一种罂粟碱人工抗原的合成方法
【专利摘要】一种罂粟碱人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以罂粟碱与溴、碘化亚铜、氨水反应得到具有氨基的产物为半抗原，用重氮法将半抗原与载体蛋白偶联，用紫外法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了罂粟碱人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。
【专利说明】
一种罂粟碱人工抗原的合成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种罂粟碱人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 罂粟碱是一种苄基异喹啉类生物碱，罂粟的壳和籽中含量较高。由于具有抗痉挛 作用和对血管、心脏或其它平滑肌的直接非特异性松弛作用，罂粟碱被广泛地应用于脑、心 和外周血管痉挛引起的缺血以及肾、胆和胃肠道等内脏痉挛的临床治疗中，但久服易成 瘾。由于罂粟壳的易成瘾性，国内有许多不法商贩为吸引顾客，将其加入到食品中，如火锅 底料、方便面调料等，尤其是近年来抽查的火锅底料中，绝大部分都含有罂粟碱成分。因此， 建立快速有效的检测罂粟碱含量的方法具有重要意义及市场价值。
[0003] 酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力 和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是重要的一步。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种罂粟碱人工抗原的合成方法，所制备的产品用于罂粟碱 免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
[0005] 本发明的技术方案，一种罂粟碱人工抗原的合成方法，其由罂粟碱与溴、碘化亚 铜、氨水反应得到具有氨基的产物，即半抗原PAPAM，用重氮法将半抗原PAPAM与载体蛋白偶 联，即得到罂粟碱人工抗原;步骤为： (1)半抗原PAPAM的合成： 合成路线如下：
称取罂粟碱原药1(1 g，2.95 mmol)溶解于醋酸与水体积比1:1混合的溶液10 mL中，取 溴0.4mL用醋酸4mL稀释后滴加入上述溶液，室温下搅拌3.5h;加入30mL7K，用二氯甲烷30mL 分三次进行萃取，得到有机层;所得有机层用饱和Na2S2O3及质量浓度为10%的NaHCO 3水溶液 进行洗涤并干燥;得到化合物Π I. Ig; 称取化合物Π (600mg，1 · 43mmol)，碘化亚铜50mg，铜（100mg，1 · 78mmol)混悬于氨水 IOmL中，在50mL密封管中140°C搅拌过夜;反应体系为水溶液体系，用乙酸乙酯萃取；用盐水 洗涤有机层，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物;将粗产物通过制备型HPLC纯化，得到化合 物ΙΠ 250mg，得率49.1%，即为半抗原PAPAM; (2)完全抗原的制备：步骤（1)制备的半抗原PAPAM，与KLH偶联得到偶联物完全抗原 PAPAM-KLH;或与BSA偶联得到偶联物完全抗原PAPAM-BSA;或与OVA偶联得到偶联物完全抗 原PAPAM-0VA〇
[0006] 步骤(2)所述完全抗原PAPAM-KLH制备方法如下： a、 称取步骤(1)制备的PAPAM，用300-1000yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入IM盐酸， 其中PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液；取匙孔血蓝蛋白KLH，PAPAM与KLH摩尔比在4000:1到 9000:1范围内，加入与KLH等体积的碳酸钠 /碳酸氢钠缓冲溶液，称为B液;在冰浴条件下，逐 滴将A液加入到B液中，用IM氢氧化钠溶液调节pH8-9,冰浴条件反应4-5h，即得偶联物 PAPAM-KLH 混合液； b、 透析:取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用；将偶联物PAPAM-KLH混合液放入透析袋于0.0 lmo I /L的I3BS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-KLH。
[0007] 步骤(2)所述完全抗原PAPAM-BSA制备方法如下： a、 称取步骤（1)制备的PAPAM，用300-1 OOOyL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入IM盐 酸，PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液;称取牛血清蛋白BSA，PAPAM与BSA摩尔比在20:1到100:1 范围内，用2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液溶解BSA，称为B液;在冰浴条件下，逐滴将A液加入 至丨JB液中，用IM的氢氧化钠溶液调节pH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-BSA混合 液； b、 透析:取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用;将偶联物PAPAM-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-BSA。
[0008] 步骤(2)所述完全抗原PAPAM-0VA的制备方法如下： a、 称取步骤（1)制备的PAPAM，用300-1 OOOyL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入IM盐 酸，PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液;称取鸡卵清白蛋白OVA，PAPAM与OVA摩尔比在20:1到100: 1范围内，用2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液溶解0VA，称为B液;在冰浴条件下，逐滴将A液加 入到B液中，用IM的氢氧化钠溶液调节pH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-0VA混 合液； b、 透析:取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用;将偶联物PAPAM-0VA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-0VA。
[0009] 罂粟碱的人工抗原的鉴定 (1)采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
[0010] (2)人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计 算其偶联比。
[0011] 偶联比测定:估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法，虽然测 定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建 立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
