一种用于早期诊断克柔念珠菌的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法

一种用于早期诊断克柔念珠菌的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于早期诊断克柔念珠菌的LAMP试剂盒及其专用引物，该引物是针对克柔念珠菌标准菌株的ADE2序列为靶序列设计的，通过有效性、特异性、敏感性实验证实，本发明的引物能用于早期诊断克柔念珠菌感染，而且具有快速、简便、操作性强、结果判读方便的特点，解决了临床上克柔念珠菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题，可制备成试剂盒，在临床上可用来早期诊断克柔念珠菌感染。
【专利说明】
一种用于早期诊断克柔念珠菌的LAMP试剂盒及其专用引物
技术领域
[0001] 本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，是一种用于早期诊断克柔念珠菌的 LAMP试剂盒及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 侵袭性真菌病（Invasive fungal diseases，IFDs)是病原真菌侵犯心、肝、脾、肺、 肾、脑、血液等各系统内脏器官而引起的系统感染性疾病。近二十年来，由于免疫抑制剂、各 种体内置管技术的广泛使用及HIV的持续蔓延，IFDs的发病率及死亡率在全球范围内呈持 续上升的趋势，中国医院感染监测网数据显示IFDs现已成为我国院内感染第2位的中重要 组成(约占24.1% )，在侵袭性真菌病中以念珠菌为主的酵母样真菌占91.4%。近年来，侵袭 性念珠菌病的致病菌菌谱亦发生了较大的变化，白念珠菌感染呈下降趋势，非白念珠菌病 发病率有所上升，占所有念珠菌感染的65 %，其中克柔念珠菌发病率逐年上升，据文献报道 发病率可达10%，由于其天然对氟康唑耐药，但所致的死亡率可高达49 %，高于白念珠菌侵 袭性感染导致的死亡率(约28% )。
[0003] 克柔念珠菌感染尤其是侵袭性感染的预后与能否早期诊断密切相关，因此及时开 发出快速、特异且易于操作的诊断技术方法，是目前临床上所迫切需要解决的重要问题。对 于克柔念珠菌的诊断，国内外临床真菌实验室目前均主要采用科玛嘉酵母显色培养基、 API-20C试剂盒来鉴定克柔念珠菌，其特异性可以较好的满足临床需求，但存在假阴性率较 高、耗时长(培养时间至少>1周）等缺陷，因此临床迫切需要研发早期、特异、灵敏、廉价、操 作简便的克柔念珠菌病的早期诊断技术。
[0004] 目前，以培养、病理检查为代表的病原真菌形态学诊断方法仍然是诊断克柔念珠 菌感染的金标准，但耗时长、阳性率低等局限也严重制约临床诊治水平的提高。近年来，核 酸检测等分子生物学技术方法已经在真菌诊断领域有一定的应用，这些方法较好地克服了 形态学诊断的缺点，操作简单，可重复性，有较高的敏感性和特异性，具有较强的临床应用 价值。
[0005] 目前分子生物学技术方法主要包括基于核酸和蛋白检测两种，其中基于蛋白检测 的为MALDI - T0F，基于核酸的技术主要是针对特异性DNA序列，如基于PCR扩增的技术、分子 杂交以及核酸等温扩增技术。Mette D.Jacobsen等利用ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、NMT1、TRP1 这6个特异性基因位点来对克柔念珠菌进行分型。
[0006] 综上所述，基于DNA序列分析，尝试找出一种可以快速、简便、操作性强、结果判读 方便的快速早期诊断克柔念珠菌感染的技术方法，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便 利，对于解决临床上克柔念珠菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件 要求高等问题具有十分重要的意义。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可早期诊断克柔念珠菌感染的 引物组。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供如上所述引物组的用途。
[0009] 本发明的另一的目的是，提供一种可用于早期诊断克柔念珠菌的试剂盒。
[0010] 本发明的第四个目的是，提供如上所述试剂盒的用途。
[0011] 本发明的第五个目的是，提供一种克柔念珠菌快速检测的方法。
[0012] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] -种可早期诊断克柔念珠菌感染的引物组，，所述的引物组包括外引物F3、外引物 B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：
