与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明提供与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记，所述绿豆抗豆象基因VrPGIP位于绿豆第5号染色体第5.558Mb和5.625Mb区域内，与基因VrPGIP共分离的分子标记包括SSR标记Vr05?5590和Vr05?5597，它们与绿豆抗豆象基因VrPGIP的物理距离分别为1.5kb和850bp。本发明还提供所述分子标记在绿豆抗豆象基因定位或绿豆遗传育种中的应用。本发明通过精细定位绿豆抗豆象基因VrPGIP，发现了两个与绿豆抗豆象基因共分离的SSR标记，该分子标记的开发为绿豆抗豆象分子辅助育种提供了一条可行途径。
【专利说明】
与绿豆抗豆象基因 VrPG IP共分离的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程、分子生物学及遗传育种技术领域，具体地说，涉及与绿豆抗 豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 绿豆(Vigna radiata)是一种豆科、蝶形花亚科5工豆属植物，中国是绿豆的发源地 之一，拥有类型繁多的绿豆品种资源。中国、緬甸等国是主要的绿豆出口国。由于其生育期 短、适应性广，且具有较好的固氮能力，因此是种植业资源合理配置、倒茬轮作、间作套种、 减灾救灾不可缺少的粮食作物及重要的经济作物；同时绿豆富含蛋白质、维生素、多种矿物 质及人体必需的氨基酸，还具有清热解毒、降血压和胆固醇、防止动脉粥样硬化等功效，具 有较高的营养保健和经济价值，在国际市场上备受青睐。近年来，国际市场对绿豆的需求量 和全世界绿豆的生产量均有所增加，目前中国的绿豆年出口量在20-30万吨，出口价格一般 400-500美元。绿豆的社会经济价值不容忽视。然而，豆象是危害绿豆最严重的仓储害虫，豆 象分布范围广，在任何种植和储藏食用豆的地方都可发生绿豆象危害。在一个生活周期内， 因绿豆象危害一般损失产量30%-56%，可导致整仓绿豆被破坏。在我国，绿豆象每年可繁 殖4-11代，除危害绿豆外，还可危害小豆、豇豆、豌豆、蚕豆、菜豆、扁豆等。国内外对绿豆豆 象的研究还相当滞后，分子水平的研究更显薄弱。
[0003] 从20世纪80年代开始，日本、泰国、澳大利亚等国家的食用豆类遗传育种学家致力 于抗豆象的研究。目前为止，报道的高抗豆象绿豆资源主要有马达加斯加野生种TC1966和 澳大利亚野生种ACC41，经验证TC1966和ACC41抗豆象表型均为Brl基因控制。Kaga等（1998) 用RFLP标记Bngl43和Bngl 10将Br 1基因定位于第9连锁群。程须珍等（2005)筛选出一个与 Brl基因紧密连锁的RAH)标记。梅丽等(2007)将Brl基因定位于RFLP标记mgM213~VrCS161 之间，还发现Brl基因与一个控制种子重量的QTLXhen等(2013)证明Brl基因与控制绿豆黄 花叶印度病毒(MYMIV)的主效QTL连锁。孙蕾等（2008)利用抗豆象栽培绿豆V2709与感豆象 推广品种中绿1号(VC1973A)配制F2杂交组合，利用抗、感亲本和抗、感池筛选63个RAPD引物 和113对SSR/STS引物。将该抗豆象基因初步定位在一个RAH)标记和一个STS标记之间，遗传 距离分别为11 .OcM和5.8cM。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供与绿豆抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记。
[0005] 本发明的另一目的是提供所述分子标记在绿豆抗豆象基因定位或绿豆遗传育种 中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的与绿豆抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标 记，所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb区域内，与基因 VrPGIP共分离的分子标记包括SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597，它们与绿豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距离分别为1.5kb和850bp;上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A。
[0007] 用于PCR扩增标记Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID N0:1和2。
[0008] 用于PCR扩增标记Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO: 3和4。
[0009] 绿豆抗豆象基因 VrPGIP为：