[0012] 偶联物蛋白浓度测定:将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即得到偶联 物中蛋白的含量。
[0013] 偶联物中小分子浓度的测定:浓度为Xyg/mL的小分子在特征峰处的吸光值AUS 联物在特征峰处的吸光值A2,小分子的分子量为M，所以，偶联物中小分子的浓度=(A2X X)/ Al 偶联比=((A2XX)/ Al/Μ)/(蛋白浓度/蛋白分子量）X(稀释倍数） 本发明的有益效果:本发明成功合成了罂粟碱的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全 可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。
【附图说明】
[0014] 图1半抗原PAPAM的NMR鉴定图。
[0015] 图2半抗原PAPAM的LC-MS鉴定图。
[0016] 图3-a PAPAM-KLH人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
[0017]图3-b PAPAM-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
[0018]图3-c PAPAM-0VA人工抗原的包被原紫外鉴定图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1半抗原PAPAM的合成
称取罂粟碱原药I (I g，2.95 mmol)溶解于醋酸与水体积比1:1混合的溶液(10 mL)中， 取溴(0.4 mL)用醋酸(4 mL)稀释后滴加入上述溶液，室温下搅拌3.5 h。加入30 mL水，用二 氯甲烷（10 mL X 3)萃取。有机层用饱和Na2S2O3,10% NaHCO3,水进行洗涤并干燥。得到化 合物11(1.1克，得率89.4%)。
[0020] 称取化合物 Π (600 mg，1 ·43 mmol)，鹏化亚铜（50 mg)，铜（100 mg，1 ·78 mmol)混 悬于氨水（10 mL)中，在50mL密封管中140°C搅拌过夜。反应体系为水溶液体系，用乙酸乙酯 萃取。用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。将粗产物通过制备型HPLC纯 化，得到化合物ΙΠ (250 mg，得率49.1 % )即为半抗原PAPAM。
[0021 ] 半抗原PAPAM的NMR鉴定图如图1所示，半抗原PAPAM的LC-MS鉴定图如图2所示。
[0022] 实施例2偶联物PAPAM-KLH的制备 称取PAPAM[Mw(PAPAM)为390.85]4mg，用300yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入31yL IM HCKPAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3)，在4°C条件下冰浴30min，再加入3yL 30%亚硝酸钠 溶液(PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3)，在pH 2-3的条件下反应l-5min(以活 化液颜色由黄变红为标准，称为A液）。取匙孔血蓝蛋白KLH[Mw(KLH)为4000000] ImL (6.8mg/mL)，（PAPAM与KLH摩尔比约为6000:1)加入与KLH等体积的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶 液(称为B液），在冰浴条件下，逐滴将A液加入到B液中，调节pH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得 偶联物PAPAM-KLH混合液。
[0023]透析袋前处理：取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60 °C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将偶联物?4?六1-1(1^混合液放入透析袋于0.01111〇1/1的 PBS缓冲液中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-KLH。
[0024] 实施例3偶联物PAPAM-BSA的制备 称取PAPAM 3mg，用300yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入24yL IM HCUPAPAM与盐酸 摩尔比控制为1:3)，在4°C条件下冰浴30min，再加入2.5yL 30%亚硝酸钠溶液(PAPAM与30% 亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3)，在pH 2-3的条件下反应l-5min(以活化液颜色由黄变 红为标准，称为A液）。称取牛血清蛋白BSA [Mw(BSA)为67000]10mg(PAPAM与BSA摩尔比约为 50:1 )，溶解于2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中，在冰浴条件下，逐滴将A液加入到B液中，调 节PH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-BSA混合液。
[0025]透析袋前处理：取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60 °C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将偶联物?4?41-854混合液放入透析袋于0.01111〇1/1的 PBS缓冲液中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-BSA。
[0026] 实施例4偶联物PAPAM-0VA的制备 称取PAPAM 2.6mg，用300yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入21yL IM HCUPAPAM与盐 酸摩尔比控制为1:3)，在4°C条件下冰浴30min，再加入2yL 30%亚硝酸钠溶液(PAPAM与30% 亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3)，在pH 2-3的条件下反应l-5min(以活化液颜色由黄变 红为标准，称为A液）。称取鸡卵清白蛋白0VA[Mw(0VA)为45000] 10mg(PAPAM与OVA摩尔比约 为30:1)，溶解于2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中，在冰浴条件下，逐滴将A液加入到B液中， 调节PH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-0VA混合液。
[0027]透析袋前处理：取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60 °C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将偶联物?4?41-0￥4混合液放入透析袋于0.01111〇1/1的 PBS缓冲液中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-0VA。