[0019] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020] 如上所述的引物组在制备早期诊断克柔念珠菌感染的试剂中的用途。
[0021] 如上所述的引物组在制备早期诊断克柔念珠菌感染的试剂盒中的用途。
[0022] 如上所述的引物组制备试剂中的用途，所述试剂用于从白色念珠菌、近平滑念珠 菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、星形假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、杜氏假丝酵母、小红酵母、红 色毛癣菌、烟曲霉菌、新生隐球菌、格特隐球菌、紫色毛癣菌、阿萨希毛孢子菌、胶红酵母、小 红酵母中鉴别出克柔念珠菌。
[0023]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0024] -种可用于早期诊断克柔念珠菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含下列核 苷酸序列：SEQN0.6、SEQN0.7、SEQN0.8、SEQN0.9、SEQN0.10所示的核苷酸序列 [0025]优选地，所述试剂盒包括以下组分：
[0026] (1)引物溶液：由SEQ ID N0.6-10所述的5条引物配置的引物溶液，所述外引物 ADE2-F3、外引物ADE2-B3、内引物ADE2-FIP、内引物ADE2-BIP、环引物ADE2-LB的浓度依次为 5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L;
[0027] (2)链置换 DNA 聚合酶(8,000units/ml)
[0028] (3)dNTPs 溶液（2.5mol/L)
[0029] (4)10X反应缓冲液：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2S〇4，100mM KCl，20mM MgS〇4， l%Triton Χ-100，ρΗ8·8。
[0030] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0031] 如上所述的试剂盒在制备早前诊断克柔念珠菌感染试剂中的应用。
[0032] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
[0033 ] -种克柔念珠菌快速检测的方法，包括以下步骤：
[0034] (1)提取待检测样品DNA;
[0035] (2)以提取的DNA为模板，利用SEQ ID N0.6-10所述的LAMP引物组进行LAMP扩增；
[0036] (3)LAMP扩增反应结束后按照以下任意一种方式观察结果：
[0037] 1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，反应结束后，扩增产物具有绿色荧光，表 明样本中含有克柔念珠菌；
[0038] 2)取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物 呈梯形条带，表明样本中含有克柔念珠菌；
[0039]所述LAMP扩增反应体系所用的引物混合液由SEQ ID N0.6-10所示的5条引物配 置，所述外引物ADE2-F3、外引物ADE2-B3、内引物ADE2-FIP、内引物ADE2-BIP、环引物ADE2-LB 的浓度依次为 5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L。
[0040]本发明优点在于：
[0041 ] 1、本发明针对克柔念珠菌的特异ADE2序列为靶序列，设计出数套引物，通过实验 从中筛选出反应速率最快，扩增效率最高的引物组(SEQ ID N0.6-10)。
[0042] 2、在对引物进行筛选之后，通过对6株克柔念珠菌标准株验证其有效性，同时与其 他常见致病真菌如念珠菌属其他常见致病菌、隐球菌（Cryptococcus )、毛孢子菌 (Trichosporon)、胶红酉孝母（Rhodotorula mucilaginosa)、烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)等分别反应验证扩增的特异性;并且对克柔念珠菌DNA进行稀释， 检测反应的敏感性，获得最低阳性检出率的浓度。
[0043] 3、结果证明本发明的引物能用于克柔念珠菌感染的早期诊断。并且较培养、镜检 等方法更快、更方便，且这种方法可操作性强，结果判读方便，解决了在临床上克柔念珠菌 感染确诊周期长，对实验室及检测人员要求高等问题，可制备成试剂盒，为临床上克柔念珠 菌感染的早期诊断和及时治疗提供便利。
【附图说明】