[0010] i)SEQIDN0:9所示的核苷酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0012] iii)在严格条件下与SEQ ID N0:9所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0013] iv)与i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0014] 利用SEQ ID N0:1和2在抗豆象绿豆品种TC1966、VC6089A、中绿3号、中绿6号、中绿 7号和苏绿2号中可扩增出大小为145bp的特征条带，扩增产物的测序结果如SEQ ID N0:5所 示，在绿豆感豆象品种中绿1号、中绿5号和中绿10号中可扩增出大小为108bp的特征条带， 扩增产物的测序结果如SEQ ID N0:6所示;利用SEQ ID N0:3和4在抗豆象绿豆品种TC1966、 VC6089A、中绿3号、中绿6号、中绿7号和苏绿2号中可扩增出大小为241bp的特征条带，扩增 产物的测序结果如SEQ ID N0:7所示，在绿豆感豆象品种中绿1号、中绿5号和中绿10号中可 扩增出大小为246bp的特征条带，其中，扩增产物的测序结果如SEQ ID N0:8所示。
[0015] 本发明还提供所述分子标记在鉴定绿豆抗豆象基因 VrPGIP中的应用。
[0016] 本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定绿豆抗豆象资源和品种中的应用。
[0017] 包括如下步骤：
[0018] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0019] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行PCR扩增 反应；
[0020] 3)检测PCR扩增产物。如用引物SEQ ID N0:1和2能够扩增出145bp大小的目的片段 (SEQIDN0:5)，和/或用引物SEQIDN0 :3和4能够扩增出241bp大小的目的片段（SEQID N0:7)，则标志着该绿豆品种抗豆象基因 VrPGIP的存在。
[0021] 优选地，步骤3)中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染法EB染 色。
[0022] 本发明还提供所述分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。
[0023] 本发明还提供用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的特异性PCR引物，包括扩增所述 分子标记Vr05-5590的引物（SEQ ID N0:1和2)，和/或扩增分子标记Vr05-5597的引物（SEQ ID N0:3和4)。
[0024] 本发明还提供用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包 含上述引物。
[0025]本发明还提供所述分子标记在开发与绿豆抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记 中的应用。
[0026]本发明进一步提供利用所述分子标记开发的与绿豆抗豆象基因 VrPGIP共分离的 分子标记。
[0027] 本发明通过精细定位绿豆抗豆象基因 VrPGIP，发现了与绿豆抗豆象基因共分离的 SSR分子标记Vr05_5590和Vr05_5597，所述分子标记的开发为绿抗S象分子辅助育种提 供了一条可行途径。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于绿豆育种实践和资 源及品种鉴定。本方法方便、快捷、准确且成本低廉，为绿豆抗豆象分子标记的筛选提供了 新思路。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例3中利用F2群体定位绿豆抗豆象基因 VrPGIP的遗传图谱。
[0029] 图2为本发明实施例4中与抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记Vr05-5590在抗豆 象品种中绿3号、中绿6号、中绿7号、V2802、V2709、V1128和抗豆象野生种TC1966中的PAGE电 泳检测结果。
[0030] 图3为本发明实施例4中与抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记Vr05-5597在抗豆 象品种中绿3号、中绿6号、中绿7号、V2802、V2709、V1128和抗豆象野生种TC1966中的PAGE电 泳检测结果。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0032] 实施例1TC1966/中绿1号F1和F2群体构建及表型鉴定
[0033] 以抗豆象绿豆野生资源TC1966为父本，以感豆象绿豆品种中绿1号为母本，配制杂 种，构建了包含150个单株的TC1966/中绿1号分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的 TC1966/中绿1号F2:3家系，进行抗虫鉴定。具体方法如下：
[0034] 每份材料随机选取30粒健康种子，包括2份感豆象中绿1号、抗豆象TC1966对照，置 于抗豆象鉴定室塑料箱内，温度保持在25°C-29°C之间，湿度控制在70%-80 %之间。每个塑 料箱内放入400-500头刚羽化1-3天的绿豆象成虫，让其随机产卵，当每粒种子落卵量在5个 以上时，除去成虫。40-45天后调查抗虫种子粒数及抗虫率，参照程须珍等（2001)的方法对 每个单株进行抗性评价。达到中抗以上材料进行重复鉴定，设3次重复。抗豆象鉴定分级标 准见表1。