[0028]实施例5罂粟碱人工抗原的鉴定 (1)采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
[0029] (2)人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子(PAPAM)与蛋白的 浓度，计算其偶联比。
[0030] 偶联比测定:估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法，虽然测 定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建 立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
[0031] 偶联物蛋白浓度测定:将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶 联中蛋白的含量。
[0032]实施例2中PAPAM-KLH免疫原的紫外鉴定图如图3-a所示； 实施例3中PAPAM-BSA免疫原的紫外鉴定图如图3-b所示； 实施例4中PAPAM-0VA包被原的紫外鉴定图如图3-c所示。
[0033] PAPAM-BSA免疫原偶联物中小分子浓度的测定：浓度为10yg/mL的小分子(PAPAM) 在特征峰327nm处的吸光值Al= 0.170082，偶联物在327nm处的吸光值A2=0.222826，小分子 的分子量为390.85g/mol，所以，偶联物中小分子的浓度=(0.222826 X 10yg/mL)/ 0.170082 =13 · 101 lyg/mL; BSA 浓度 3 · 33yg/mL，BSA 分子量67000。
[0034]偶联比=(13 · 101 lyg/mL/390 · 85)/(3 · 33yg/mL /67000) X 12(稀释倍数）=8。
【主权项】
1. 一种罂粟碱人工抗原的合成方法，其特征在于其由罂粟碱与溴、碘化亚铜、氨水反应 得到具有氨基的产物，即半抗原PAPAM，用重氮法将半抗原PAPAM与载体蛋白偶联，即得到罂 粟碱人工抗原;步骤为： (1) 半抗原PAPAM的合成： 合成路线如下：称取罂粟碱原药I 1 g，即2.95 mmol溶解于醋酸与水体积比1:1混合的溶液10 mL中， 取溴0.4mL用醋酸4mL稀释后滴加入上述溶液，室温下搅拌3.5h;加入30mL水，用二氯甲烷 30mL分三次进行萃取，得到有机层;所得有机层用饱和Na 2S2〇3及质量浓度为10%的NaHC03水 溶液进行洗涤并干燥;得到化合物Π 1. lg; 称取化合物Π 600mg，即1.43mmol，鹏化亚铜50mg，铜100mg，即1.78mmol混悬于氨水 10mL中，在50mL密封管中140°C搅拌过夜;反应体系为水溶液体系，用乙酸乙酯萃取；用盐水 洗涤有机层，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物;将粗产物通过制备型HPLC纯化，得到化合 物ΙΠ 250mg，即为半抗原PAPAM; (2) 完全抗原的制备：步骤（1)制备的半抗原PAPAM，与KLH偶联得到偶联物完全抗原 PAPAM-KLH;或与BSA偶联得到偶联物完全抗原PAPAM-BSA;或与OVA偶联得到偶联物完全抗 原PAPAM-OVAo2. 如权利要求1所述罂粟碱人工抗原的合成方法，其特征在于:步骤(2)所述完全抗原 PAPAM-KLH制备方法如下： a、 称取步骤（1)制备的PAPAM，用300-1000yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入1M盐酸， 其中PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液；取匙孔血蓝蛋白KLH，PAPAM与KLH摩尔比在4000:1到 9000:1范围内，加入与KLH等体积的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，称为B液;在冰浴条件下，逐 滴将A液加入到B液中，用1M氢氧化钠溶液调节pH8-9,冰浴条件反应4-5h，即得偶联物 PAPAM-KLH 混合液； b、 透析:取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用；将偶联物PAPAM-KLH混合液放入透析袋于0.0 lmo 1 /L的roS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-KLH。3. 如权利要求1所述罂粟碱人工抗原的合成方法，其特征在于:步骤(2)所述完全抗原 PAPAM-BSA制备方法如下： a、称取步骤（1)制备的PAPAM，用300-1000yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入1M盐 酸，PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液;称取牛血清蛋白BSA，PAPAM与BSA摩尔比在20:1到100:1 范围内，用2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液溶解BSA，称为B液;在冰浴条件下，逐滴将A液加入 至丨JB液中，用1M的氢氧化钠溶液调节pH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-BSA混合 液； b、透析:取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用;将偶联物PAPAM-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-BSA。4.如权利要求1所述罂粟碱人工抗原的合成方法，其特征在于:步骤(2)所述完全抗原 PAPAM-0VA的制备方法如下： a、 称取步骤（1)制备的PAPAM，用300-1000yL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入1M盐 酸，PAPAM与盐酸摩尔比控制为1:3,在4°C条件下冰浴30min，再加入30%亚硝酸钠溶液， PAPAM与30%亚硝酸钠溶液摩尔比控制为1:1.3,在pH 2-3的条件下活化反应l-5min，以活化 液颜色由黄变红为标准，称为A液;称取鸡卵清白蛋白OVA，PAPAM与OVA摩尔比在20:1到100: 1范围内，用2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液溶解0VA，称为B液;在冰浴条件下，逐滴将A液加 入到B液中，用1M的氢氧化钠溶液调节pH8-9，冰浴条件反应4-5h，即得偶联物PAPAM-0VA混 合液； b、 透析:取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗3min，保存在4 °C去离子水中备用;将偶联物PAPAM-0VA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS缓冲液中透 析3天，每天三次换液，即得完全抗原PAPAM-0VA。
【文档编号】C07K1/34GK105859873SQ201610372103
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】吴晓玲, 姚蕾珺, 胥传来, 匡华, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学