[0044]附图1为LAMP技术扩增原理图。图1A:FIP引物与模板DAN互补链上的互补区段结合 (即FIP的F2与互补链F2c区段结合），通过链置换DNA聚合酶作用，以FIP引物的3'末端为一 点，与模板DNA链相同序列的一条DNA单链便合成了，F3引物从FIP引物外侧与互补链F3c区 段结合，以F3引物的3'末端为起点，通过链置换DNA酶的作用将刚由FIP引物合成的DNA链剥 离，一边合成新的DNA链，通过碱基配对延伸，形成了与互补链互补的双链，而刚才被F3引物 合成的DNA剥离的单链由于在其5'末端含有互补的F1和Flc区段，通过碱基互补形成环状结 构;BIP引物与形成环状结构的DNA链进行碱基配对，以BIP引物的3 '末端为合成起点，合成 互补DNA链并将循环结构剥离延伸成直线结构，接着B3引物从BIP引物外侧插入进行碱基配 对，以3'末端为起点，一边剥离之前合成的BIP引物DNA链DNA合成;而以BIP引物为模板合成 的单链剥离下后，由于其3'端有互补的Flc和F1区段，5'端有互补的B1和Blc区段，所以整条 链自动弯曲形成哑铃状结构，这就是LAMP反应的起始结构。图1B:为四条引物的结构和其分 别与靶基因 DNA双链结合的位置。其中BIP由B2和Blc组成，B2是和靶序列互补链所对应的位 置完全相同的一段序列，Blc则和靶序列的Blc段完全相同序列；同理，在与靶序列互补链 上，FIP由F2和Flc组成，F2是和靶序列对应的位置完全相同的一段序列，即与互补链互补， 而Flc则和靶序列的Blc段互补，即与该互补链的Blc段完全相同。在此基础上，在哑铃状5' 末端的环状单链部分导入具有互补序列的环引物B Loop Primer，以此增加 DNA合成的起 点，在一定程度上可以缩短反应时间。
[0045] 附图2为根据克柔念珠菌的ADE2序列设计出的两套引物以及阳性和阴性对照样本 扩增曲线图。其中系列1和5为ATCC2159菌株的DNA分别在第一套和第二套引物作用下的反 应结果；系列2和6为ATCC14053菌株的DNA分别在第一套和第二套引物作用下的反应;3和7 为ATCC22019菌株的DNA分别在第一套和第二套引物作用下的反应;4和8则为ddH 20的阴性 对照。
[0046] 附图3为克柔念珠菌及其他菌株的凝胶电泳图。其中：1、ATCC(F)C6d(克柔念珠 菌），2、ATCC 2159(克柔念珠菌），3、SCZ50016(克柔念珠菌），4、SCZ50018(克柔念珠菌），5、 SCZ50019(克柔念珠菌），6、SCZ50020(克柔念珠菌），7、SCZ60037(白念珠菌），8、SCZ50048 (光滑念珠菌），9、SCZ60053(热带念珠菌），10、ATCC22019(近平滑念珠菌），11、SCZ50021 (平 滑假丝酵母），12、ATCC10667(星型假丝酵母），13、SCZ50145(新生隐球菌），14、SCZ60093(红 色毛癣菌），15、CBS319(小红酵母），16、SCZ50113(阿萨希毛孢子菌）。
[0047] 附图4为LAMP反映后各管浊度表现结果。其中：l、ddH20,2、SCZ501453、ATCC22019， 4、SCZ60053，5、SCZ50048，6、SCZ60037，7、ATCC 2159，8、ATCC(F)C6d。
[0048]附图5为不同的克柔念珠菌及其他菌株DNA的可见性实验反应结果。由左至右依次 为：l、ddH20,2、SCZ50145,3、ATCC22019,4、SCZ60053,5、SCZ50048,6、SCZ60037,7、ATCC 2159,8、ATCC(F)C6d;在LAMP反应条件下，63°C，60分钟后，阳性样本表现为荧光绿。
[0049]附图6为不同浓度克柔念珠菌DNA扩增后电泳图。其中：1、20ng，2、2ng，3、200pg，4、 20pg，5、2pg，6、200fg，7、20fg，8、ddH2〇。
[0050]附图7为不同浓度克柔念珠菌DNA扩增速率曲线图。
【具体实施方式】
[0051]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0052]实施例1用于早期诊断克柔念珠菌感染引物的筛选及其特异性和敏感性验证 [0053] 一、主要实验材料及设备 [0054] 1.菌株
[0055] 选择包括6株克柔念珠菌的标准菌株、临床菌株，分别为:ATCC(F)C6d、ATCC 2159、 SCZ50016、SCZ50018、SCZ50019、SCZ50020,以及用于验证LAMP法特异性的其他临床常见菌 株，共20株标准株及20株临床株，所有菌株来至于上海市医学真菌分子生物学重点实验室 菌种库，共计46株。
[0056] 2.设备
