基于lamp技术检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于LAMP技术检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法，本发明基于LAMP技术检测罂粟的引物,其特征在于包括：正向外引物F3：5'?TCGATGAAAAATTCCCTGAAC?3'；反向外引物B3：5'?CACGTTTAGGGGTACTGAT?3'；正向内引物FIP和反向内引物BIP；本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，基于LAMP技术检测罂粟的引物；本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于检测检测罂粟的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测检测罂粟的方法。
【专利说明】
基于LAMP技术检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 罂粟学名:Papaver somniferum L.，罂粟科植物，是制取鸦片的主要原料，未成熟 果实含乳白色浆液，制干后即为鸦片，其提取物也是多种镇静剂的来源，如吗啡、可待因、和 罂粟碱等多种生物碱，其中吗啡是其主要成分，加工入药，有敛肺、涩肠、止咳、止痛和催眠 等功效，治久咳、久泻、久痢、脱肛、心腹筋骨诸痛;学名"somniferum"的意思是"催眠"，反映 出其具有麻醉性。罂粟的种子罂粟籽是重要的食物产品，其中含有对健康有益的油脂，广泛 应用于世界各地的沙拉中，而罂粟花绚烂华美，是一种很有价值的观赏植物。罂粟果壳性微 寒，味酸涩，有小毒，含低量吗啡等生物碱。另含多糖约2.4%，水解可得乳糖10%、阿拉伯糖 6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醛酸Galacturonic acid 60%、4-〇_甲基葡萄糖醛酸-〇-Methylglucuronic acid 4%、微量岩藻糖Fucose、2-〇_甲基岩藻糖2-〇_Methylfucose、2-〇-甲基木糖2-〇_Methylxylose及葡萄糖酸酸G-tucuronic acid、景天庚糖Sedoheptulose、 D-甘露庚酮糖 D_Mannoheptulose、D-甘油基-D-甘露辛酮糖 D-Glycero-D-Mannooctulose、 内消旋肌醇Mesoinositol、赤藓醇Erythritol，有敛肺、湿肠、止痛的作用，用于久咳、久泻、 脱肛、脘腹疼痛，但是该品易成瘾，不宜常服。目前一些不法商贩将罂粟壳作为食品添加剂 加入到火锅底料、卤汤、烧烤味调料等食品中，使人食用后产生快感，并逐渐产生依赖性以 达到招揽回头客的目的。人如果长期食用含有罂粟成分的食物，就会出现兴奋、烦躁不安、 冒虚汗、全身乏力犯困、面黄肌瘦等慢性中毒症状，还会使人嗜睡、性格改变、记忆力减退， 长期食用还会导致精神失常、出现幻觉;还容易是车辆驾驶员犯困、注意力不集中而造成交 通事故;添加了罂粟壳的食品由于非常容易使人上瘾，甚至走上吸毒犯罪的道路等等，这种 违法行为严重损坏了消费者的健康，业已成为食品安全的严重的隐患。我国早就明文禁止 在食品中添加罂粟成分的，国务院已经将罂粟壳列入《麻醉药品管理办法》名录中，将罂粟 壳按照麻醉品进行管理。因此，建立一种更加快速、灵敏、方便的检测方法是保障人民身体 健康的一项重要手段、是行政执法的技术后盾、新的检测技术和方法已经成为一项迫切需 要的政治任务，刻不容缓。
[0003] 目前我国对于罂粟的检测还没有一个统一的标准，主要检测方法有化学分析法、 薄层色谱法、免疫分析法、气质联用法以及液相色谱法等。化学分析法是根据罂粟壳所含的 生物碱与特定试剂反应显色来作定性检测，简单迅速但灵敏度低;薄层色谱法也是根据罂 粟壳所含的生物碱来检测，可以同时检测多种生物碱，但是检测灵敏度也低、特异性差，且 易污染环境;免疫分析法是利用罂粟的生物碱制备的特异性抗体来检测生物碱抗原的存在 与否，检测灵敏度可达〇. l_20ug/kg，该方法比较快速、通量较高、灵敏度也较强，可以作为 日常大量样品筛查检测之用，但是该方法不能准确定量，且抗体制备较难又不易保存，重复 性不高，假阳性率高。气相色谱法GC、气相色谱质谱法GC-MS、高效液相色谱法HPLC、液相色 谱-串联质谱法LC-MS:可以检测吗啡和可卡因等，虽然检测灵敏度较高，但都需要昂贵的设 备、环境要求高、检测周期长、检测费用昂贵、还需要专业训练过的技术人员，不适合基层和 现场检测。另外上述方法都是对生物碱进行间接的检测，不能对罂粟物种来源进行准确的 定性。
[0004] 目前火锅底料和小吃类食品等中的非法添加罂粟壳的现象已经引起了人们对食 品安全问题的高度重视和全社会的广泛关注，为了能够尽快准确的给监管执法提供执法依 据，迫切需要能够又快又准又方便且适合基层普通实验室对罂粟物种来源进行准确的定性 的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准 确性高、特异性强、灵敏性高，基于LAMP技术检测罂粟的引物；
[0006] 本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于检测检测罂粟的试剂盒；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测检测罂粟的方法。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0009] -种基于LAMP技术检测罂粟的引物，其特征在于包括：
[0010] 正向外引物卩3:5，-1^1^丁6厶厶厶厶厶1'1^0^6厶厶(：-3，；
[0011] 反向外引物83:5'-〇厶〇61'11^666丁厶〇^1'-3'；
[0012]正向内引物FIP和反向内引物BIP;
[0013] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0014] 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0015]
[0016] F2:5，-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3，；
[0017]所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0018] 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3 '；
[0019]
