTPTFSTLPA (SEQ ID NO:1)
[0010]LPffHFKSRHRYQ (SEQ ID NO:2)
[0011]SHWNSHSTPARA (SEQ ID NO:3)
[0012]LSTPYSKSQAST (SEQ ID NO:4)。
[0013]在本发明的一个实施方案中，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 — 4中任一项所示。
[0014]所述抗原表位可以通过人工化学合成的方式得到，也可以本领域技术人员知晓的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
[0015]本发明的还涉及一种多肽，其具有SEQ ID NO:1 一 4中任一项所述的氨基酸序列。
[0016]本发明的再一方面涉及一种核苷酸序列，其编码本发明任一项所述的抗原表位；具体地，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8 — 11中任一项所示:
[0017]GCGCTGAGTACTCCGACTTTTTCGACTCTGCCTGCG (SEQ ID NO:8)
[0018]CTTCCGTGGCATTTTAAGTCGCGTCATACGTATCAG (SEQ ID NO:9)
[0019]TCTCATTGGAATAGTCATTCGACTCCTGCGCGTGCG (SEQ ID NO:10)
[0020]CTGTCGACGCCTTATTCGAAGTCTCAGGCGTCGACT (SEQ ID NO:11)。
[0021]本发明的另一方面涉及一种抗原，其具有本发明任一项所述的抗原表位；具体地，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0:16所示。
[0022]MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQffKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID NO:16)
[0023]本发明的还一方面涉及编码本发明的抗原的核苷酸序列；具体地，所述抗原的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0024]ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO:15)
[0025]本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明任一项所述的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为重组表达载体。
[0026]可以将本发明的任一项的核苷酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括I或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
[0027]其中，术语“调控序列”定义为包括表达本发明的抗原表位所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。
[0028]重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
[0029]本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的重组载体。
[0030]可将包含本发明之核酸序列的重组载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
[0031]宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
[0032]本发明的再一方面涉及一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为本发明任一项所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。
[0033]本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一种或多种本发明的抗原表位，和/或一种或多种本发明的抗原，和/或一种或多种本发明的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。 [0034]本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的抗原或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
[0035]实施例6的数据显示，本发明的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，能够有效地防治旋毛虫感染或旋毛虫感染所致疾病，具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。
[0036]本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够特异性地结合本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的抗原或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物。
[0037]在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。
[0038]本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为本发明任一项所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种。
[0039]本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
[0040]本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒为旋毛虫感染或旋毛虫感染所致疾病的检测或诊断试剂盒。
[0041]本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
[0042]发明的有益效果
[0043]本发明的抗原表位具有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1:SDS-PAGE鉴定纯化的腹水8F12mAb。1，低分子量蛋白marker; 2，8F12株未纯化腹水；3，8F12株柱纯化后抗体。注:65kDa处的杂带应该是血清中白蛋白的位置，含量很大，所以纯化中很难完全去除。[0045]图2:8F12抗体亲和力常数测定。注:C。为抗体初始浓度，C为抗体稀释后浓度。
[0046]图3:mAb8F12及自然感染血清抗旋毛虫感染的被动免疫保护性。肌幼虫虫荷(LPG)为每克肌肉的肌幼虫数。以均数土标准差(n=6)表示。注广是与PBS对照组比较，p〈0.01。
[0047]图4:mAb8F12与阳性噬菌体克隆的特异性识别(ELISA法鉴定)。以野生噬菌体M13作为阴性对照，BSA包被孔用以排除交叉反应。
[0048]图5:mAb8F12与阳性噬菌体克隆的特异性识别(Western blot) [0049]泳道1:噬菌体克隆8JJ ;泳道2:噬菌体克隆8A1 ；
[0050]泳道3:噬菌体克隆8A9 ;泳道4:噬菌体克隆8F1 ；
[0051]泳道5:噬菌体克隆8F6 ;泳道6:噬菌体克隆8F7 ；
[0052]泳道7:噬菌体克隆8F10 ;泳道8:M13野生噬菌体克隆。
[0053]图6:合成多肽与mAb8F12特异性结合的ELISA检测(多肽偶联载体BSA包被)。注:mAb5A3作为无关腹水对照。
[0054]图7:各组免疫小鼠的肌幼虫数。注:与KLH对照组比较，#p〈0.01，*p〈0.05。【具体实施方式】
[0055]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0056]实施例1:rTs_Pmy_Nl_322aa蛋白的制备
[0057]如下面的步骤I 一 6顺序所示。
[0058]1.Ts-Pmy-Nl-322aa 基因片段的扩增
[0059]根据副肌球蛋白基因(Ts-PmyGenBank accession N0.:EF429310)读码框序列，可得到Ts-Pmy-Nl-322aa的核苷酸序列，如下:
[0060]ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO: 15)[0061]其编码的氨基酸序列如下:
[0062]MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQffKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID NO:16)
[0063]Ts-Pmy-Nl_322aa基因片段可以根据SEQ ID NO:15通过人工合成得到，也可以采用下面的PCR扩增的方法得到。
[0064]引物设计:如下面的表1所示。引物合成与序列测定均由上海英骏公司完成。
[0065]表1:引物数据
[0066]
【权利要求】
1.一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所不。
2.编码权利要求1所述抗原表位的核苷酸序列；具体地,所述核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。
3.—种重组载体,其含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种重组宿主细胞，其含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为权利要求1所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。
6.—种组合物,其包含一种或多种权利要求1所述的抗原表位，和/或一种或多种权利要求5所述的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。
7.权利要求1所述的抗原表位或者权利要求5所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
8.一种抗体，其能够特异性地结合权利要求1所述的抗原表位或者权利要求7所述的抗原表位偶联物。
9.一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求8所述的抗体，所述偶联部分为选 自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白和生物素中的一种或多种。
10.一种药物组合物，其包含权利要求8所述的抗体或者权利要求9所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
【文档编号】A61K47/48GK103724413SQ201410005780
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2011年12月29日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】诸欣平, 顾园, 魏骏飞, 杨静 申请人:首都医科大学