[0057] 超净工作台：CA-1390-1垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；生物 安全柜:NUAIRE Biological Safefy Cabinet Class II;隔水式电热恒温培养箱:Heraeus B5060EKC02;纯水机：HITECH water purification system;微量移液枪：0.5 ~10μ1 (EppendorfResearch)，0~200μ1(EppendorfResearch)，ΙΟΟΟμΙ(EppendorfResearch);高 压消毒锅:SANYOAutoCLAVE MLS-3020;Colibri :上海达迈生物科技公司；Loopamp LA-320C 实时池度仪：北京蓝谱生物科技有限公司；高速离心机：Eppendorf centrifuge 5810R， EppendorfNorth America, Inc.;制冰机:Scotsman AF100;恒温水浴箱:上海精密仪器;PCR 仪器:BIORAD ClOOOTouch，美国产；电泳仪:TAN ETS 300,国产;凝胶成像分析系统:FR-980 复生物电泳图像分析系统。
[0058] 3.试剂及培养基
[0059] YPD 培养基：l%Yeast Extract(酵母提取物）：0X0ID，2%Peptone(蛋白胨）： 0X0ID，2%Dextr〇se(葡萄糖）：上海国药集团化学试剂有限公司。
[0060] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA): 20%马铃薯，2%葡萄糖，2%琼脂，100ml水，将马 铃薯洗净，去皮并切成小块，立即投入水中煮沸20分钟，纱布过滤，保留滤液并加入其他成 分，加热使琼脂融化，补足水量，分装，121°C灭菌20分钟，冷却至60 °C左右，每个无菌培养皿 分装15~20ml，凝固后倒置，4°C冰箱保存。
[0061 ] 沙堡弱氏培养基（SDA):l%Peptone(蛋白胨）：(《010,4%〇61杜〇86(葡萄糖）：上海 国药集团化学试剂有限公司，1.5%琼脂粉:上海国药集团化学试剂有限公司。
[0062] 科玛嘉培养基:法国科玛嘉生物科技公司。
[0063] Loopamp DNA amplification kit:日本荣研化学株式会社。
[0064] Loopamp焚光目视检测试剂盒：日本荣研化学株式会社。
[0065] ADE2序列引物：上游引物ADE2F: 5-GTCACTTCTCAGTTTGAAGC-3(SEQ IDN0 · 11);下游 引物ADE2R: 5-ACACCATCTAAAGTAGAGCC-3 (SEQ ID NO. 12)，引物由上海生工合成。
[0066] TIANGEN 2Xpfu PCR MasterMix高保真酶，北京天根生物科技有限公司。
[0067] DNAMarker(Trans2K plus II):上海宝生物工程有限公司（TAKARA)。
[0068] 分析纯氯化苄:生工上海生物科技有限公司。
[0069] 真菌DNA抽提液：lmL 1M Tris .Hcl，4mL 500mM EDTA，加 ddH2〇定容至 10mL。
[0070] AR级3MNaAc，20 % SDS溶液，异丙醇溶液，70 %乙醇溶液。
[0071] 4.其他耗材
[0072] 12CM培养皿:上海卓康生物科技有限公司；微量移液器吸头:上海卓康生物科技有 限公司;EP管（1.5ml、5ml):上海卓康生物科技有限公司;PCR八连管:Bio-Rad公司。
[0073]二、试验方法
[0074] 1.革巴序列的确定及引物设计
[0075] 1.1靶序列为克柔念珠菌标准菌株的ADE2序列
[0076] 来自于Jacob sen，M · D · Gow · N. A.Maiden，M · C · Shaw，D · J · Odds，F · C ·等所著论文 "train typing and determination ofpopulation structure ofCandida krusei by multilocus sequence typing."JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Feb.2007,p.317-3230095-1137/07/$08·OOOdoi:10·1128/JCM.01549-06·
[0077] 1.2引物设计
[0078] 设计出多条ADE2对应的LAMP反应引物，通过敏感性及特异性比较，筛选出2套具有 代表性的引物，序列如下所示。
[0079] 第一套引物序列如下：

[0091] 上述引物与靶序列结合并成环的结构位点如图1(A、B)所示。
[0092] 1.3引物筛选
[0093]将上述涉及的两套引物分别于模板DNA按照LAMP反应体系加样，置于Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应，预设反应温度为63°C，反应时间为60min。LAMP反应体系如下:总体 积25yL，包括lyL FIP(40ymol/L)、lyL BIP(40ymol/L)、lyL F3(5ymol/L)、lyL B3(5ymol/ L)、lyL环引物（5ymol/L)、12.5yL2XReaction Mix、lyL Bst DNAPolymerase、5.5yL ddH20、lyL DNA。反应结束后观察两套引物的反应扩增曲线，并对所选引物进行敏感性和特 异性的验证。