[0035] 表1绿豆抗豆象特性分级标准
[0037] 抗豆象鉴定结果显示，TC1966、中绿1号以及TC1966/中绿1号杂交获得的F1种子全 抗，表明TC1966抗豆象特性由显性基因控制。150个TC1966/中绿1号F2:3家系对豆象的抗性 级别频率分布呈连续分布，根据对豆象的抗虫级别将F2:3家系分为抗豆象、抗感分离和感 豆象三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫）、Rr(杂合抗虫）和 rr (纯合感虫)三种。F2群体对豆象的抗感分离比符合1: 2:1的比例，说明抗豆象基因由显性 基因 VrPGIP控制。
[0038] 实施例2与绿豆抗豆象基因 VrPGIP连锁的SSR分子标记的开发 [0039] 绿豆抗豆象基因 VrPGIP的获得:利用抗豆象亲本TC1966与感豆象亲本中绿1号杂 交的F2分离群体和抗、感池筛选出多态性SSR标记。将该抗豆象基因初步定位于绿豆第5号 染色体上。根据NCBI已公布的绿豆基因组序列（GenBank登录号：JJM000000000)，用软件 Primer3.0进行引物设计，在绿豆第5号染色体共产生3143对SSR引物。提取绿豆叶片DNA，进 行引物成功率检测，结果表明，共有1254对SSR引物在100-300bp检测到清晰条带，表明引物 设计成功率较高。
[0040] 实施例3绿豆抗豆象基因 VrPGIP的精细定位
[00411用改良CTAB法提取亲本和F2群体各株系的DNA，经紫外分光光度计测定浓度后稀 释标定到25ngAxL，置于-20°C冰箱备用。
[0042] 参照Chen等(2015)的方法，以绿豆基因组DNA为模板，进行PCR反应。10μ1 PCR反应 体系包括:40ng DNA，lXTaq酶缓冲液（lOmmol L-^Tris-HClpHS.SdOmmol L-kCMOmmol L-HN^hSOul.Smmol L-WgChJ.l^Triton X-100)，lmmol L-MNTPs，上、下游引物各 0.25μπιο1 L-1和1U Taq DNA聚合酶，ddH20补至10μ1。反应程序:95°C预变性5min;95°C变性 30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，32~35个循环；最后72°C延伸5min。整个反应在东胜EDC-810PCR扩增仪上进行。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染法染色。扩增 的D N A条带在荧光灯箱内观察，获取F 2群体基因型信息。根据连锁交换规律，利用 MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型信息构建绿豆的遗传连锁图谱。共获 得13个SSR标记，图谱长度为63cM(图1)。
[0043] 进一步通过精细定位，将抗豆象基因定位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb 区域内，SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597之间，它们与绿豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距离分 别为1.5kb和850bp(上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A)，通过测序发现此区间仅包 括一个基因（基因 PGIP)编码多聚半乳糖醛酸酶抑制剂，基因 PGIP的DNA序列如SEQ ID N0:9 所示，在抗、感虫材料中存在碱基变异，并引起其编码蛋白的氨基酸序列变化，从而为绿豆 资源抗豆象的分子育种提供新的基因资源。
[0044] 扩增各分子标记的引物如下：用于PCR扩增标记Vr05-5590的正向引物和反向引物 序列分别为SEQ ID N0:1和2;用于PCR扩增标记Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分别 为SEQIDN0:3和4。
[0045] 实施例4标记Vr05-5590和Vr05-5597在鉴定绿豆抗豆象资源中的应用 [0046] 用引物SEQ ID N0:1和2能够扩增出145bp大小的目的片段（SEQ ID N0:5)，和/或 用引物SEQ ID N0:3和4能够扩增出246bp大小的目的片段(SEQ ID N0:6)，则标志着该绿豆 品种抗豆象基因 VrPGIP的存在。其中，PCR反应体系和反应程序同实施例3所述。采用8%非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染法染色。
[0047] 利用上述两个标记Vr05-5590和Vr05-5597对我国主要绿豆推广品种如中绿1号、 中绿3号、中绿5号、中绿6号、中绿7号、中绿10号，国外绿豆品种如VC6089A、V1128、V2802和 V2709,国外绿豆野生种TC1966进行抗豆象基因鉴定，结果表明这2个标记的鉴定效率均达 到99.5%以上。
[0048] 通过上述分子标记鉴定绿豆抗豆象基因 VrPGIP来预测绿豆植株抗虫性，可提高我 国绿豆抗豆象品种的育种进程。
[0049] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0050] 参考文献