[0020] B2:5，-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3，。
[0021 ] -种基于LAMP技术检测罂粟的试剂盒，其特征在于包括有： 2 X反应液缓冲液 0. 5mL 引物 〗;5(ua 酶溶液 60 μ I
[0022] 阳性对照 20 W L 对照引物溶液 20 μ L 去离子水 ΙΟΟ??α
[0023] 所述的引物包括：
[0024] 正向外引物卩3:5，-1^1^丁6厶厶厶厶厶1'1^0^6厶厶(：-3，；
[0025] 反向外引物83:5，-〇厶〇61'7^6666丁厶(^6厶1'-3，；
[0026] 正向内引物FIP和反向内引物BIP;
[0027] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0028] 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0029] 其中 F1 c: 5，-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ；
[0030] F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0031]所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0032] 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3 '；
[0033] 其中Blc:5，-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3，；
[0034] B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'；
[0035]其中该试剂盒的产品规格:50次。
[0036] 如上所述的试剂盒，其特征在于所述的反应液缓冲液2 X由以下组分组成： Tris-lICl (nll8. 8) 40??ιΜ KC1 20mM ig：S04 16mM：
[0037] (NIi/!)2S(M 200mM Tween20 0:. 2%： Betaine 1, 6M. dNTPs 2. 8mM 〇
[0038] 如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混 合液。
[0039] 如上所述的任一种试剂盒，其特征在于在所述2 X反应液缓冲液中含有钙黄绿素 荧光染料。
[0040] -种基于LAMP技术检测罂粟的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0041 ] A、米用纳米磁珠提取待测样品的DNA;
[0042] B、采用如权利要求5所述的试剂盒，在冰上，按比例取反应液缓冲液、引物、酶溶 液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液；
[0043] C、将适量待测样品的DNA加入步骤B中的灭菌管中；
[0044] D、将步骤C中的试管放置在AB7500荧光定量PCR仪中，在63°C下保持恒温1小时；
[0045] E、如果待检样品与阳性对照一样出现典型的S扩增曲线，则判定为阳性，如果与阴 性对照一样没有扩增曲线，而判定为阴性。
[0046] 如上所述的方法，其特征在于步骤A中采用纳米磁珠提取待测样品DNA的具体步 骤：
[0047] a、制样:取0. lg的植物组织加入lmL抽提缓冲液进行研磨；
[0048] b、清洗纳米磁珠:取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH20反复清洗纳米磁珠3次， 在磁铁的作用下吸去ddH 20;
[0049] c、结合:加入100yL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下 吸附；
[0050] d、清洗:在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
[0051 ] e、裂解:加入50yL ddH20到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95 °C，lOmin;
[0052] f取样:用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品DNA。
[0053] 如上所述的方法，其特征在于所述的免疫纳米磁珠通过以下工艺制作：
[0054]①纳米磁珠的制备
[0055]分别取5.2g FeCl3 · 6H20、2.7g FeS〇4 · 7H20、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于 200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液;在80°C下搅拌，反应 结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙 醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性纳米粒子无水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性纳米粒子 无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min;滴加0.4mL APTES，室温下搅拌 7h;反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3〇4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水 乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe 3〇4纳米磁珠无水乙醇溶液；
[0056]②免疫磁珠的制备
[0057] 取0.5mL氨基化Fe3〇4纳米磁珠无水乙醇溶液，用lmL PBS清洗3次，磁分离器弃上清 液;加入5 % (V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃 上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3〇4纳米粒子，室温下振荡固定2h;磁分离， 用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存备用，得到免疫磁珠。
[0058]本发明中用到的一些材料：
[0059] 1.1植物：