[0094] 2待验证菌株全基因组DNA抽提
[0095] 2.1菌株的复苏与培养
[0096] (1)各标准株的复苏与培养:取出-80°C保藏的隐球菌标准株及临床株，置于20°C 下复苏24小时，使其恢复繁殖活力。在无菌条件下，分别将ATCC(F)C6d、ATCC 2159等6株克 柔念珠菌标准株及所选定的其他标准菌株及临床菌株转种到沙堡氏培养基(SDA)斜面培养 基，30 °C孵育培养48-72小时。
[0097] (2)临床分离株的培养和鉴定:临床标本来源菌株均来自于长征医院真菌检验室， 经过SDA培养基或PDA培养基培养，念珠菌属转至科玛嘉培养基培养，通过培养观察培养基 变色情况初步判断为热带念珠菌、近平滑念珠菌;丝状真菌通过镜检及培养等表型检测初 步判断，所有隐球菌通过墨汁染色初步判断并转至咖啡酸培养基培养。
[0098] 2.2氯化苄法抽提各标准菌株及部分临床隐球菌全基因组DNA
[0099] (1)EP管中加入500yL真菌DNA抽提液，从SDA培养基中挑取火柴头大小体积菌落， 后剧烈震荡lmin;
[0100] (2)在EP管中加入50yL 20%SDS和300yL氯化苄溶液，剧烈震荡，至溶液呈乳状，将 EP管置于50°C水浴一小时，每十分钟震荡混合一次；
[0101] (3)水浴结束，加入300yL 3M NaAc(醋酸钠)冰水浴15分钟；
[0102] (4)将冰水浴后的EP管置于高速离心机中，选择6000rpm转速，15min后，小心吸出 上清并转移至干净EP管中；
[0103] (5)在已转移出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，室温下沉淀20min，再次离心， 转速为 lOOOOrpm，15min;
[0104] ( 6 )取出EP管，小心弃上清，并在沉淀中加入等体积预冷的7 0 %乙醇，再次 lOOOOrpm，lOmin离心；
[0105] (7)离心结束后，弃上清，小心将沉淀置于室温下风干，并50yL TE溶解。将上述DNA 置于-20°C冰箱冷藏保存。
[0106] 2.3分光分度计检测各菌株基因组DNA及其浓度利用Eppendorf Biophotometer分 光分度计，按操作手册操作检测基因组DNA的浓度。
[0107] 3特异性实验
[0108] 3.1LAMP 反应
[0109]将筛选出的两套引物分别与上述步骤已准备好的两株克柔念珠菌标准菌株(ATCC (F)C6d和ATCC2159)的DNA、一株白念珠菌临床菌株(SCZ60037)DNA及双蒸水按照LAMP体系， 63°C，60min进行反应，观察分别的扩增反应情况。其中克柔念珠菌为阳性对照，白念珠菌和 双蒸水为阴性对照。
[0110] LAMP反应体系如下：总体积25yL，包括lyL FIP(40ymol/L)、lyL BIP(40ymol/L)、l yL F3(5ymol/L)、lyL B3(5ymol/L)、lyLLB(5ymol/L)、12.5yL2XReaction Mix、lyL Bst DNAPolymerase、5.5yL ddH2〇、lyL DNA〇
[0111] 3.2LAMP凝胶电泳检查
[0112] (1)用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12X6厘米的1.5%琼脂糖凝胶:在烧杯中 加入1.5g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中， 避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；
[0113] (2)在装有 1 XTAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的电泳槽 内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；
[0114] (3)每个PCR反应体系中抽取10yL，分别与5yL Ladder Buffer充分混合后上样于 1.5 %的琼脂凝胶；
[0115] (4)120 伏电压电泳 30min;
[0116] (5)将琼脂凝胶浸入EB溶液15min;
[0117] (6)小心取出后浸入双蒸水中lOmin;
[0118] (7)取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照。
[0119] 3.3LAMP可见性实验
[0120] 重复上述特异性实验，在LAMP管中依次加入F3、B3、FIP、BIP、LB引物，缓冲液，链置 换DNA聚合酶等，依次加入两株克柔念珠菌标准菌株以及其他种属的标准株或临床标本中 分离出的菌株，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入lyL钙黄绿素以指示实验 结果。63 °C，60min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。