[0051] 1.程须珍，王素华，吴绍宇，等.绿豆抗豆象基因 PCR标记的构建与应用.中国农业 科学，2005,38(8) :1534-1539
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[0053] 3.Mei L,Cheng X Z,ffang S H,et al. Relationship between bruchid resistance and seed mass in mungbean based on QTL analysis.Genome.2009,52(7): 589-596
[0054] 4.Chen H M,Ku Η M,Schafleitner R,et al.The major quantitative trait locus for mungbean yellow mosaic Indian virus resistance is tightly linked in repulsion phase to the major bruchid resistance locus in a cross between mungbean[Vigna radiata(L.)ffilczek]and its wild relative Vigna radiata ssp sublobata.Euphytica,2013,192(2):205-216
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【主权项】
1. 与绿豆抗豆象基因 VrPGIP共分离的分子标记，其特征在于，所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb区域内，与基因 VrPGIP共分离的分子标记 包括SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597,它们与绿豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距离分别为 1.5kb和850bp;上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A; 用于PCR扩增标记Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO: 1和2; 用于PCR扩增标记Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID N0:3和4; 其中，绿豆抗豆象基因 VrPGIP为： i) SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID N0:9所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，利用SEQ ID NO: 1和2在抗豆象绿豆品 种TC1966、VC6089A、中绿3号、中绿6号、中绿7号和苏绿2号中可扩增出大小为145bp的特征 条带，在绿豆感豆象品种中绿1号、中绿5号和中绿10号中可扩增出大小为IOSbp的特征条 带；利用SEQ ID NO:3和4在抗豆象绿豆品种TC1966、VC6089A、中绿3号、中绿6号、中绿7号和 苏绿2号中可扩增出大小为241bp的特征条带，在绿豆感豆象品种中绿1号、中绿5号和中绿 10号中可扩增出大小为246bp的特征条带。3. 权利要求1或2所述分子标记在鉴定绿豆抗豆象基因 VrPGIP中的应用；其中，绿豆抗 豆象基因 VrPGIP的定义同权利要求1所述。4. 权利要求1或2所述分子标记在筛选或鉴定绿豆抗豆象资源中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取待测植株的基因组DNA; 2) 以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，进行 PCR扩增反应； 3) 检测PCR扩增产物； 其中，SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离扩增产物，银染法染色。7. 权利要求1或2所述分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。8. 用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的特异性PCR引物，其特征在于，包括扩增权利要求 1或2所述分子标记的引物;其中，SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序 列同权利要求1所述。9. 用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权 利要求8所述引物。10. 根据权利要求1或2所述分子标记开发的与绿豆抗豆象基因共分离的分子标记；其 中，绿豆抗豆象基因 VrPGIP的定义同权利要求1所述。
【文档编号】C12Q1/68GK105950736SQ201610362607
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】陈红霖, 程须珍, 王丽侠, 王素华
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所