[0060] 虞美人Papaver rhoeas和罂粟种子购于医药公司。
[0061 ] 1.2主要试剂和耗材
[0062] (l)PCR反应试剂：10XPCR buffer、dNTPs、MgC12、Taq DNA聚合酶，宝生物工程（大 连)有限公司；
[0063] (2)DNA Marker DL1000、6 X loading buffer，宝生物工程(大连）有限公司；
[0064] (3)LAMP 反应试剂；
[0065] (4)Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；
[0066] (5)甜菜碱(Betaine)，广州威佳生物有限公司；
[0067] dNTPs、MgC12,宝生物工程(大连)有限公司；
[0068] (6)50XTAE缓冲液：将242g Tris与37.2g Na2EDTA · 2H20溶于800mL去离子水中， 充分搅拌溶解，再加入57. lmL醋酸，搅拌均匀，最后用去离子水将溶液定容至1L，使用时稀 释50倍；
[0069] (7)琼脂糖，广州捷倍斯生物有限公司；
[0070] (8)70% 乙醇；
[0071] (9)LAMP引物（正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3)及 PCR引物(上游引物、下游引物），宝生物工程(大连)有限公司合成；
[0072] (10)纳米磁珠 (magnetic nano particles，MNP)试剂盒购自北京金纳科技有限公 司；
[0073] 1.3主要仪器设备
[0074] (1) 一8〇Γ冷冻冰箱；
[0075] (2) Labof uge400R高速冷冻台式离心机；
[0076] (3)普通PCR仪及AB7500荧光定量PCR仪；
[0077] (4)法国UVP凝胶成像系统；
[0078] (5)DYY_7型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；
[0079] (6)微量移液器，1 OOOyL、200yL、1 OOyL、1 OyL，2 · 5yL，；
[0080] (7)微波炉；
[0081] (8)分析天平，梅特勒一托利多仪器有限公司；
[0082] (9)高温高压灭菌锅；
[0083] (10)超纯水系统，Milli - Q Academic，Millipore公司；
[0084] (11)日本Shimadzu公司UV-120-02型可见一紫外分光光度计；
[0085] (12)超净工作台；
[0086] (13)漩涡混合器；
[0087] (14)酶联检测仪；
[0088] (15)AB7500 荧光定量 PCR 仪；
[0089]综上所述，本发明的有益效果：
[0090] 利用本发明引物、试剂盒及检测方法检测罂粟，具有快速、简便、高效、准确性高、 特异性强、灵敏性高等优点。
【附图说明】
[0091] 图1为用本发明引物检测罂粟的扩增检测曲线图；
[0092] 其中1:罂粟阳性对照;2:含有罂粟的待检样品；3:阴性对照及虞美人样品。
【具体实施方式】
[0093]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0094] 实施例1 [0095]本发明试剂盒：
[0096] 1.产品规格:50次
[0097] 2.特点：
[0098] 环介导等温扩增法loop-mediated isothermal amplification,LAMP是一种新型 基于扩增方法，仅用一种酶在恒温下进行扩增，由于使用能够识别靶DNA 6个特异序列的6 条引物，所以特异性高，且扩增效率非常高，能够在短时间大量扩增，反应结果可以目测判 定。
[0099] 本试剂盒采用环介导等温扩增法，以脱氧核糖核酸DNA为模板直接进行逆转录环 介导等温扩增的简易试剂盒，本试剂盒使用混合逆转录酶和DNA聚合酶的酶溶液，只需将待 测样品和本试剂盒中的试剂按照要求混合后置于一定的温度下63°C反应1小时左右，即可 从AB7500仪器上的扩增曲线判定结果。
[0100] 3.试剂盒组成内容：
[0101] 1 )· LAMP反应液缓冲液0 · 5mL
[0102] 2).引物 150yL
[0103] 3).酶溶液 60yL
[0104] 4).阳性对照(20yL)
[0105] 5).对照引物溶液(20yL)
[0106] 6).去离子水（lOOOyL)
[0107] 4.操作方法：
[0108] 1).试剂的配制：
[0109] a.取_20°C下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
[0110] b.预混液的配制（在冰上进行）：取检测所需的反应量，按照下表比例（一个反应） 分别分装在另外准备的预混溶液配制用的灭菌管中：
[0112] 其中反应缓冲液成分(2X): Tris-HCl(pH8. 8) 40mM
[0113] KC1 20mM MgS04 16mM： (NIM)2S04 :200mM
[0114] Tween20 0 ?()， Betaine 1.·.碰 dNTPs 2. 8mM/种
[0115] 酶溶液：
[0116] Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
[0117] 反应缓冲液中含有钙黄绿素荧光染料：
[0118] 钙黄绿素初始与与锰离子结合而处于荧光猝灭状态，随着LAMP反应的进行，，由于 反应副产物焦磷酸离子夺取与钙黄绿素结合的锰离子而使得钙黄绿素恢复游离出来从而 发出荧光，而且钙黄绿素一旦与反应液中的镁离子结合，还会使得荧光得到增强。引物：
[0119] 罂粟通用引物序列(5'_3'）
[0120]
[0121 ] c.分装后轻弹击试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在试管底部；
[0122] 2).加样:往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的DNA 2yL，使总量达 至lj20yL，阴性对照反应使用去离子水2yL作为样品，阳性对照反应使用带有该罂粟病毒核酸 的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；
[0123] 3).扩增：将试管放置在AB7500荧光定量PCR仪中，在63°C下保持恒温1小时，然后 直接观测荧光扩增曲线；
[0124] 4).结果判定：如果待检样品与阳性对照一样出现典型的S扩增曲线，则判定为阳 性，如果与阴性对照一样没有扩增曲线，而判定为阴性。
[0125] 实施例2
[0126]本发明检测罂粟的检测方法，包括以下步骤：
[0127 ] A、米用纳米磁珠提取待测样品的DNA;
[0128] 通过以下工艺制作免疫纳米磁珠：