[0121] 4敏感性试验
[0122] 4.1扩增曲线
[0123] 将克柔念珠菌ATCC2159全基因组DNA浓度分别十倍梯级稀释数次，使DNA含量分别 为20ng、2ng、0 · 2ng、0.02ng、2pg、0 · 2pg、0 · 02pg、2fg、0 · 2fg、0.02fg、0.002fg。将上述不同 浓度梯度的DNA分别按照LAMP体系，63°C，60min反应，结束后观察扩增情况。最后一管设立 不含DNA组为阴性对照。
[0124] 4.2LAMP可见性实验
[0125] LAMP可见性重复上述步骤，在配好各组LAMP反应体系后，在LAMP管中依次加入lyL 钙黄绿素以指示实验结果。63°C，60min反应结束后，取出反应管观察各组颜色变化。
[0126] 4.3LAMP产物进行凝胶电泳检查
[0127] (1)用HE120电泳仪提供的灌胶模具灌制12X6厘米的1.5%琼脂糖凝胶:在烧杯中 加入1.5g琼脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混匀，加热煮沸，立即将胶液加入灌胶板中， 避免产生大量气泡，室温放置至凝胶凝固；
[0128] (2)在装有 1 XTAE缓冲液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的电泳槽 内，小心平放入琼脂凝胶，使其浸没；
[0129] (3)每个PCR反应体系中抽取10yL，分别与5yL Ladder Buffer充分混合后上样于 1.5 %的琼脂凝胶；
[0130] (4)120 伏电压电泳 30min;
[0131] (5)将琼脂凝胶浸入EB溶液15min;
[0132] (6)小心取出后浸入双蒸水中lOmin;
[0133] (7)取出琼脂凝胶经FR-980复日生物电泳图像分析系统拍照。
[0134] 三、实验结果
[0135] 1引物验证及筛选
[0136] 两套引物和阳性对照、阴性对照样本扩增曲线如图2所示。结果表明：⑴根据ADE2 序列设计出的两套引物均可以引起扩增反应，其中ADE2-1套引物引起扩增反应时间起始较 晚，（2)根据ADE2设计出的两套引物中的第一套出现了非特异性扩增。
[0137] 2特异性实验
[0138] 2.1将筛选出的第二套引物分别与各标准株及临床株的DNA按照LAMP反应体系进 行反应，分别观察扩增反应情况。具体反应结果如表1和表2所示。
[0139] 表1LAMP实验用标准株及其LAMP反应结果
[0141] 注:P表示阳性反应，N表示阴性反应。
[0142] 表2LAMP实验用临床株及其LAMP反应结果
[0143]

[0145] 注:SCZ表示来源于长征医院皮肤科门诊患者或其他科室送至我科真菌检查室标 本。
[0146] 2.2针对所选定的特异性引物，6株克柔念珠菌标准菌株及部分其他标准或临床菌 株LAMP反应后凝胶电泳图3所示。
[0147] 由上述结果可知:第二套引物在LAMP反应体系具有良好的特异性，除了克柔念珠 菌外，其他菌株包括SCZ60037(白念珠菌）、SCZ50048(光滑念珠菌）、SCZ60053(热带念珠 菌）、ATCC22019(近平滑念珠菌）、SCZ50021(平滑假丝酵母）、ATCC10667(星型假丝酵母）、 SCZ50145(新生隐球菌）、SCZ60093(红色毛癣菌）、CBS319(小红酵母）、SCZ50113(阿萨希毛 孢子菌)均未出现扩增反应，说明该引物对克柔念珠菌具有较好的特异性。
[0148] 2.3可见性试验
[0149] (1)针对第二套引物，LAMP反应后各管的浊度如图4所示。可根据扩增反应结束后 LAMP管浊度的变化判断是否发生的扩增，如果反应管浑浊则表示该管内含有目的基因，发 生了扩增反应;反之，如果反应管清亮，则表示该管内不含有目的基因，未发生扩增反应。
[0150] (2)针对第二套引物，在反应过程中加入荧光染料，反应结束后各管反应如图5所 不。
[0151] 3敏感性试验
[0152] 3.1扩增曲线
[0153] 针对选定的第二套引物，使用不同浓度的ATCC2159DNA与引物反应后扩增曲线如 图 6 所示，编号 1 -8 分别表示的 DNA 浓度为：20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200f g、20f g、ddH2〇。 由图6的扩增曲线可以看出，基于克柔念珠菌标准菌株的ADE2序列的LAMP敏感性可达到 200pg。附图7为不同浓度克柔念珠菌DNA扩增速率曲线图。
[0154] 实施例2用于早期诊断克柔念珠菌的试剂盒
[0155] 试剂盒中包含有下列试剂盒材料：
[0156] 1、引物溶液:ADE2-F3(SEQ ID N0.6,5ymol/L)、ADE2-B3(SEQ ID N0.7,5ymol/L)、 ADE2-BIP(SEQ ID N0.9,40ymol/L)、ADE2-FIP(SEQ ID N0.8,40ymol/L)、ADE2-LB(SEQ ID NO.10,5ymol/L)〇