[0129] ①纳米磁珠的制备
[0130] 分别取5.2g FeCl3 · 6H20、2.7g FeS〇4 · 7H20、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于 200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液;在80°C下搅拌，反应 结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙 醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性纳米粒子无水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性纳米粒子 无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min;滴加0.4mL APTES，室温下搅拌 7h;反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3〇4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水 乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe 3〇4纳米磁珠无水乙醇溶液；
[0131] ②免疫磁珠的制备
[0132] 取0.5mL氨基化Fe3〇4纳米磁珠无水乙醇溶液，用lmL PBS清洗3次，磁分离器弃上清 液;加入5 % (V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃 上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3〇4纳米粒子，室温下振荡固定2h;磁分离， 用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存备用，得到免疫磁珠。
[0133] 具体提取方法：
[0134] a、制样:取0. lg的罂粟组织加入lmL抽提缓冲液进行研磨；
[0135] b、清洗纳米磁珠:取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH20反复清洗纳米磁珠3次， 在磁铁的作用下吸去ddH20;
[0136] c、结合:加入100yL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下 吸附；
[0137] d、清洗:在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
[0138] e、裂解:加入50yL ddH20到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95°C，lOmin;
[0139] f取样:用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品DNA。
[0140] B、在冰上，按以下比例取反应液缓冲液、引物、酶溶液、阳性对照、去离子水放入灭 菌管中配制预混液;其中预混液一次反应量合计20yL，其中包括10yL反应缓冲液，1.2yL酶 溶液，3yL引物，3.8yL去离子水。其中3yL引物中包括有0.12yL正向外引物F3，0.12yL反向外 引物B3，1. OyL正向内引物FIP和1. OyL反向内引物B IP;环引物LF0.38yL和LB0.38yL。
[0141] 其中所述的引物包括：
[0142] 正向外引物卩3:5'-〇：1'11^^1'1'1'0^〇6厶6厶丁6厶(：-3'；
[0143] 反向外引物83:5'-厶0^0^〇厶(^0：0：1'(：-3'；
[0144] 正向内引物FIP和反向内引物BIP;
[0145] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0146] 5 '-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3 '；
[0147] 其中FIc: 5 ' -TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3 ' ；
[0148] F2:5，-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3，；
[0149] 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0150] 5'-GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3'；
[0151]
[0152] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[0153] C、将适量待测样品的DNA加入步骤B中的灭菌管中；具体步骤:往分装好的试管中 分别加入制备好的待检测样品的DNA 2yL，使总量达到20yL，阴性对照反应使用去离子水和 虞美人的核酸2yL作为样品，阳性对照使用带有罂粟种子的DNA，然后盖上试管盖轻击混合， 瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；
[0154] D、将步骤C中的试管放置在AB7500荧光定量PCR仪中，在63°C下保持恒温1小时；
[0155] E、结果判定：如果待检样品与阳性对照一样出现典型的S扩增曲线，则判定为阳 性，如果与阴性对照一样没有扩增曲线，而判定为阴性。
【主权项】
1. 一种基于LAMP技术检测磐粟的引物，其特征在于包括： 正向外引物F3:5 ' -TCGATGAAAAATTCCCTGAAC-3 ' ； 反向外引物B3:5 ' -CACGTTTAGGGGTACTGAT-3 ' ； 正向内引物FIP和反向内引物BIP; 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列： 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 其中Flc: 5 '-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ； F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列： 5'-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中Blc: 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3 ' ； B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'〇2. -种基于LAMP技术检测磐粟的试剂盒，其特征在于包括有： 2 X反应液缓冲液 0. 5niL 引物 1加 μL 酶溶液 60 μ L 阳性对照 20 μ L 对照引物溶液 20 μ L 去离子水 1000 μ L 所述的引物包括： 正向外引物F3:5 ' -TCGATGAAAAATTCCCTGAAC-3 ' ； 反向外引物Β3:5 ' -CACGTTTAGGGGTACTGAT-3 ' ； 正向内引物FIP和反向内引物ΒΙΡ; 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列： 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 其中Flc: 5 '-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ； F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列： 5'-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中Blc: 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3 ' ； B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中该试剂盒的产品规格:50次。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的反应液缓冲液2 X由W下组分组 成： Tris-nCl (ρ?Ι8. 8) 4()πιΜ KCI 2：6mM Μ輯(Μ. 巧曲Μ (NIM) 2S01 200mM Twee：n20： 0.2% Betaine. 1.時M dNTPs 2.爱惭M。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DM聚合酶和AMV逆 转录酶混合液。5. 根据权利要求2-4所述的任一种试剂盒，其特征在于在所述2 X反应液缓冲液中含有 巧黄绿素巧光染料。6. -种基于LAMP技术检测磐粟的方法，其特征在于包括W下步骤： A、 采用纳米磁珠提取待测样品的DNA; B、 采用如权利要求5所述的试剂盒，在冰上，按比例取反应液缓冲液、引物、酶溶液、阳 性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液； C、 将适量待测样品的DNA加入步骤B中的灭菌管中； D、 将步骤C中的试管放置在AB7500巧光定量PCR仪中，在63°C下保持恒溫1小时； E、 如果待检样品与阳性对照一样出现典型的S扩增曲线，则判定为阳性，如果与阴性对 照一样没有扩增曲线，而判定为阴性。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤A中采用纳米磁珠提取待测样品DNA的 具体步骤： a、 制样:取0.1 g的植物组织加入山L抽提缓冲液进行研磨； b、 清洗纳米磁珠:取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用dd出0反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁 的作用下吸去dd出0; C、结合：加入10化L的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室溫下吸 附； d、 清洗:在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次； e、 裂解:加入50化d地2〇至化CR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95°C，lOmin; f取样:用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品DNA。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的免疫纳米磁珠通过W下工艺制作： ①纳米磁珠的制备 分别取5.2g化Cl3 · 6出0、2.7g FeS〇4 · 7出0、0.85血12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL 水中，超声脱氧，后将W上溶液滴入250mL、0.75nK)L/L化0田容液;在80°C下揽拌，反应结束 后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清 洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性纳米粒子无水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性纳米粒子无水 乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min;滴加0.4mL APTES，室溫下揽拌化； 反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的化3化磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇 溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化化3化纳米磁珠无水乙醇溶液； ②免疫磁珠的制备 取0.5mL氨基化Fe3〇4纳米磁珠无水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液； 加入5 % (V/V)戊二醒溶液2mL，室溫振荡交联化，磁分离，弃上清液；用PBS洗涂3次并弃上清 液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3〇4纳米粒子，室溫下振荡固定化;磁分离，用 PBS和超纯水分别洗涂3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存备用，得到免疫磁珠。
【文档编号】C12Q1/68GK105969844SQ201610207357
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】陈定虎, 管维, 杨雷亮, 王振华, 杨翠云, 邓丛良
【申请人】陈定虎