[0157] 2、dTNPs(2.5mol/L)。
[0158] 3、链置换DNA聚合酶(8，OOOunits/ml)。
[0159] 4、10\反应缓冲液，组成包括:200111]\11^8-!1(：1，1001111(順4)2304，10011111((：1，20111]\1 MgS〇4，l%Triton Χ-100，ρΗ8·8〇
[0160] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种可早期诊断克柔念珠菌感染的引物组，其特征在于，所述的引物组包括外引物 F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示： 外引物ADE2-F3: AGACATAGAACCCGAAACA(SEQ ID NO · 6); 外引物ADE2-B3:TTGCTTTTCTACTCCCCAA(SEQ ID N0.7); 内引物ADE2-FIP: CAAGCGCTTCTGTCTATCTTTACGGGTTAACATGACCCATTTTTCTCT( SEQ ID NO.8)； 内引物ADE2-BIP : TGCTCTTCTACAAAGTTCAAGTTCGACAAATGCCATTATGCTCAA( SEQ ID NO.9)； 环引物ADE2-LB: CCATTTGGCACATCAGACCC(SEQ ID NO · 10)。2. 权利要求1所述的引物组在制备早期诊断克柔念珠菌感染的试剂中的用途。3. 权利要求1所述的引物组在制备早期诊断克柔念珠菌感染的试剂盒中的用途。4. 权利要求1所述的引物对在制备试剂中的用途，其特征在于，所述试剂用于从白色念 珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、星形假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、杜氏假丝 酵母、小红酵母、红色毛癣菌、烟曲霉菌、新生隐球菌、格特隐球菌、紫色毛癣菌、阿萨希毛孢 子菌、胶红酵母、小红酵母中鉴别出克柔念珠菌。5. -种可用于早期诊断克柔念珠菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含下列核苷 酸序列：SEQ NO.6、SEQ NO. 7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO. 10所示的核苷酸序列。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分： (1) 引物溶液：由权利要求1所述的5条引物配置的引物溶液，外引物ADE2-F3、外引物 ADE2-B3、内引物ADE2-FIP、内引物ADE2-BIP、环引物ADE2-LB的浓度依次为5ymol/L、5ymol/ L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L; (2) 链置换DNA聚合酶(8，OOOunits/ml); (3) dNTPs 溶液（2.5mol/L); (4) 10X 反应缓冲液：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2S〇4，100mM KCl，20mM MgS〇4，l% Triton X-100?pH8.8〇7. 权利要求5或6所述的试剂盒在制备早期诊断克柔念珠菌感染试剂中的应用。8. -种克柔念珠菌快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待检测样品DNA; (2) 以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组进行LAMP扩增； (3) LAMP扩增反应结束后按照以下任意一种方式观察结果： 1) 向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，反应结束后，扩增产物具有绿色荧光，表明样 本中含有克柔念珠菌； 2) 取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯 形条带，表明样本中含有克柔念珠菌； 所述LAMP扩增反应体系所用的引物混合液由权利要求1所述的5条引物配置，所述外引 物ADE2-F3、外引物ADE2-B3、内引物ADE2-FIP、内引物ADE2-BIP、环引物ADE2-LB的浓度依次 为5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L〇
【文档编号】C12N15/11GK105950740SQ201610369663
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】陈敏, 刘加, 方文捷, 洪南, 潘炜华, 廖万清
【申请人】中国人民解放军第二军医大学